Desacetilação Ensaios para desvendar a interação entre Sirtuins (SIRT2) e Proteína-substratos específicos

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Ensaio In Vitro A desacetilação

  1. A purificação do SIRT2
    1. Prepara-se uma placa de cultura de 10 cm de células HEK 293T cultivadas em 8 ml de DMEM com FBS 10% e antibióticos e cultivadas em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultura de tecido a ser cerca de 70% confluentes no dia seguinte.
    2. No dia seguinte, co-transfecção de 4 ug pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector feita em nosso laboratório), 4 ug pCMV- dR8.2 dvpr (vector de embalagem) e 0,5 ug de pCMV-VSV-G (envelope vector) 18 utilizando polietilenimina (PEI), a uma proporção de 3 ul de PEI / ug do ADN.
    3. Alterar mídia após 12 hr.
    4. Recolher o sobrenadante após 36-48 h.
    5. Remover os detritos por centrifugação a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
    6. Após filtração através de filtros de 0,22 um, fazer alíquotas de 1 ml SIRT2 lentivírus e manter a -80 ° C.
    7. lentivírus SIRT2 Descongelar em gelo (que é importante para armazenar o vírus a -80 ° C, quando o vírus não é usada).
    8. Infect uma placa de 6 poços de células 293T HEK confluentes a 80-90% com 1 ml de lentivírus, na presença de 8 ug / ml de polibreno.
    9. Colocar as células infectadas com vírus em 37 ° C incubadora até ao dia seguinte (24 horas).
    10. Substituir médio após 24 horas.
    11. 48 h após a infecção, a infecção por verificar a eficiência de detecção de GFP positivas células sob um microscópio fluorescente.
    12. Se a eficiência infecção é boa (pelo menos 40-50% de células infectadas), substitua meio com meio de cultura contendo 2 mg / ml de puromicina para selecionar para SIRT2 estável ao longo células que expressam.
      Nota: Isto leva aproximadamente duas semanas, e o meio é mudado a cada 3-4 dias. As células não-infectadas morrem durante este período de seleção e apenas as células infectadas com o lentivírus SIRT2 crescer.
    13. Analisar a expressão de SIRT2 marcada com Flag por western blotting utilizando um anticorpo anti-Flag (diluição 1: 1000) após a execução de 40 ^ g de proteína total num gel de SDS-PAGE a 10% antes de iniciar o Purifprocesso icação (recomendado) 19,20.
    14. Para purificar SIRT2 activo, separar células em proporção 1: 3 por tripsinização, a fim de ter suficiente pratos de células HEK 293T sobre-expressando estavelmente Bandeira-SIRT2 (dez placas de 10 cm irá permitir a purificação de proteína suficiente para experiências subsequentes).
      1. Para trypsinize as células, remover e eliminar o meio de cultura soro residual por lavagem as células com DPBS estéril. Lentamente adicionar 2,5 mL de uma solução de tripsina-EDTA a 0,25%, para cobrir a monocamada de células, incuba-se a temperatura ambiente durante 30-45 seg. Depois de remover a solução de tripsina-EDTA, incubam a 37 ° C até as células começarem a destacar. Em seguida, adicionar meio de cultura de células e transferir-se a novas pratos.
    15. Remover o meio de cultura, lavar as células duas vezes em PBS e recolher as células por tripsinização, seguido por centrifugação a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    16. Lyse sedimento celular em 500 ul de tampão de lise A (HEPES 20 mM pH 7,9, KCl 18 mM, EGTA 0,2 mM, 1,5 mM de MgCl2, 20% de glicerol, 0,1% de NP-40) incluindo um cocktail de inibidores de protease e 1 uM de TSA durante 30 min a 4 ° C sob rotação constante.
    17. Centrifuga-se a 14000 xg durante 15 min a 4 ° C e a transferência de sobrenadante para um novo tubo.
    18. Realizar imunoprecipitação utilizando um anticorpo anti-Flag conjugado com esferas de agarose tal como descrito abaixo.
      1. Adicionar 200-300 ul de anticorpo anti-Flag conjugado com esferas de agarose para o lisado de proteína (10-20 mg de proteína total).
      2. Incubar durante a noite a 4 ° C com agitação constante.
      3. Recolhe imunoprecipitados por centrifugação a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
      4. Lava-se a pelete 5 vezes com 10 ml de tampão de lise A a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. Depois de cada lavagem, sedimentar as pérolas e substituir o sobrenadante com tampão A.
    19. Preparar a solução de péptido Flag 1x (incluindo um cocktail de inibidores de protease e 1 uM em PBS TSA).
    20. Adicionar 500 mL de bandeira 1x peptídeoe solução para as pérolas de agarose e incubar durante 30 min a 4 ° C sob rotação constante.
    21. Recolher o sobrenadante por centrifugação a 6000 xg durante 2 min a 4 ° C.
    22. Repita duas etapas anteriores.
    23. Remover grânulos a partir do sobrenadante, utilizando tubos de filtragem e centrifugação a 15.000 xg durante 1 min a 4 ° C.
    24. Concentrar amostra eluida até que a concentração final de proteína é de 1 mg / mL utilizando uma membrana de ultrafiltração.
    25. Verificar processo de purificação por electroforese usando 1 ug de palco da amostra eluida.
    26. gel mancha com uma solução de coloração disponíveis comercialmente para confirmar a purificação SIRT2.
    27. Manter SIRT2 purificada a -80 ° C.
  2. Purificação de Proteína-acetilado substrato
    1. Preparar 10 cm x 10 cm placas de cultura com células HEK 293T para ser cerca de 70% confluentes no dia seguinte.
    2. As células no dia seguinte, co-transfectar com 5 ug de um vector de plasmídeo com etiquetas Flag expressing a proteína de substrato, bem como 5 ug do acetil-transferase específica que pode acetilar a proteína utilizando PEI numa proporção de 3 ul de PEI / ug do ADN.
      Nota: Se o acetil-transferase específica não é conhecida, co-transfecção com uma mistura de histonas conhecido acetil-transferases (chapéus), tais como p300, CBP, GCN5, Tip60 e PCAF.
    3. Alterar meio depois das 12 horas.
    4. O dia antes da lise das células, tratar as células com um TSA iM e 2 mM de nicotinamida (NAM) durante a noite através da substituição do meio de cultura com meio contendo TSA / NAM para maximizar os níveis de acetilação da proteína de substrato por inibição desacetilases.
    5. 48 h após a transfecção, remover o meio de cultura, lavar as células duas vezes em PBS e recolher as células por tripsinização, seguido por centrifugação a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    6. Lyse sedimento celular em 500 ul de tampão de lise A por prato (20 mM de HEPES pH 7,9, KCl 18 mM, EGTA 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM, 20% de glicerol, 0,1% de NP-40) incluindo uma protease inhibitors cocktail, 1 uM de TSA e NAM 2 mM durante 30 min a 4 ° C sob rotação constante.
    7. Centrifuga-se a 14000 xg durante 15 min a 4 ° C e a transferência de sobrenadante para um novo tubo.
    8. Realizar imunoprecipitação utilizando um anticorpo anti-Flag conjugado com esferas de agarose tal como descrito abaixo.
      1. Adicionar 200-300 ul de anticorpo anti-Flag conjugado com esferas de agarose para o lisado de proteína (10-20 mg de proteína total).
      2. Incubar durante a noite a 4 ° C com agitação constante.
      3. Recolhe imunoprecipitados por centrifugação a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C.
      4. Lava-se a pelete 2 vezes com 10 ml de tampão de lise A a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. Depois de cada lavagem, sedimentar as pérolas e substituir o sobrenadante com tampão de lise A.
      5. Lava-se a pelete 3 vezes com 10 ml de tampão de lise A sem NAM a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Depois de cada lavagem, sedimentar as pérolas e substituir o sobrenadante com tampão de lise A. É important não transitar qualquer NAM à reação de desacetilação.
    9. Preparar a solução de péptido Flag 1x (incluindo os inibidores de protease e 1 uM em PBS TSA).
    10. Adicionar 500 ul de solução de péptido Flag 1x para as pérolas de agarose e incubar durante 30 min a 4 ° C sob rotação constante.
    11. Recolher o sobrenadante por centrifugação a 6000 xg durante 2 min a 4 ° C.
    12. Repita duas etapas anteriores.
    13. Remover grânulos a partir do sobrenadante, utilizando tubos de filtragem e centrifugação a 15.000 xg durante 1 min a 4 ° C.
    14. Usando uma membrana de ultrafiltração, concentrar amostra eluida até que a concentração de proteína é de 1 ug / ul.
    15. Efectuar a electroforese através da execução de 1 ul da amostra eluiu-se num gel de SDS-PAGE a 4-12%.
    16. Confirmar acetilação da proteína de substrato por western blotting utilizando anticorpos contra Ac-K (1: 1000 de diluição) e a proteína de substrato (diluição depende do anticorpo específico utilizado).
    17. Mantenha purificados acetilado proteína-substrato a -80 ° C.
  3. In Vitro A desacetilação de Reacção
    1. Preparar o tampão de desacetilação B (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl 2 0,5 uM TSA)
    2. Preparar 3 reacções diferentes em diferentes tubos em 20 ul de volume final (Tabela 1).
    3. Incluem reacções adicionais para confirmar desacetilação da proteína de substrato por SIRT2 (opcional). Adicionar 2 ug de desacetilação purificada SIRT2 mutante nulo (isto pode ser feito utilizando o protocolo descrito em 1.1 depois de usar um lentivector pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -flag) para a reacção em vez de desacetilase SIRT2 activo ou adicionar 10 mM de nicotinamida (NAM ) à mistura reaccional para inibir a actividade de desacetilação SIRT2 (Tabela 1).
    4. Incubar as reacções durante 3 horas a 30 ° C sob agitação constante.
    5. Parar a reacção por adição de 20 ul de tampão de amostra 2x e ferver as amostras Fou 10 min a 95 ° C.
    6. Efectuar a electroforese, executando-se a mistura de reacção sobre um gel de SDS-PAGE a 4-12% e detectar o estado de acetilação da proteína de substrato por western blotting utilizando um anticorpo anti Ac-K (1: 1000 de diluição) 19,20.

2. Ensaio In Vivo A desacetilação

  1. SIRT2 superexpressão em células em cultura
    1. Preparar 10 cm pratos de cultura com células HEK 293T sobre-expressando estavelmente vector pCDH-puro-GFP-vazia, pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag e pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -flag (como descrito em 1.1) para ser de cerca de 70 % confluentes.
    2. Em alternativa, preparar pratos de cultura de 10 cm com células de cerca de 70% confluentes e realizar a sobre-expressão transiente utilizando 5 ug dos vectores mencionados acima utilizando PEI numa proporção de 3 ul de PEI / ug do ADN.
    3. Realizar transferência de Western de extractos celulares totais utilizando um anticorpo anti-Flag (diluição 1: 1000) para demonstrar a sobre-expressão da Bandeira-tagged SIRT2 19.
  2. RNA de interferência para Knockdown SIRT2 em células em cultura
    1. Prepara-se uma placa de cultura de 10 cm de células HEK 293T para ser cerca de 70% confluentes no dia seguinte.
    2. No dia seguinte, co-transfecção de 4 ug pLKO1-puro-SH SIRT2 (lentivector) 19, 4 ug pCMV- dR8.2 dvpr (vector de embalagem) e 0,5 ug de pCMV-VSV-G (vector de envelope) 18 utilizando polietilenimina (PEI) numa proporção de 3 ul de PEI / ug do ADN.
      Nota: Para derrubar SIRT2, usamos shRNAs hairpin simples no vector pLKO.1 lentiviral projetada pelo RNAi Consortium (TRC).
    3. Seguir o processo tal como descrito no ponto 1.1 para produzir shSIRT2 lentivírus e infectar as células-alvo para knockdown SIRT2.
    4. Realizar transferência de Western de extractos celulares totais utilizando um anticorpo anti-SIRT2 (diluição 1: 1000) para demonstrar SIRT2 knockdown eficiente após a execução de 40 ^ g de proteína total num gel de SDS-PAGE a 10%.
    5. Alternativamente,Preparar 10 cm placas de cultura de células com cerca de 70% confluentes e executar knockdown transiente de SIRT2 utilizando ARNsi seguindo as instruções do fabricante.
    6. Realizar transferência de Western de extractos celulares totais utilizando um anticorpo anti-SIRT2 (diluição 1: 1000) para demonstrar SIRT2 knockdown eficiente após a execução de 40 ^ g de proteína total num gel de SDS-PAGE a 10%.
  3. A imunoprecipi tacão e imunotransferência, para detectar os níveis acetilado em células cultivadas
    1. 12 horas antes de coletar sedimentos celulares a partir de qualquer células com superexpressão SIRT2 (ver 2.1 acima) ou SIRT2 derrubado células (ver 2.2 acima), adicionar 1 mm TSA ao meio de cultura para inibir Classe III desacetilases não histonas.
    2. Remover o meio de cultura, lavar as células duas vezes em PBS e recolher as células por tripsinização, seguido por centrifugação a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    3. Adicionar 10 ml de tampão de lise A (HEPES 20 mM pH 7,9, KCl 18 mM, EGTA 0,2 mM, 1,5mM de MgCl2, 20% de glicerol, 0,1% de NP-40) incluindo um cocktail de inibidores de protease, TSA 1 uM e 2 mM de NAM.
    4. Incubar a 4 ° C durante 30 minutos sob constante rotação.
    5. Recolher os sobrenadantes por centrifugação a 20000 xg durante 15 minutos a 4 ° C.
    6. Calcule a concentração de proteína usando um ensaio de proteína de Bradford.
    7. Transferência de 1 mg de proteína total para novos tubos, em um volume final de 1 ml, utilizando solução de lise tampão A. Utilização Tabela 2 como uma referência para preparar amostras de proteína a partir de células que sobre-expressam quer SIRT2 ou após knockdown SIRT2.
    8. Executar uma imunoprecipitação utilizando um anticorpo contra a proteína-substrato específico juntamente com proteína A / G (40 uL grânulo lama é recomendado). Em alternativa, utilizar um anticorpo Ac anti-K conjugados a esferas de agarose (20 uL grânulo suspensão é geralmente suficiente) para imunoprecipitar proteínas de todos os acetilados.
    9. Incubar as amostras a 4 ° C sob CONSTAnt overnight rotação.
    10. Recolhe imunoprecipitados por centrifugação a 1000 xg durante 2 min a 4 ° C.
    11. Lavar as nervuras 5 vezes com 1 ml de tampão A a 1000 xg durante 2 min a 4 ° C.
    12. grânulos Ressuspender em 40 ul de tampão de amostra 2x.
    13. amostras ferver durante 10 min a 95 ° C.
    14. Efectuar a electroforese, executando as amostras eluídas (40 ul a partir do passo 2.3.12) sobre um gel de SDS-PAGE a 4-12%, sem perturbar as pérolas durante a transferência das amostras eluídas.
    15. Detectar níveis acetiladas da proteína de substrato por Western blotting utilizando um anticorpo anti-Ac-K (diluição 1: 1000), se foi utilizado um anticorpo específico da proteína-substrato para a imunoprecipitação, ou um anticorpo específico contra a proteína de substrato (Seguir as recomendações de o anticorpo específico em relação a diluição) se grânulos anti Ac-K foram usadas para a imunoprecipitação.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para que uma proteína deve ser considerada como um alvo desacetilação legítimo para qualquer enzima com actividade de desacetilação, tanto in vitro e in vivo em ensaios de desacetilação precisa ser realizado para estabelecer a interacção entre a desacetilase e o seu substrato. Para o ensaio de desacetilase in vitro, a purificação de ambos o desacetilase e o substrato acetilado é necessária antes do doseamento pode ser realizado. Aqui usamos o SIRT2 sirtuina citoplasmática como a desacetilase específico a ser estudado. SIRT2 é uma enzima desacetilase e a utilização de um mutante a que falta a actividade de desacetilase é altamente recomendado como um controlo negativo para o ensaio de desacetilação. Utilizando o procedimento de purificação descrito em 1.1, tanto SIRT2 e SIRT2 H187Y podem ser purificadas com sucesso a uma concentração final de 1 ug / uL. Isto pode ser confirmada após a execução das proteínas purificadas em gel seguido por coloração(Figura 1A, superior) bem como após transferência de Western utilizando um anticorpo anti-Flag e uma vez que ambos SIRT2 SIRT2 H187Y são marcados com um péptido Flag (Figura 2A, inferior). O mesmo procedimento de purificação pode ser seguido para a purificação do substrato de proteína com algumas modificações. A proteína tem de ser acetilado antes que ele possa ser utilizado para o ensaio de desacetilação que significa que tem de ser purificado em células que sobre-expressam a transferase de acetilo específico ou uma mistura de chapéus capazes de acetilar a proteína. Utilizando o procedimento de purificação descrito em 1.2, a proteína pode ser acetilado purificado (Figura 1B, superior). Para confirmar que a proteína é, de facto acetilado e pode ser utilizado para o ensaio de desacetilação in vitro, transferência de Western utilizando um anticorpo anti Ac-K é necessária para exibir níveis aumentados acetilados da proteína purificada em células que sobre-expressam a acetil-transferase (Figura 1B, Lower).

Depois de purificação de proteínas bem sucedida, o ensaio in vitro de desacetilação pode ser executada. Sirtuins, incluindo SIRT2, são de classe III desacetilases de histona de lisina, que são distintos de outros desacetilases como eles exigem NAD + para a sua função enzimática. Consistente com isto, não desacetilação pode ser detectado através de Western blotting utilizando um anticorpo anti Ac-K na ausência de NAD +, independentemente da presença de SIRT2 cataliticamente activa (Figura 2, pista 2 vs 1). Pelo contrário, uma diminuição dos níveis da proteína acetilados acetilado quando ambos SIRT2 e NAD + estão presentes na reacção sugerem que a proteína pode ser considerada como um alvo para SIRT2 desacetilação. A fim de verificar estes resultados, diferentes controlos negativos podem ser usados. Por exemplo pode ser detectada nenhuma diferença nos níveis de desacetilação da proteína quando um deficiente SIRT2 desacetilação (SIRT2 H187Y) é utilizado em vez do tipo selvagem cataliticamente activo SIRT2 (Figura 2, pista 5 vs 4). efeito semelhante pode ser visto quando um inibidor sirtuina bem estabelecida, NAM, é adicionado à mistura de reacção, o que implica que a diminuição dos níveis de proteína acetilados é mediada pela actividade de desacetilase de SIRT2.

deacetylation aberrante está envolvida em diversos processos celulares e doenças relacionadas com a idade. Assim, um passo crucial para se aprofundar estudos sobre a interação entre a deacetilase e seu substrato é estabelecer essa interligação em células onde este fenómeno pode ter um impacto fisiológico. Além disso, a verificação de desacetilação em sistemas de cultura de células in vivo, permite o estudo de caso desacetilação num contexto específico de células ou tecido que pode ser mais facilmente ligado a um fenótipo ou resultado específico. Isto exclui a possibilidade de que o detectado na Deac vitroactividade etylation é artificial devido à presença de ambos o desacetilase e o seu substrato no tubo, ao mesmo tempo, que nunca pode ocorrer sob condições fisiológicas normais em células. Para o ensaio de desacetilação in vivo, as células que sobre-expressam tanto SIRT2 e SIRT2 H187Y, bem como o substrato da proteína pode ser utilizado seguindo os procedimentos descritos em 2.1 e 2.2. Os extractos celulares preparados a partir destas células pode ser confirmada para expressar SIRT2, SIRT2 H187Y, e o substrato de proteína por transferência de Western utilizando anticorpos específicos. No ensaio aqui descrito, as proteínas expressas são todos exogenamente marcado para facilidade de as experiências realizadas (Figura 3, painel inferior para detectar SIRT2 marcada com HA / SIRT2 H187Y e painel do meio para detectar substrato proteína Flag-tag). Para determinar se a proteína alvo é um substrato de desacetilação SIRT2, imunoprecipitação é executada utilizando um anticorpo anti-Flag para puxar para baixo a proteína alvo followed por western blotting utilizando um anticorpo anti Ac-K. Diminuição nos níveis acetiladas da proteína em células que expressam SIRT2 (Figura 3 painel superior, faixa 3 x 2) e à falta de afectar os níveis de acetilados em células que expressam o desacetilase mutante deficiente SIRT2 (Figura 3 painel superior, faixa 4 vs 3) sugerem que a proteína acetilado pode ser um alvo de desacetilação da desacetilase específica in vivo. Isto pode ser ainda confirmada quando desacetilação mediada por SIRT2 é inibida após o tratamento de células com NAM (Figura 3 painel superior, pista 5 vs 3), que estabelece os eixos específicos desacetilase-substrato nas células estudadas.

figura 1
Figura 1: Purificação de tanto a desacetilase e a proteína substrato-acetilado para ser utilizado para o ensaio in vitro de desacetilação. (A) 1 ug de ambos SIRT2 SIRT2 e H187Y (desacetilação mutante defeituoso) foram corridos num gel de acordo com o protocolo de purificação, como descrito em 1.1. O gel foi corado com uma solução de coloração disponíveis comercialmente e depois descoloração, ambas as proteínas purificadas podem ser detectados (superior). As proteínas podem ser detectados após a transferência em membrana de PVDF e Western blotting utilizando um anticorpo anti-Flag (inferior). (B) 1 ug de proteína de substrato e hiper substrato proteico acetilado (alfa-enolase foi utilizado como um substrato SIRT2 com base em dados não publicados de espectrometria de massa gerados no nosso laboratório) foram corridos num gel de acordo com o protocolo de purificação, como descrito em 1.2. O gel foi corado com uma solução de coloração disponíveis comercialmente e depois descoloração, o substrato de proteína purificada pode ser detectada (superior). A acetilação pode ser detectada após a transferência em membrana de PVDF e Western blotting utilizando um anticorpo anti-Ac-K (do meio). p total roteins pode ser detectada usando um anticorpo anti-Flag (inferior). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. No ensaio in vitro de desacetilação substrato proteína purificada acetilado (alfa-enolase) é incubada com SIRT2 ou SIRT2 H187Y (desacetilação mutante defeituoso) na presença de NAD + (pistas 4 e 5). Diminuição dos níveis acetilados são detectados por Western blotting utilizando um anticorpo anti-K Ac na presença de SIRT2 mas não na presença de SIRT2 H187Y (pista 4 versus 5). Nenhuma actividade de desacetilação é observado quando o NAD + não está incluída na mistura de reacção (pista 2 vs 4) ou quando NAM é adicionado à mistura de reacção (pista 6 vs 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Em células HEK293T in vivo ensaio de desacetilação que sobre-expressam de forma estável, quer SIRT2 ou SIRT2 H187Y foram co-transfectadas com o substrato proteico (alfa-enolase) e chapéus para aumentar os níveis acetiladas da proteína (pista 2 vs 1). A desacetilação foi verificada in vivo, após a imunoprecipitação utilizando um anticorpo anti-Flag para puxar para baixo o substrato proteico e Western blotting utilizando um anticorpo anti Ac-K. A acetilação é significativamente reduzida nas células que sobre-expressam SIRT2, em comparação com o SIRT2 H187Y células que sobre-expressam (pista 3 versus 4). A desacetilação mediada por SIRT2do substrato proteína é inibida quando as células são tratadas com NAM (pista 5 vs 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

reações 1 2 3 4 (opcional) 5 (opcional)
proteína-acetilado substrato purificada (10 ug) + + + + +
tampão B + + + + +
SIRT2 purificado (2 ug) - + + - +
NAD + (1 mu) - - + + +
H187Y SIRT2 purificado (2 ug) - - - + -
NAM (10 mM) - - - - +

Tabela 1: ingredientes da reacção.

amostras superexpressão derrubar
1 vetor pCDH-puro-GFP vazia pLKO1 vector vazio ou CTR si
2 pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag pLKO1 SH SIRT2 1 ou Si 1 SIRT2
3 pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -flag pLKO1 SH SIRT2 2 ou Si 2 SIRT2

Tabela 2: Proteína amostras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O projeto aqui descrito foi suportado por uma concessão do NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1), bem como pela Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center - O Lefkofsky Family Foundation / Liz e Research Award Eric Lefkofsky Inovação para AV Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório (Carol O'Callaghan e Elizabeth Anne Wayne) para leitura crítica e editar este manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
  2. Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
  3. Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
  4. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
  5. Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
  6. L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
  7. Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
  8. Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
  9. Smith, K. T., Workman, J. L. Introducing the acetylome. Nature Biotechnology. 27, 917-919 (2009).
  10. Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D. Histone acetyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 70, 81-120 (2001).
  11. Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
  12. Anderson, K. A., Hirschey, M. D. Mitochondrial protein acetylation regulates metabolism. Essays in Biochemistry. 52, 23-35 (2012).
  13. Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
  14. Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
  15. Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
  16. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
  17. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
  18. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
  19. Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
  20. Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
  21. Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48 (2011).
  22. Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
  23. Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382 (2011).
  24. Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. e51682 (2014).
  25. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (2011).
  26. He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics