脱アセチル化アッセイは、サーチュインの間にInterplay(SIRT2)と特異的なタンパク質 - 基質を解明します

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Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

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Abstract

Protocol

インビトロ脱アセチル化アッセイでは 1

  1. SIRT2の精製
    1. 10%FBSおよび抗生物質を8ミリリットルDMEM中で培養し、翌日に約70%コンフルエントであると、37℃、5%CO 2組織培養インキュベーター中で増殖させたHEK 293T細胞の10cmの培養皿を準備します。
    2. 翌日、同時トランスフェクト4μgのpCDH-puroを-GFP-SIRT2フラッグ(私たちの研究室で行われたレンチベクター)、4μgのpCMV- dR8.2 dvpr(パッケージングベクター)および0.5μgののpCMV-VSV-G(エンベロープベクター) 183μlのPEI /μgのDNAの比でポリエチレンイミン(PEI)を使用。
    3. 12時間後にメディアを変更します。
    4. 36〜48時間後に上清を収集します。
    5. 4℃で5分間、1000×gで遠心分離することによってゴミを取り除きます。
    6. 0.22μmのフィルターを通して濾過した後、SIRT2のレンチウイルスの1ミリリットルのアリコートを作成し、-80℃で保管してください。
    7. 氷上で解凍SIRT2のレンチウイルス(ウイルスを使用しない場合、-80℃でウイルスを保管しておくことが重要です)。
    8. / mlのポリブレンを8μgの存在下でのレンチウイルスの1ミリリットルで80〜90%のコンフルエントHEK 293T細胞の6ウェルプレートに感染します。
    9. 次の日(24時間)まで、37℃のインキュベーター中でウイルス感染細胞を置きます。
    10. 24時間後に培地を交換してください。
    11. 感染後48時間では、蛍光顕微鏡下でGFP陽性細胞を検出することにより、感染効率を確認してください。
    12. 感染効率が良好であれば(少なくとも40から50までパーセント感染細胞)は、培地は、細胞を過剰発現する安定SIRT2を選択するために、2 / mlのピューロマイシンを含有する培地を交換してください。
      注:これは、約2週間かかり、培地を3〜4日ごとに変更されます。非感染細胞は、この選択期間にわたって死ぬとSIRT2のレンチウイルスで感染細胞のみが成長します。
    13. purifを開始する前に、10%SDS-PAGEゲル上の全タンパク質の40μgの実行後に:(千希釈1)抗Flag抗体を用いたウェスタンブロッティングによってFlag標識SIRT2の発現を分析icationプロセス(推奨)19,20。
    14. 1でアクティブSIRT2、分割細胞を精製するために:安定フラッグSIRT2を過剰発現するHEK 293T細胞の十分な料理を持っているために、トリプシン処理により3比(十10cmの皿には、次の実験のための十分なタンパク質の精製を可能にします)。
      1. 細胞をトリプシン処理培地を除去し、滅菌DPBSで細胞を洗浄することによって残留血清を排除します。ゆっくり30-45秒間室温でインキュベートし、細胞単層をカバーするために、0.25%トリプシン-EDTA溶液の2.5ミリリットルを追加します。細胞がデタッチし始めるまでトリプシン-EDTA溶液を除去した後、37℃でインキュベートします。その後、培養液を追加し、新しい皿に細胞を移します。
    15. 培養培地を除去し、PBSで2回細胞を洗浄し、4℃で10分間1,000×gで遠心分離し、トリプシン処理により細胞を回収。
    16. 500μlの溶解緩衝液A(20mMのHEPES pHは7.9、18のKCl、0.2mMのEGTA、1.5mMのMgCl 2を中に溶解細胞ペレットプロテアーゼ阻害剤カクテル及び一定の回転下で4℃で30分間、1μMTSAを含む、20%グリセロール、0.1%NP-40)。
    17. 4℃で15分間、14,000×gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。
    18. 後述のようにアガロースビーズに結合した抗Flag抗体を用いた免疫沈降を行います。
      1. タンパク質溶解液(10〜20mgの総タンパク質)にアガロースビーズに結合した抗Flag抗体の200から300μLを加えます。
      2. 一定に撹拌しながら4℃で一晩インキュベートします。
      3. 4°Cで5分間千×gで遠心分離することによって免疫沈降物を収集します。
      4. 4℃で5分間、1000×gで10mlの溶解緩衝液Aを用いてペレットを5回洗浄します。各洗浄後、ビーズをペレット化し、緩衝液Aで上清を置き換えます
    19. (プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび1μMPBSでTSAを含む)の1x Flagペプチド溶液を調製します。
    20. 1×旗peptid500μlのを追加します。アガロースビーズに電子溶液とは、一定の回転下で4℃で30分間インキュベートします。
    21. 4℃で2分間、6000×gでの遠心分離により上清を収集します。
    22. 前の2つのステップを繰り返します。
    23. 4℃で1分間、15,000×gでフィルタ管と遠心分離を用いて、上清からビーズを除去。
    24. 最終タンパク質濃度は、限外濾過膜を用いを1μg/μLになるまで溶出された試料を濃縮します。
    25. 溶出された試料1μgのを使用して電気泳動を行うことにより、精製プロセスをチェックしてください。
    26. 市販の染色液で染色ゲルは、SIRT2の精製を確認しました。
    27. -80℃で精製したSIRT2を保管してください。
  2. アセチル化タンパク質基質の精製
    1. 約70%のコンフルエント次の日にHEK 293T細胞で10センチメートル×10センチ培養皿を準備します。
    2. 翌日、旗5μgのと同時トランスフェクト細胞は、プラスミドベクターexpressinをタグ付けしました。グラムのタンパク質 - 基質と同様に3μlのPEI /μgのDNAの比率でPEIを用いてタンパク質をアセチル化することができ、特定のアセチルトランスフェラーゼ5μgの。
      注:特定のアセチルトランスフェラーゼが知られていない場合は、そのようなp300に、CBP、GCN5、TIP60およびPCAFとして知られているヒストンアセチルトランスフェラーゼ(のHAT)の混合物との共トランスフェクション。
    3. 12時間後に培地を変更してください。
    4. 一晩脱アセチル化酵素を阻害することによって、タンパク質基質のアセチル化レベルを最大にするためにTSA / NAMを含む培地で培地を交換し、1μMTSA及び2mMのニコチンアミド(NAM)で細胞を処置する、細胞を溶解前日。
    5. 48時間のトランスフェクションの後、培地を除去し、PBSで細胞を2回洗浄し、4℃で10分間1,000×gで遠心分離し、トリプシン処理により細胞を回収。
    6. プロテアーゼ私を含め皿当たり500μlの溶解緩衝液A(20mMのHEPES pHは7.9、18のKCl、0.2mMのEGTA、1.5mMのMgCl 2を、20%グリセロール、0.1%NP-40)で溶解細胞ペレットnhibitorsカクテル、一定の回転下、4℃で30分間、1μMTSAおよび2 mMのNAM。
    7. 4℃で15分間、14,000×gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。
    8. 後述のようにアガロースビーズに結合した抗Flag抗体を用いた免疫沈降を行います。
      1. タンパク質溶解液(10〜20mgの総タンパク質)にアガロースビーズに結合した抗Flag抗体の200から300μLを加えます。
      2. 一定に撹拌しながら4℃で一晩インキュベートします。
      3. 4°Cで5分間千×gで遠心分離することによって免疫沈降物を収集します。
      4. 4℃で5分間、1000×gで10mlの溶解緩衝液Aでペレットを2回洗浄します。各洗浄の後、ビーズをペレット化し、溶解緩衝液Aを用いて上清を置き換えます
      5. 4℃で5分間、1000×gでNAMなし10mLの溶解緩衝液Aでペレットを3回洗浄します。それはimporta各洗浄の後、ビーズをペレット化し、溶解緩衝液Aを用いて上清を置き換えますntの脱アセチル化反応に任意のNAMを持ち越さないように。
    9. (プロテアーゼ阻害剤およびPBSで1μMTSAを含む)の1x Flagペプチド溶液を調製します。
    10. アガロースビーズに1×Flagペプチド溶液500μlを加え、一定の回転下、4℃で30分間インキュベートします。
    11. 4℃で2分間、6000×gでの遠心分離により上清を収集します。
    12. 前の2つのステップを繰り返します。
    13. 4℃で1分間、15,000×gでフィルタ管と遠心分離を用いて、上清からビーズを除去。
    14. タンパク質濃度を1μg/ ULになるまで限外濾過膜を使用して、溶出された試料を濃縮します。
    15. 4〜12%SDS-PAGEゲル上で溶出された試料の1μLを実行することにより、電気泳動を行います。
    16. (:1,000希釈1)およびタンパク質基質(希釈が使用される特定の抗体に依存)のAc-Kに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによりタンパク質基質のアセチル化を確認してください。
    17. プリをキープ-80℃でアセチル化タンパク質基質をfiedが。
  3. インビトロ脱アセチル化反応
    1. 脱アセチル化緩衝液B(50mMのトリス-HCl、pH7.5で、150mMのNaCl、1mMのMgCl 2、0.5μMTSA)を調製
    2. 20μlの最終容量( 表1)に異なるチューブ内の3つの異なる反応を準備します。
    3. SIRT2(オプション)により、タンパク質基質の脱アセチル化を確認するための追加の反応を含みます。代わりに脱アセチル化酵素アクティブSIRT2の反応に精製された脱アセチル化ヌル変異体SIRT2(これはpCDH-puroを-GFP-SIRT2 H187Y -Flagレンチベクターを使用した後、1.1に記載されているプロトコルを使用して行うことができる)を2μgを追加するか、または10mMのニコチンアミドを追加します(NAM )SIRT2の脱アセチル化活性を阻害する反応を( 表1)。
    4. 一定の攪拌下、30℃で3時間反応をインキュベートします。
    5. Fの2×サンプル緩衝液20μlを加えて反応を停止し、サンプルを沸騰させますまたは95℃で10分間。
    6. 4~12%SDS-PAGEゲル上で反応混合物を実行することにより、電気泳動を行い、反のAc-K抗体(1:1,000希釈)を用いてウェスタンブロッティングによるタンパク質基質のアセチル化状態を検出する19,20。

インビボでの脱アセチル化アッセイ2.

  1. 培養細胞におけるSIRT2過剰発現
    1. 約70であることをHEK 293T細胞を安定的pCDH-puroを-GFP-空ベクターを過剰発現する、pCDH-puroを-GFP-SIRT2フラッグとpCDH-puroを-GFP-SIRT2 H187Y -Flag(1.1で説明したように)で10cmの培養皿を準備%コンフルエント。
    2. あるいは、細胞の約70%コンフルエントで10cmの培養皿を準備し、3μlのPEI /μgのDNAの比率でPEIを使用して、上記のベクター5μgの使用して、一過性過剰発現を行います。
    3. フラッグトンの過剰発現を実証する:(千希釈1)抗Flag抗体を用いて、全細胞抽出物のウェスタンブロッティングを行いますSIRT2 19を agged。
  2. 培養細胞でのノックダウンSIRT2にRNA干渉
    1. 次の日、約70%コンフルエントであることをHEK 293T細胞の10cmの培養皿を準備します。
    2. ポリエチレンイミン(PEI)を使用して、次の日、同時トランスフェクト4μgのpLKO1-puroを-SHのSIRT2(レンチベクター)19、4μgのpCMV- dR8.2 dvpr(パッケージングベクター)および0.5μgののpCMV-VSV-G(エンベロープベクター)18 3μlのPEI /μgのDNAの割合で。
      注:SIRT2をノックダウンするために、我々は、RNAiコンソーシアム(TRC)によって設計さpLKO.1レンチウイルスベクターでシンプルなヘアピンのshRNAを使用します。
    3. shSIRT2のレンチウイルスを生成し、SIRT2をノックダウンするために、標的細胞を感染させるために1.1に記載された手順に従ってください。
    4. 10%SDS-PAGEゲル上の全タンパク質40μgのを実行した後で、効率的なSIRT2のノックダウンを実証する:(千希釈1)抗SIRT2抗体を用いて、全細胞抽出物のウェスタンブロットを行います。
    5. 別の方法として、細胞の約70%コンフルエントで10cmの培養皿を準備し、製造者の指示に従ってsiRNAを使用してSIRT2の過渡ノックダウンを行います。
    6. 10%SDS-PAGEゲル上の全タンパク質40μgのを実行した後で、効率的なSIRT2のノックダウンを実証する:(千希釈1)抗SIRT2抗体を用いて、全細胞抽出物のウェスタンブロットを行います。
  3. 培養細胞におけるアセチル化レベルを検出するための免疫沈降および免疫ブロッティング
    1. 12時間SIRT2を過剰発現する細胞のいずれかからの細胞ペレットを収集する前に非クラスIIIヒストンデアセチラーゼを阻害するために培地に1μmのTSAを追加し、(上記2.1を参照)またはSIRT2は細胞を(上記2.2を参照)をノックダウン。
    2. 培養培地を除去し、PBSで2回細胞を洗浄し、4℃で10分間1,000×gで遠心分離し、トリプシン処理により細胞を回収。
    3. 10ミリリットルの溶解緩衝液A(20mMのHEPES pHは7.9、18のKCl、0.2mMのEGTA、1.5が追加しますMgCl 2、20%グリセロール、0.1%NP-40)プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む、1μMTSAおよび2mM NAM。
    4. 一定の回転下で30分間、4℃でインキュベートします。
    5. 4℃で15分間20,000×gでの遠心分離によって上清を収集します。
    6. Bradfordタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を計算します。
    7. 基準として、溶解緩衝液Aで使用し、表2を用いて1 mlの最終容積で転送新しいチューブに総タンパク質1mgのいずれかを過剰発現SIRT2またはSIRT2ノックダウン後の細胞からタンパク質試料を調製しました
    8. プロテインA / Gと一緒に特異的なタンパク質 - 基質に対する抗体を用いた免疫沈降を行います(40μlのビーズスラリーを推奨します)。また、すべてのアセチル化タンパク質を免疫沈降(20μlのビーズスラリーは通常十分です)アガロースビーズに結合した抗のAc-K抗体を使用しています。
    9. CONSTA下で4℃でサンプルをインキュベートntの回転一晩。
    10. 4°Cで2分間、1000×gで遠心分離することによって免疫沈降物を収集します。
    11. 4°Cで2分間千×gでビーズを1ミリリットル緩衝液Aで5回洗浄します。
    12. 2×サンプルバッファー40μlの再懸濁ビーズ。
    13. 95℃で10分間沸騰サンプル。
    14. 溶出されたサンプルを転送しながらビーズを乱すことなく、4〜12%SDS-PAGEゲル上で溶出したサンプル(ステップ2.3.12から40μl)を実行することにより、電気泳動を行います。
    15. タンパク質基質特異的な抗体を免疫沈降に使用された場合:(千希釈1)、またはタンパク質基質に対する特異的抗体は、(のための推奨事項に従う抗のAc-K抗体を用いたウエスタンブロット法によりタンパク質 - 基質のアセチル化レベルを検出抗のAc-Kビーズを免疫沈降に使用した場合、特定の抗体について希釈)。

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Representative Results

in vitroおよびin vivo脱アセチル化アッセイ両方において 、脱アセチル化活性を有する任意の酵素のための正当な脱アセチル化の対象として考慮されるべきタンパク質についてのために脱アセチル化酵素とその基質との間の相互作用を確立するために実行される必要があります。アッセイが行われ得る前に、インビトロ脱アセチル化アッセイのために、脱アセチル化酵素およびアセチル化タンパク質基質の両方の精製が必要とされます。ここでは、具体的な脱アセチル化酵素を研究するように細胞質サーチュインSIRT2を使用します。 SIRT2は、高度に脱アセチル化アッセイの陰性対照として推奨されている脱アセチル化酵素および脱アセチル化酵素活性を欠く変異体の使用です。 1.1に記載の精製法を用いて、SIRT2およびSIRT2 H187Yの両方が正常に1μg/μlの最終濃度で精製することができます。これは、染色を行ったゲル上で精製したタンパク質を実行した後に確認することができますSIRT2とSIRT2 H187Yの両方のため、抗Flag抗体を用いて、同様にウェスタンブロッティング後(上図1Aは 、)Flagペプチド( 図2A、下)でタグ付けされています。同じ精製手順は、いくつかの修飾を有するタンパク質基質の精製のために追跡することができます。タンパク質は、それが特定のアセチルトランスフェラーゼまたはタンパク質をアセチル化することができる帽子混合物を過剰発現する細胞中で精製される必要があることを意味する脱アセチル化アッセイに使用する前にアセチル化される必要があります。 1.2に記載の精製法を用いて、アセチル化タンパク質( 図1B、上部)を精製することができます。タンパク質が実際にアセチル化され、 インビトロ脱アセチル化アッセイに使用することができることを確認するために、抗のAc-K抗体を用いたウェスタンブロッティングは、アセチルトランスフェラーゼ( 図1Bを過剰発現する細胞における精製タンパク質の増加したアセチル化レベルを示すことが必要ですロウR)。

成功したタンパク質の精製後、 インビトロ脱アセチル化アッセイを行うことができます。 SIRT2含むサーチュインは、彼らが酵素機能のためにNAD +を必要とする他の脱アセチル化酵素とは ​​区別されるクラスIIIヒストンリジン脱アセチル化酵素です。これと一致して、いかなる脱アセチル化にかかわらず、触媒活性SIRT2( 図2、1対レーン2)の存在下での、NAD +の非存在下で抗のAc-K抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することができません。逆に、SIRT2およびNAD +の両方が反応中に存在するタンパク質は、SIRT2ための脱アセチル化の対象と考えることができることを示唆しているアセチル化タンパク質のアセチル化のレベルを減少させました。これらの結果を確認するために、別の陰性対照を使用することができます。例えば、タンパク質の脱アセチル化のレベルに差は検出できなかったときに脱アセチル化欠損SIRT2(SIRT2 H187Y)の代わりに、触媒的に活性な野生型SIRT2( 図2、4対レーン5)を用いています。十分に確立されたサーチュイン阻害剤、NAMは、タンパク質のアセチル化のレベルの低下がSIRT2のデアセチラーゼ活性によって媒介されることを示唆し、反応混合物に添加した場合も同様の効果が見られます。

異常な脱アセチル化は、いくつかの細胞プロセスおよび加齢関連疾病に関与しています。したがって、脱アセチル化酵素とその基質との間の相互作用についての知識を深めるにおける重要なステップは、この現象は、生理学的な影響を与える可能性があり、細胞内のこの相互接続を確立することです。また、 生体内で細胞培養系での脱アセチル化をチェックすることは、より簡単に、特定の表現型または結果に接続することができ、細胞または組織特異的文脈での脱アセチル化イベントの研究を可能にします。これは、 インビトロ DEAC 検出された可能性を排除しますetylation活性が原因で細胞内の正常な生理的条件下では決して起こらないかもしれ脱アセチル化酵素と同時にチューブでその基質、両方の存在に人工的です。 in vivoでの脱アセチル化アッセイのために、SIRT2とSIRT2 H187Yならびにタンパク質基質の両方を過剰発現する細胞は、2.1と2.2で説明した手順に従って使用することができます。これらの細胞から調製した細胞抽出物は、特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによってSIRT2、SIRT2 H187Y、及びタンパク質基質を発現することが確認できます。ここに記載したアッセイでは、すべての外因的に発現されたタンパク質は、実施した実験( 図3、FLAG標識タンパク質基質を検出するために、HA標識SIRT2 / SIRT2 H187Yと中央のパネルを検出するために、下のパネル)を容易にするためにタグ付けされています。標的タンパク質がSIRT2の脱アセチル化の基質であるかどうかを決定するために、免疫沈降は、標的タンパク質Fをプルダウンし、抗Flag抗体を用いて行われます抗のAc-K抗体を用いたウェスタンブロッティングによってollowed。 SIRT2を発現する細胞中のタンパク質のアセチル化レベルの低下することを示唆している(3対図3上パネル、レーン4)( 図3上パネル、レーン3対2)と細胞内でアセチル化のレベルに影響を与えるに失敗脱アセチル化酵素欠損SIRT2変異体を発現しますアセチル化タンパク質は、 生体内で特定の脱アセチル化酵素の脱アセチル化の対象とすることができます。 SIRT2媒介脱アセチル化は、NAM( 図3上パネル、3対レーン5)研究細胞内の特定の脱アセチル化酵素基質軸を確立して細胞を処理した後に阻害される場合、これはさらに確認することができます。

図1
図1: インビトロ 脱アセチル化アッセイ に使用される脱アセチル化酵素およびアセチル化タンパク質基質の両方の精製。SIRT2及びSIRT2 H187Y(脱アセチル化欠損変異体)の両方の(A)1μgの1.1で説明したように精製プロトコールを以下のゲルに流しました。ゲルを(上)は、市販の染色溶液及び脱色後染色し、両方の精製したタンパク質を検出することができます。タンパク質を、抗Flag抗体(下)を使用してPVDF膜およびウェスタンブロッティングに転送した後に検出することができます。 (B)タンパク質基質とハイパーアセチル化タンパク質基質1μgの1.2で説明したように精製プロトコール以下のゲルに流した(α-エノラーゼは、私たちの研究室で生成された質量分析未発表データに基づいて、SIRT2基質として使用しました)。ゲルを(上)は、市販の染色液で染色し、脱色した後、精製されたタンパク質基質を検出することができます。アセチル化は、抗-AC-K抗体(中央)を使用してPVDF膜およびウェスタンブロッティングに転送した後に検出することができます。合計P roteinsは、抗Flag抗体(下)を用いて検出することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: インビトロ脱アセチル化アッセイ において、精製されたタンパク質基質(α-エノラーゼ)はNAD +(レーン4及び5)の存在下で、SIRT2またはSIRT2 H187Y(脱アセチル化欠損変異体)とインキュベートするアセチル化。アセチル化レベルがSIRT2の存在ではなく、SIRT2 H187Y(5対レーン4)の存在下で抗のAc-K抗体を用いたウェスタンブロッティングによって検出される減少しました。 NAD +を反応混合物に含まれていないときに脱アセチル化活性は観察されない(レーン2対4)またはNAMを反応混合物に添加した場合(レーン6対4)。://www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3:安定SIRT2またはSIRT2 H187Yのいずれかを過剰発現し、インビボ 脱アセチル化アッセイ HEK293T細胞では、タンパク質(レーン2対1)のアセチル化のレベルを増加させるために、タンパク質基質(α-エノラーゼ)、帽子で同時トランスフェクトしました。脱アセチル化は、抗のAc-K抗体を用いたタンパク質基質とウェスタンブロッティングをプルダウンするために、抗Flag抗体を用いた免疫沈降した後、in vivoで確認しました。アセチル化は著しくSIRT2 H187Y過剰発現細胞(4対レーン3)と比較してSIRT2過剰発現細胞で減少しています。 SIRT2媒介脱アセチル化細胞はNAM(3対レーン5)で処理した場合にタンパク質基質の禁止される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

反応 1 2 3 4(オプション) 5(オプション)
精製されたアセチル化タンパク質-基板(10μgの) + + + + +
バッファB + + + + +
精製されたSIRT2(2μgの) - + + - +
NAD +(1Mμ) - - + + +
精製SIRT2のH187Y(2μgの) - - - + -
NAM(10 mM)の - - - - +

表1:反応成分。

サンプル 過剰発現 倒す
1 pCDH-puroを-GFP-空ベクター pLKO1空のベクター又はSiのCTR
2 pCDH-puroを-GFP-SIRT2、旗 pLKO1 SH SIRT2 1またはSI SIRT2 1
3 pCDH-puroを-GFP-SIRT2 H187Y -Flag pLKO1 SH SIRT2 2やSi SIRT2 2

表2:タンパク質試料。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

私たちは希望のAVするLefkofskyファミリー財団/リズとエリックLefkofskyイノベーション研究賞 - ここで説明するプロジェクトは、NIH / NCI(NCI-R01CA182506-01A1)からの助成金によってだけでなく、ロバート・H・ルーリー総合がんセンターによってサポートされていました重要な読書や編集のために、この原稿を研究室(キャロルオキャラハンとエリザベスアンウェイン)のメンバーに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

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References

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