Создание первичного фибробластов Культуры с уха мыши и хвост тканей

1Immunology Program, Department of Microbiology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore
Published 1/10/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Опишем простой и быстрый экспериментальную процедуру для генерации первичных фибробластов из ушей и хвостов мышей. Процедура не требует специальной подготовки животных и может быть использован для генерации фибробластов культур от ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней.

Cite this Article

Copy Citation

Khan, M., Gasser, S. Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues. J. Vis. Exp. (107), e53565, doi:10.3791/53565 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Первичные клетки получают непосредственно из тканей и, как считается, более представительным физиологического состояния клеток в естественных условиях, чем установленные клеточных линий. Тем не менее, первичных клеточных культур, как правило, имеют конечный срок службы, и их необходимо часто восстановлена. Фибробласты легко доступным источником первичных клеток. Здесь мы обсудим простой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Протокол может быть использован для установления первичных культур фибробластов из ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней. Когда протокол внимательно следил, загрязнения, вряд ли произойдет, несмотря на использование нестерильных ткани хранится в течение длительного времени в некоторых случаях. Фибробласты быстро размножаются в культуре и может быть расширена до значительного числа перед прохождением репликативной старение.

Introduction

Первичные клетки получают из живой ткани, и культивируют при условиях в пробирке. Это, как правило, предполагается, что первичные клетки больше напоминают физиологическое состояние и генетический фон ткани, из которой они возникли, чем иммортализованных или опухолевых клеточных линий 1. По этой причине, первичные клетки представляют собой полезную модель для изучения биологического вопросы 2,3. Однако, в отличие установленных клеточных линий, которые растут на неопределенный срок, в конце концов, первичные клетки претерпевают старение в культуре, и необходимо часто восстановлена.

Обычно используемые первичные клетки включают фибробласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, Т-клетки, В-клетки, костный мозг, полученный макрофаги кости (BMDM) и костного мозга дендритные клетки кости (BMDC). Фибробласты часто используют в качестве модели первичной культуре клеток. Они предлагают основные преимущества по сравнению с другими первичными клетками. Клеточные культуры легко устанавливаются, легко поддерживается и не требуют purificaние клеток, предшествующих культуры. Они имеют быструю первоначальную пролиферацию и не требование для специализированных протоколов среднего или активации. Фибробласты могут быть эффективно трансфецировали использованием биологического, химического и физического протоколы 4,5. Существует возможность сохранять уши до 10 дней при комнатной температуре до установления клеточных культур. Фибробластов культур способствуют визуализации цитоплазматических процессов и подходит для перепрограммирования в индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток 6.

Фибробласты являются важными клетками соединительной ткани, которые секретируют коллаген протеины и внеклеточный матрикс 7. Они обеспечивают структурную основу во многих тканях 8 и играют важную роль в заживлении ран и восстановления тканей 9,10.

Здесь мы опишем простой и быстрый (<4 ч) протокол о создании фибробластов культур из ушей и хвостов мышей 11. Протокол требует минимального мышьопыт урожай тканей (в отличие от других протоколов 12,13) ​​и может быть использован для установления культур из ушей, хранящихся в среде при комнатной температуре в течение до 10 дней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Мышей содержали в свободных от патогенов условиях в соответствии с институциональными принципов вплоть до euthanization (институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) руководящих принципов в Национальном университете Сингапура и Национального консультативного комитета лабораторных животных исследований (NACLAR) руководящих принципов).

1. Мыши

  1. Заказать одну мышь соответствующего генетического фона. Этот протокол основан на ткани, полученной от одного C57BL / 6 мыши.

2. Подготовка полной среде

  1. Подготовка полной среды путем добавления следующих компонентов для Roswell Park Memorial института (RPMI 1640): 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкМ аспарагин, глутамин 2 мМ, 1% пенициллина-стрептомицина раствора.

3. Подготовка растворов фермента

  1. Подготовьте коллагеназы D раствора в 15 мл коническую пробирку нижней.
    1. Взвесьте 10 мг коллагеназы Д. Диssolve коллагеназы D в 4 мл полной среды.
  2. Подготовка проназой решение в 1,7 мл микроцентрифужных трубки.
    1. Взвесьте 10 мг проназой.
    2. Добавьте 5 мкл 1 М Трис-буфера (рН 8,0). Добавить 1 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
    3. Долить 494 мкл стерильной воды.
    4. Инкубируйте проназы раствора при 37 ° С на водяной бане в течение 30 мин.

4. Подготовка Коллагеназа Д-проназой Mix (≤2 хвосты)

Примечание: Выполните последующие шаги в стерильных капот культуре клеток.

  1. Добавить 250 мкл раствора проназой 4 мл коллагеназы D раствора.
  2. Пропускают коллагеназы D-проназы смесь через шприц 0,2 мкм фильтр в стерильный 15 мл коническую пробирку нижней.

5. Добыча фибробластов от уха и хвост тканей

  1. Эвтаназии мышей в соответствии с соответствующими институциональными руководящих принципов.
  2. Поместите автоклавного хирургические инструменты (ножницы и пинцет) в капот культуре клеток.
  3. Добавить 10 мл полной среды в двух чашки для культивирования клеток 10 см каждый.
  4. Сокращение уши (~ 1 см) радиуса и 5 см хвост (от кончика хвоста) мыши с ножницами и инкубировать в течение 5 мин в 40 мл 70% этанола в 50 мл стерильной коническим днищем трубки.
  5. Воздушно-сухой уши и хвост, помещая их в открытом 10 см клеточной культуры блюдо в капюшоне в течение 5 мин. После сушки передачи уха и хвост штук в двух культуральных чашках помечены "уши" и "хвост", содержащий 10 мл полной среды, как описано в шаге 5.3.
  6. Удалить волосы из ушей и хвоста с помощью ножниц.
  7. Вырезать уши и хвост на куски меньше, чем 3 мм в размере, используя ножницы.
  8. Перевести нарезанные ткани в 1,8 мл флаконах криоскопической меченых "уши" и "хвост" и добавить достаточно коллагеназы решение D-проназой по объему, чтобы достичь 1,8 мл знак на флаконе.
  9. пшнурок криоскопической флаконы по горизонтали на шейкере и встряхивают образцов при 200 оборотов в минуту в течение 90 мин при 37 ° С.
  10. Через 90 мин инкубации, удалить криоскопической флаконы из шейкера и поместите флаконы в капюшоне.
  11. Добавить 10 мл полной среды в двух 10 см чашки для культивирования клеток, меченных "уши" и "хвост" друг, и положить 70 мкм ячейки фильтра в каждом блюде.
  12. Поместите усваивается уха и хвост ткани в 70 мкм ячейки фильтра в соответственно меченных блюд, приготовленных на стадии 5.11 и сильно растереть тканей с использованием 10 мл шприца для> 5 мин. Встряхнуть клеток фильтр иногда в среде мыть клетки из ячейки фильтра.
  13. Внесите суспензии клеток с каждого блюда в два 15 мл конических нижних труб помеченных "уши" и "хвост". Вымойте блюдо и фильтр с дополнительными 10 мл полной среды и добавить среду в соответствующие 15 мл конических нижних труб.
  14. Спин вниз ячейкуСуспензию в течение 7 минут при температуре ~ 580 мкг и 4 ° С с использованием охлажденного клеток центрифуги.
  15. Удалить супернатант, добавить 10 мл полной среды к осадку клеток в 15 мл коническую нижнюю трубки и клетки вновь суспендируют.
  16. Повторите шаг 5.14 и 5.15.

6. Культивирование клеточной смеси

  1. Удалить супернатант. Убедитесь, что клеточный осадок остается нетронутой.
  2. Повторное приостановить клеток в 10 мл полной среды и добавить соответствующую смесь двух 10 см чашки для культивирования клеток, меченных "уши" и "хвост".
  3. Добавьте 10 мкл раствора амфотерицина В (исходный раствор: 250 мкг / мл) в культуру.
  4. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
  5. На третий день, заменить жидкость с 10 мл свежей полной среды, содержащей 10 мкл амфотерицина для удаления мусора (фиг.1 и 2).

7. Суб-культуры фибробластов

  1. Wheп культура достигает около 70% слияния (3-4 культуры день) удаления носителя и промыть клетки с 5 мл стерильного 1x фосфатным буферным раствором (PBS).
  2. Удалить PBS и добавить 2 мл стерильной 1x решение трипсина-EDTA к клеткам.
  3. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
  4. Через 5 мин, осторожно нажмите культуры блюдо и добавить 6 мл полной среды к клеткам.
  5. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую пробирку и нижней спина трубки в течение 5 мин при температуре ~ 450 мкг и 4 ° С с использованием охлажденного клеток центрифуги.
  6. Удалить супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок клеток в 5 мл полной среды.
  7. Семенной 2 х 10 5 клеток в клеточной культуральной чашке 10 см и инкубируют клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе в течение 3-4 дней до повторяя шаги 7.1 до 7,6.

8. Подготовка к отгрузке уши

Примечание: Выполнение тон последующие шаги в стерильных капот культуре клеток.

  1. Эвтаназии мышей в соответствии с соответствующими институциональными руководящих принципов.
  2. Поместите автоклавного ножницы и пинцет в капот культуре клеток.
  3. Добавить 50 мл полной среды в 50 мл коническую пробирку нижней.
  4. Вырезать уши (~ радиус 1 см) мыши с ножницами.
  5. Перевести уши в 50 мл коническую трубку нижней (как полученного на стадии 3) с помощью щипцов.
  6. Уплотнение 50 мл коническую трубку с нижней парафильмом перед отправкой в ​​РТ в соответствующем поле.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Добыча фибробластов ткани приводит к значительному количеству ткани мусора (Рисунок 1). В отличие от ткани мусора, фибробласты придерживаться тканевой культуре пластиковых поверхностей между день 1 и 3 культуры. Среда фибробластов культур может быть безопасно изменены в день 3 культуры, которые должны значительно уменьшить уровни мусора, присутствующего в культуре (рис 2). Фибробласты отображения удлиненную морфологию и четко видимый цитоплазму (1 и 2). Митотических клеток должны присутствовать от 3 день культуры года и клетки должны достигать 70-80% клеточного слияния в течение 3-4 дней культуры. Выход из уха и хвост ткани в 10 см культуры блюдо колеблется от 4 до 5 × 10 5 (уши) и от 5 до 6 х 10 5 клеток (хвостовой) на 3-й день культуры. После третьего дня изоляции фибробластов, клетки могут быть пассировать и высевают на 2 х 10 5 клеток на 10 см блюдо культуры.

Добыча фибробластов из ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней должны привести к 70-80% слияния клеток в 5 до 6 дней культуры (рис 3). Посев клеток при 2 х 10 5 клеток на 10 см чашки для культивирования, после 5-й день должны также приводить к примерно 1 × 10 6 клеток в течение 3-4 дней культивирования. Длительное хранение не влияет на время, необходимое для фибробластов, чтобы войти старение в нашем опыте (данные не показаны).

Чтобы проверить подлинность клеток после 3 дней культивирования клетки можно метить на фибробласты маркера виментина 14. Использование протокола выше, мы регулярно получаем чистые культуры фибробластов, как указано виментина окрашивания (рис 4).

Рисунок 1
Рисунок 1. культуре фибробластов на 3 день после извлечения до изменения среды.Представительства светлое поле изображения клеток мусора (белые стрелки), присутствующие на 3-й день культуры. Изображения были получены при 100-кратном увеличении с помощью светового микроскопа. Шкалы представляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. культуре фибробластов на 3 день после извлечения после добавления новой среде. Типичные яркие полевые изображения фибробластов в день 3 в культуре. Изображения были получены при 100 × 320 × и увеличении с помощью светового микроскопа. Шкалы представляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.


Рисунок 3. культуре фибробластов на 3 день после извлечения из уха тканей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней. Типичные яркие полевые изображения фибробластов в день 3 в культуре. Изображения были получены при 100 × 320 × и увеличении с помощью светового микроскопа. Шкалы представляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Маркировка фибробластов культур для виментина. Представитель конфокальной образ уха и хвост фибробластов на 3 день культуры. Фибробласты, извлеченные из тканей были помечены для виментина (красный) и DAPI (синий). Флуоресцентные изображения были получены с помощью конфокальной микроскопиикопия. Шкалы представляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы предлагаем простой, недорогой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Извлечение должно привести к адгезивных и быстро делящихся фибробластах в течение 3 дней после выделения ткани. Важным ограничением первичных клеток старение, постоянная задержка роста 15. Использование протокола, фибробластов культуры могут быть пассировать в течение 5 6 раз, прежде чем фибробласты стать стареющей, указывается уплощение клеток, увеличение размеров (2-3 раза) и неспособность расширить.

При выполнении изоляции из фибробластов, внимание должно быть уделено во время срыва тканей, как недостаточное резки или пищеварения приведет к низкой восстановления фибробластов. Можно объединить уха и хвост фибробласты, чтобы увеличить количество фибробластов. Дополнительное ткани в том числе брюшины и легочной ткани обработанной таким же образом могут быть добавлены к увеличению тон номер фибробластов. Хотя мусор присутствует в культуре фибробластов следующей добычи, рекомендуется изменить среду только после третьего дня, как фибробласты потребуется время, чтобы присоединиться к культуре клеток блюд.

Потенциальным ограничением протокола является использование нестерильных тканей и связанной возможности микробного загрязнения. Чтобы уменьшить риск заражения, уши и хвост инкубируют в 70% этанола до сбора урожая фибробласты. Кроме того, противогрибковые амфотерицин добавляется в первичной культуре, чтобы предотвратить разрастание дрожжей и грибов, общая проблема при создании фибробластов культур. Среда также содержит пенициллин и стрептомицин, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение. С помощью этих мер предосторожности, загрязнения наблюдаются редко, даже при установлении фибробласты от ушей и хвостов, которые хранились при комнатной температуре в течение нескольких дней.

Одним из ключевых преимуществ этого протокола является Абильность генерировать фибробласты из ушей, которые были сохранены в среде при комнатной температуре в течение до 10 дней, прежде чем изоляции фибробластов. Мы наблюдали незначительно снизилась эффективность в установлении уха культуре фибробластов после 10 дней хранения (70-80% слияния будет достигнута в течение 5-6 дней по сравнению с 3-4 дней для свежевыделенными ткани). Следовательно, уши мышей можно обменять исследователями с использованием стандартного груза, хотя экспресс-перевозка рекомендуется. По нашему опыту, простота использования, чтобы получить уши и тот факт, что ткань редко используется для экспериментальных процедур часто позволяет получить доступ к ткани генетически модифицированных мышей, которые могли бы быть времени, чтобы получить в противном случае. Для хвостов эффективность восстановления фибробластов после хранения может широко варьироваться и хвосты можно использовать только, если уши не доступны для отгрузки. Наконец, большинство людей должны быть в состоянии выполнить протокол, а урожай ткани требует минимального опыта и обучения в обработке мышей.

Протокол был протестирован только с помощью мыши ткани, но в теории должны позволить поколение фибробластов культур с использованием ткани других видов, хотя протокол может понадобиться дальнейшая оптимизация.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 HyClone SH30027.01
Fetal Calf Serum HyClone SV30160.03
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Asparagine Sigma-Aldrich A4159
Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
Ethanol Merck Millipore 107017 Absolute for analysis
Collagenase D Roche Diagnostics 11088866001 From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease Merck Millipore 53702 From Streptomyces griseus 
Tris buffer (pH 8) 1st BASE 1415 Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8) 1st BASE BUF-1053 Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) 1st BASE BUF-2040-10X4L Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X Sigma-Aldrich 59418C-100ML 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2492-20ml 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors Aesculap
Forcep Aesculap AE-BD312R
0.2 μM syringe filter Sartorius Stedim 16534
70 μM cell strainer SPL 93070
Syringe plunger Terumo SS+10L
Cryovial tube NUNC 368362
1.7 ml microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 cm cell culture dish Greiner 664160 Cell culture treated dish 
15 ml conical bottom tube Greiner 188271
50 ml conical bottom tube Greiner 227261
Water bath GFL 1002
Centrifuge Eppendorf 5810R
Incubation shaker Sartorius Stedim Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope Carl Zeiss AG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3, (1), 12-24 (2015).
  2. Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15, (1), 50-65 (2001).
  3. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 9, (1), 115 (2012).
  4. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91, (2), 223-227 (2012).
  5. Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21, (11), 1527-1543 (2010).
  6. Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, (3), 367-380 (2010).
  7. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22, (20), 3791-3800 (2011).
  8. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211, (8), 1503-1523 (2014).
  9. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, (3), 219-229 (2010).
  10. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127, (5), 998-1008 (2007).
  11. Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11, (3), 460-473 (2015).
  12. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
  13. Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
  14. Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103, (4), 197-208 (2011).
  15. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24, (22), 2463-2479 (2010).
  16. Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60, (2), 477-478 (1978).
  17. Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
  18. Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60, (5), 1393-1398 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats