Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lee, S., Piao, H. H., Sepheri-Rad, M., Jung, A., Sung, U., Song, Y. K., Baker, B. J. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J. Vis. Exp. (108), e53566, doi:10.3791/53566 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Bu çalışmanın temel odak noktası genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri kullanılarak in vitro membran potansiyelleri değişikliklerin optik görüntüleme göstermektir. membran potansiyeli Görüntüleme değişiklikleri nöronal devrelerin aktivitesini okuyan heyecan verici imkanı sunar. Bir floresan yoğunluğu değişikliği membran potansiyeli sonuç değişiklikler, kameranın her bir piksel nöronal aktivitenin nonintrusive ölçümlerini sağlayan bir vekil elektrot olduğunda. Kırk yıl boyunca, organik voltaja duyarlı boyalar 1-4 zardaki potansiyel değişimlerinin gözlemlemek için yararlı olmuştur. Bununla birlikte, bu boyalar, selüler özgüllük yoksundur. Buna ek olarak, bazı hücre türleri leke zordur. Genetik olarak kodlanmış gerilim göstergeleri (GeViS) hücreleri, özellikle çalışılan floresan voltaja duyarlı prob ifade edilecek olan bu sınırlamaları aşmak.

GeViS üç sınıf vardır. GeVi birinci sınıf vo kullanırTek bir floresan proteini (FP) 5-9 veya Förster rezonans enerji transferi (FRET) çifti 10-12 biriyle voltaj algılama fosfataz alan adını ltage algılama. Sensörlerin ikinci sınıf bir floresan göstergesi doğrudan 13-15 veya elektrokromik FRET 16,17 aracılığıyla mikrobiyal rodopsin kullanır. Üçüncü sınıf iki bileşeni, bir zara bağlı AP ve zara bağlı söndürme boyasının 18-20 olan bir ikinci bileşen olan genetik bileşen kullanır. İkinci ve üçüncü sınıf nitro ve kesiti deneyleri 19,20 olarak yararlı olsa da, sensör, sadece birinci sınıf an in vivo 6 analizleri için de yararlıdır.

Bu yazıda in vitro GeViS ilk sınıfını (Şekil 1) kullanılarak membran potansiyelinin görüntüleme gösterecektir. Gerilim sensörlerinin Bu birinci sınıf in vivo görüntüleme geçiş için en kolay yoldur. GeViS u yanayaklaşık sensörlerin rodopsin sınıfından daha parlak 50 kat bir FP kaynaşmış bir gerilim algılayan bölge olan tilizing, onlar ark lambası aydınlatma kullanılarak yerine son derece güçlü bir lazer gerektiren görüntülü olabilir. parlaklık eşitsizlik diğer sonucu GeViS birinci sınıf kolayca beynin otomatik floresan aşabilir olmasıdır. rodopsin tabanlı sondalar olamaz. Sensörün üçüncü sınıf birinci sınıf kadar parlak fakat in vivo olarak uygulanması zor bir kimyasal söndürücü eklenmesini gerektirir.

Bu nedenle biz, tek bir FP (Bongwoori) 8 bir FRET çiftinin oluşan bir prob (Nabi 2) 12, bir probun satın gösterecektir. Nabi 2.242 ve Nabi 2,244 adlandırılan yeşil fluoresan verici, yonca oluşan 11 ve kırmızı flüoresan alıcıya, mRuby2, - VSFP-CR (yonca mRuby2 voltaja duyarlı flüoresan protein) kelebek versiyonları FRET bu raporda yapılarıdır

figür 1
Şekil 1. Bu Rapor (A) görüntülenmistir Genetik kodlanmış Gerilim Göstergeleri (GeViS) bir trans-membran voltaj algılama alanını ve bir floresan proteini olan GeVi dayalı bir mono FP İki Türleri. (B) trans-membran voltaj algılama etki, bir FRET verici ve alıcı oluşan bir FRET tabanlı GeVi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik deyimi: hayvan deneyi protokol KIST hayvan protokolü 2014-001 Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Ekipman Ayar

  1. Görüntüleme kurulumu
    1. Bir titreşim izolasyonu masaya ters bir floresan mikroskop yerleştirin. objektif lens ve gerilim görüntüleme için kullanılan floresan proteinleri için uygun bir dikroik ayna ve filtreler ile donatılmış bir filtre küp (1.35 sayısal diyafram ile 60X immersiyon yağı lens), yüksek büyütme kullanın.
      Not: Bu kurulum yüksek NA amaçları için kullanmak amacıyla, bir ters mikroskop kullanır, ancak dik mikroskoplar da kullanılabilir. daha yüksek sayısal açıklık (NA) objektif lens düşük NA ve böylece gürültü oranı (SNR sinyal iyileştirme ile olandan daha fazla ışık toplayan yana Gerçekten de, ters mikroskop yalnızca prob gelişimi için, bölü tepe optik sinyal olarak tanımlanabilir başlangıçta standart sapmasıkayıt floresan). Olmayan geliştiriciler için, bu tür dilim olarak veya in vivo kayıtlar uygulamalar için dik bir mikroskop öneriyoruz.
    2. Bir ışık kaynağı, hazırlayın örneğin., Xenon ark lambası, verimli Epifloresans geniş alan görüntüleme için mekanik bir deklanşör ile donatılmıştır. mount ışık kılavuzu aracılığıyla mikroskop ışık yönlendirin. ışık uyarma filtresinden geçecek ve filtre küp ilk dikroik ayna tarafından yansıtılır. Bakış 21 alanın üzerine maksimize ışık yoğunluğu eşit numune aydınlatmak için ışık hizalayın.
      Not: Geleneksel olarak, bir 75 watt ark lambası parlak aydınlatma alanları yüksek watt ampuller daha oluşturmak beri kullanılan ancak değildi. Lazerler kullanılabilir ancak tek bir dalga boyu kısıtlanır. LED'ler daha parlak hale geliyor ve aslında seçim ışık kaynağı çoklu dalga boylarını sunan ve mekanik bir deklanşör gerektirmeyen olabilir.
    3. fluoresc iki CCD kamera monteŞekil 2D'de gösterildiği gibi, ence mikroskobu.
      Not: İlk CCD kamera yüksek uzaysal çözünürlüğe sahip ve test edilecek plazma membranında GeVi ifade eden bir hücrenin belirlenmesi için kullanılır. membran potansiyelindeki görüntüleme değişiklikleri için ikinci CCD kamera, yüksek kare hızı sn (fps) başına gibi 1.000 kare olduğundan emin olun. İki CCD kamera arasındaki görüntüleme yolu geçiş yapmak için bir çift bağlantı kamera adaptörü (Şekil 2D-(3)) kullanın. Bu ayarda, bir demagnifier ikinci CCD kamera CCD çipi üzerine objektif lens görüntüyü sığdırmak için kullanılır.
    4. FRET tabanlı GeVi görüntülenmesi için ilk (yavaş) ve ikinci (hızlı) CCD kameralar arasında bir resim splitter takın. Bir filtre küp bir dikroik ayna (560 nm) ve iki emisyon filtreleri sahip takın (520 nm / 40 645 nm / 75) görüntü splitter. Bu bakış iki alan, kabul edici floresan temsil donör floresan ve başka bir neden olur. Bu s kaldırecond filtre küp tek FP ile GeVi görüntüleme sırasında.
      Not: Bu yöntemde test tek FP tabanlı GeVi FP, süper ekliptik pHluorin A227D (SE A227D) kullanan Bongwoori olduğunu. Uyarma filtresi (/ 30 472 nm), emisyon filtresi (497 nm / uzun bir pas) ve dikroik ayna (495 nm) kendi uyarma ve emisyon spektrumları 5 dayalı seçildi. Genel olarak, uyarılma ve radyasyon filtreleri dikroik ayna blokları herhangi bir uyarma ışık emisyon filtresi üzerinden iletilen ise parlak bir görüntü elde etmek için fluorofor her spektrum ile en büyük örtüşmeyi olmalıdır. FRET çifti 11 tabanlı GeVi kayıt için filtreler ve dikroik aynalar seçimi o donör ve alıcı floresan eşzamanlı gözlem için görüntü splitter ikinci filtre küpü gerektirdiğini dışında aynı prensibi izler. mikroskop filtre kutusuna yerleştirilen ilk filtre küp Clover için bir uyarım filtresi (475 nm / 23) olması gerekir. Sonra f yayılanHer iki hekimleri gelen luorescence ilk dikroik ayna (495 nm) ile ikinci filtre küp iletilecektir. İkinci filtre küp dikroik ayna (560 nm) ve her FP böylece iki farklı hekimleri gelen floresan ayırmak için iki emisyon filtreleri (Clover için 520 nm / 40 ve mRuby2 için 645 nm / 75) sahiptir.
Tek FP tabanlı GeVi
(Bongwoori)
çift ​​bazlı GeVi FRET
(Nabi 2.42 ve Nabi 2.44)
mikroskop yerleştirilen ilk filtre küp uyarma filtresi 472 nm / 30 475 nm / 23
dikroik ayna 495 nm 495 nm
emisyon filtresi 497 nm / uzun bir pas -
kiriş splitter yerleştirilen ikinci filtre küp dikroik ayna -
Emisyon filtresi 1 - 520 nm / 40
Emisyon filtresi 2 - 645 nm / 75

Tek FP Tabanlı GeVi ve FRET Tabanlı GeVi Recordings için kullanılır Tablo 1. İki Farklı Filtre Setleri

  1. titreşim izolasyonu
    1. titreşim izolasyonu masaya bileşenleri hareketli herhangi bir ekipman monte etmeyin. izole edilmemiş ekipmana bağlı olan kabloların numunenin titreşim önlemek için gevşek olduğundan emin olun.
  2. Yama kelepçe odası
    1. amacın çalışma mesafesi nispeten küçük olduğu için, ince bir # 0 kapak camı ile yama kelepçe odasının alt conta. Bu ters mikroskop kurulum bir dezavantaj.
      Not: Bir yüksek NA objektif lens sahip bir tradeoff, çalışma mesafesi azalır. specim yerleştirmek içinÇok kısa çalışma mesafesi en, kapak cam ve lamel (adım 2) mümkün olduğunca ince olması gerekir.
  3. Sıcaklık kontrolü
    1. Banyo çözeltisi 33 o C deney boyunca etrafında yamalı hücreleri korumak için sıcaklık kontrol akar emin olun.
  4. Ekipman bağlantıları
    1. yama kelepçe amplifikatör ve yüksek hızda CCD kamera Süngü Neill-Concelman (BNC) komutu kutusuna ışık kaynağının mekanik obtüratör bağlayın. Bu amplifikatör, kamera, ve aynı zamanda ışık kaynağını kontrol etmek görüntüleme yazılımı sağlayacaktır.
      Not: Elektrik ve görüntüleme bileşenleri elektriksel aktivite eş zamanlı elektrik ve optik kayıtlar için sağlamak amacıyla senkronize edilmesi gerekir.

Şekil 2,
Şekil 2. Cihazlaro kadar ulaşmadan GeViS ile gerilim Görüntüleme ışık yolu takip iş akışı, (A) 75W Ksenon ark lambası, (B) ark lambasından gelen uyarma ışık ment Kur ilk dikroik ayna tarafından uyarılma filtre tarafından filtre edilir ve daha sonra yansıtılır örnek sahne, sağ üst köşede bir gömme yavaş hız CCD kamera, bir hücre ve yama kelepçe hem seçim yardımcı olmak için kullanılan tam hücre konfigürasyonu, (C), (D) görüntü elde etme kısmını göstermektedir; (1) yüksek hız CCD kamera, (2) AP GeViS eşleştirmek ve mono FRET hem de görüntü splitter, (3) demagnifier yüksek hızda CCD kamera CCD çipi üzerine görüntüyü sığdırmak için, (4) çift bağlantı kamera adaptörü yama hücrenin belirlenmesi, (E & F) tek-AP merkezli GeVi (E) ile görüntü toplama ve FRET tabanlı GeVi için yüksek uzaysal çözünürlüğü ile görüntüleme yolu ve (5) yavaş hız CCD kamera geçmek için(F). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Geviş 2. İfade

  1. İnsan embriyonik böbrek 293 hücreleri
    1. Kültürü İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK 293), bir CO2 inkübatöründe (% 5 CO2) 37 o C'de% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) olan hücreler. 100 mm çapında ve 20 mm yüksekliğinde bir doku kültür çanağı kullanın. 2 x 10 3 kültürü başlayın - / cm2 6 x 10 3 hücre ve sonraki transfeksiyon için% 80-90 confluency ulaşana kadar kuluçkaya yatmaktadır.
    2. Transfeksiyon gününde, hücre ortamı aspire ve yavaşça Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su ile bir kez yıkanır. 1-2 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile HEK 293 hücreleri dispers solüsyonu aspire ve yavaşça c ayırmak için çanak yan dokununarşın. Taze DMEM (% 10 FBS) ekleyin ve pipetle clumped hücreleri ayırmak. hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
    3. 0.08 yerleştirin - 0.13 mm kalınlığında, 10 mm çapında bir önceden kaplanmış 24 oyuklu doku kültürü plakası poli-L-lizin ile lamelleri. 1 x 10 5 hücre / cm 2 hücre yoğunluğu az lamelleri HEK 293 hücreleri Tohum.
      Not: HEK 293 hücreleri birbiriyle gap junction oluşturabilen olduğu için, tohum sayısı izole hücreler elde etmek için gereklidir.
    4. Geçici üreticinin talimatları izlenerek bir lipofeksiyon reaktifi kullanarak bir GeVi kodlayan uygun bir gen yapısı ile hücreleri transfekte.
      Not: omurga vektörleri olarak bu adımı kullanılan pcDNA3.1 (Bongwoori) ve pUB2.1 (Nabi 2,242) için kullanılan gen yapıları. DNA kullanılan miktarı, her lamel için ng 100 idi; Bununla birlikte, transfeksiyon koşulları her GeVi test edilmesi için ampirik olarak tespit edilmesi gerekir.
  2. ayrışmış fare kalçapocampal birincil nöronlar
    1. Embriyonik gün 17 C57BL6 / N farelerden alınan hippocampi incelemek ve daha önce 22,23 açıklandığı gibi daha sonra hipokampal nöronlar ayırmak.
    2. Plaka, poli-D-lizin kaplı 0,08-0,13 mm üzerine ayrışmış nöronlar kalın / ml hücre yoğunluğu 1 x 10 5 hücre 10 mm çapında lamelleri. CO 2 inkübatör 37 o C'de inkübe hücreleri (% 5 CO 2).
    3. Daha önce tarif edildiği gibi 24, bir kalsiyum fosfat transfeksiyon reaktifi kullanarak bir GeVi kodlayan bir gen yapısı ile in vitro (DIV), 7 gün - 6'da geçici ayrışmış nöronlar transfekte.
      Not: omurga vektörleri olarak bu adımı kullanılan pcDNA3.1 (Bongwoori) ve pUB2.1 (Nabi 2,244) için kullanılan gen yapıları. kullanılan DNA miktarı, her bir lamel 1 ug idi. Yine, transfeksiyon koşulları, test edilen her GeVi için deneysel olarak tespit edilmesi gerekmektedir.
  3. ima voltaja önce ifade seviyesini kontrol edinging
    1. CO 2 inkübatör doku kültürü plaka almak ve bir Epifloresans mikroskop altında transfekte hücrelerden floresan gözlemleyin.
    2. zardan floresan onayladıktan sonra, 3. bölümünde gerilim görüntüleme için yama odasına lamel aktarın.
      Not: Voltaj görüntüleme 16 yapılır - 24 saat sonrası transfeksiyon. farklı floresan proteinleri farklı olgunlaşma süreleri var Bununla birlikte, bazı GeViS sonrası transfeksiyon daha fazla zamana ihtiyacım var. Örneğin, bu protokolde mRuby2 içeren FRET çifti mRuby2 olgunlaşması Clover 11 önemli ölçüde daha uzun sürer çünkü ifade etmek daha uzun sürebilir. verici ve alıcı hem de floresan kontrol edilmelidir.

3. Voltaj Görüntüleme Protokolü

  1. İyi zar ifade ile sağlıklı bir hücreyi seçin
    1. Mikroskobu kullanarak, bu güçlü olduğunu gösterir sağlıklı hücre (Şekil 4B) bulmakİç floresan göre membran lokalize ışık vermiştir. yuvarlak hücreler yama çalışın. Dairesel hücreler ya bölünmesi veya ölmekte ve yama zordur. sonraki yama kelepçe deneyler yardım etmek süresi genlik ve 5.0 milisaniye içinde 5.0 mV bir test darbe uygulamak.
  2. Gerilim görüntüleme için hücreyi hazırlayın
    1. yama için bir hücreyi seçtikten sonra, hücrenin üstündeki yama kelepçe pipet yerleştirin. yavaşça hücre zarına temas edene kadar pipet aşağı getirin. Yama kelepçe yazılımı 25 membran direnci 2 M? Yükselişi - Bu aşamada, 1 M? Gözlemlemek.
      NOT: Bazen iyi bir giga-ohm mühür hücre zarını dokunarak basitçe ortaya çıkabilir. Sürece Giga-ohm mühür istikrarlı olduğu gibi, o Tamam olmalıdır.
    2. nazikçe pipet aracılığıyla negatif basınç uygulanarak bir giga-ohm mühür oluşturulması. istenilen tutma potansiyeline pipet potansiyeli ayarlayın.
    3. giga-ohm mühür, görüntü inci korurkene yüksek hızlı CCD kamera ile hücre ve membran alanına doğru odaklanır.
    4. Ağız yoluyla emme darbeleri uygulayarak hücre zarını yırtılması ya da bütün bir hücre yapılandırması 26 yapmak için yavaşça şırınga.
    5. Görüntü yama bir görüntüleme yazılımı kullanarak deneysel tasarım göre bir bütün hücre kelepçe yapılandırması altında hücreyi kenetli
      1. görüntüleme yazılımını başlatın. 'CCD kazanmak' sayfasını açmak için [SciMeasure Kamera] menüsünü - [kazanmak] tıklayın.
      2. görüntüleri kaydetmek için yeni bir veri dosyası oluşturun.
      3. ardından [ANALOG ÇIKIŞ] tıklayın ve görüntüleme yapmak için bir darbe protokol dosyasını açmak için [ASCII Oku]. Verilerin ortalaması gerekiyorsa 'iç tekrarları ortalamasını' üzerine tıklayın. Ardından 'ANALOG ÇIKIŞ' sayfasını kapatın.
        Not: Bu darbe protokolü tasarlanmış ve bu aşamasından önce her bir deney amacına göre bir 'txt' dosyası olarak kaydedilmiş olması gerekir.
      4. Set özel müktesebat'CCD kazanmak' sayfasından ition parametreleri. Girdi 'edinimi için kare sayısı' ve 'denemelerin sayısı' için özel değerler.
        Not: kare sayısı edinim hızı ve nabız protokolü zamanlama ile tespit edilir. Örneğin, görüntüleme 1 kHz'de, 1000 kare kayıt süresi 1 sn eşitse.
      5. Kaydı başlatmak için düğmeye [(Optik + BNC) DATA ALIN] tıklayın. Gerilim görüntüleme gerçekleşiyor olsa da, albüm boyunca istikrarlı tam hücre yapılandırmasını sağlamak için yama kelepçe yazılım osiloskop penceresini izleyin.
        Not: GeVi en duyarlı gerilim aralığını test etmek için, mesafe kadar taşınmış / F değeri veya fizyolojik gerilim aralığı boyunca zamansal çözünürlükte sinyal boyutu, mV -170 mV ile 130 arasında değişen bir darbe protokolü adım attı voltaj darbeleri ile bir bütün hücre voltajı kelepçe deney yapmak. aksiyon potansiyelleri çözümünde GeVi performansını belirlemek için kültür prima dan uyarılmışry nöronlar, görüntü bir bütün hücre akımı kelepçe yapılandırması altında hücre.

4. Veri Toplama

  1. Kadar taşınmış / F hesaplanması
    1. görüntüleme yazılımını başlatın. Tıklayın [DOSYA] - bir veri dosyası açmak için [Okuma Veri Dosyası] analiz edilecek. Sağ tarafta Dayanma Işık Şiddeti (RLI) hücre görüntüsünü gözlemlemek
      Not: Yazılım ortalama olarak ilk 5 kare kayıt RLI belirlemek için.
    2. ekrana ölçülen akım ve gerilim değerlerini getirmek için 'Show BNC'lerine' üzerine tıklayın.
    3. duyarlı optik sinyallere sahip pikselleri belirlemek için çerçeve çıkarma işlevi kullanmak için 'Çerçeve çıkarma' ile 'RLI çerçeve' sayfa modunu değiştirin. Her piksel floresan olası değişiklikler için incelenebilir çünkü bu görüntüleme gerçek gücü.
    4. Çıkarma için iki kez puan (F 0 ve F 1) seçin. bir hücrenin hangi alanda tespitduyarlı sinyalleri gösteren potansiyel değişim membran.
      Not: Çerçeve çıkarma görüntüler için SNR sinyal zamansal ortalama her zaman noktası için birden fazla çerçeve seçerek geliştirilebilir. Yazılım, seçilen çerçeveleri alınan ortalama ışık yoğunluğunu çıkarır ve F 1 -F 0 değerleri (mesafe kadar taşınmış) hesaplar. Genellikle tek stimülasyon döneminde alınan tutma potansiyeli ve başka bir zaman noktasında elde edilen bir zaman noktasını seçer.
    5. sürükleyerek veya bilgisayar fare ile her pikseli tıklayarak analiz edilmesi gerekmektedir pikselleri belirtin. Yazılım penceresinin sol tarafında seçilen piksellerin ortalama floresan yoğunluğu grafik gösterimini gözlemleyin. 4B ve 5B çerçeve çıkarma analizinden temsili görüntüleri göstermek Rakamlar.
    6. RLI (F 0) tarafından çıkarılır piksel bölün. Kadar taşınmış / F değerleri elde etmek için [R ^ tarafından Böl] tıklayın
  2. ihracat verileri ayrıca GeVi gerilim algılama özelliklerini analiz için her voltaj adım için mesafe kadar taşınmış / F değerlerini hesaplamak. sonraki veriler için gerilim analizleri karşı böyle mesafe kadar taşınmış / F gibi grafikler çizmek için bu değerleri kullanın.
  3. 'Göster BNC'lerine' menüsünü işaretini kaldırma ile akım ve gerilim grafikleri çıkarın. Git [ÇIKTI] - standart grafik yazılımı tarafından eğri uydurma analiz için bir ASCII dosya biçiminde floresan iz ihracat [Görüntülenen (ASCII) gibi İzler Kaydet].

5. Veri Analizi

  1. GeVi Gerilim algılama özelliği
    1. Bir veri analiz programı gerilimin karşı mesafe kadar taşınmış / F değerleri çizerek gerilim grafiğinde (FV) karşı floresan değişimi çizin. Tıklayarak optik sinyalin voltaj aralığını belirlemek için bir Boltzmann fonksiyonu (Tablo 2) eğriye uyacak [Analiz] - [Montaj] - [Sigmoidal fit] - [Aç iletişim] ve ardından Boltzmann işlevini seçin.
      Not: Bir fonksiyona takılması onu possibl yapare farklı voltaj prob gerilim algılama özelliklerini karakterize etmek için veya farklı hücrelerde performanslarını karşılaştırmak için. Bu Problardan FV eğrileri sigmoid model göstermek için Boltzmann fonksiyonu bu yazıda test edilen problar için kullanılabilir.
    2. Ilk ve son değerleri işlevi tarafından hesaplanan (A 1 ve A 2) kullanarak her mesafe kadar taşınmış / F değerini normalleştirmek.
      Not: Boltzmann denkleminde, en az bir 1 ve maksimum bir 2'dir. Normalleştirilmesi için, sıfır gibi bir 1 ve biri olarak A 2 tanımlayarak kadar taşınmış / F değerlerini ayarlamak için bir elektronik tablo uygulaması yazılımı kullanın. normalize kadar taşınmış / F değerleri ortalama ve istatistiksel analiz için standart hata hesaplayın.
    3. normalize mesafe kadar taşınmış Replot / voltaja karşı F değerleri daha önce) bölümünde 5.1.1 nitelendirdi.
  2. optik cevap hızı
    1. Bir veri analizi ile adım 4.2.2 alınan ASCII dosyası) açınProgram ve zamana karşı mesafe kadar taşınmış / F iz arsa.
    2. veri analizi yazılımı 'Veri seçicinin' tıklayın ve basamaklı bir gerilim darbesi başında ve optik sinyal kararlı duruma ulaşmıştır ikinci kez noktasına karşılık gelen bir zaman noktasını seçin. tıklayarak tek ve çift eksponansiyel azalma hem bu aralığı Fit [Analiz] - [Montaj] - [Üstel fit] - [Aç iletişim], ve üstel çürüme işlevini seçin. Daha iyi uyum bildirin.
      Not: Tek veya çift üstel çürüme fonksiyonlarına uydurma olarak, τ tarafından temsil sayısallaştırılmış zaman sabitleri elde edilebilir. Bu yardımcı olacaktır denemecileri farklı gerilim göstergeleri ile yapılan kendi ölçümlerin kinetik karşılaştırın. floresan iz çift üstel bozunma fonksiyonu ile tarif edilebilir hızlı ve yavaş bileşenleri göstermek olabilir. Bu durumda, hesap farklı genlikleri ile iki zaman sabitleri ile sonuçlanacaktır.
    3. th hesaplayınE ağırlıklı τ sabitleri tek bir bileşen olan sondalar iki zamansal bileşenleri sergileyen prob kinetik karşılaştırmak.
      Not: Aşağıdaki formül ile tanımlanan bir ağırlıklı tau nispi genlik ile çarpılır nispi genlik ile çarpılır τ 1 toplamı, bir 1 artı τ 2, 2 olarak hesaplanır; denklem 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Geçici olarak transfekte hücrelerde anlamlı floresan değişimi ve plazma membranı ifade derecesi sergileyebilirler. Hatta aynı lamel bazı hücreler iç floresan çeşitli düzeylerde olacaktır. Bu durum, hücre tarafından emilen transfeksiyon ajanı miktarı muhtemeldir. Bazen çok fazla ifade apoptosis 27 sonuçlanan gelişeceğini protein yanıt yaşamaya hücreyi neden (parlak, yüksek iç floresan ile, hücreler yuvarlak). deneyci, bu nedenle iç ifade gürültü oranı (SNR) sinyali düşürür duyarlı olmayan bir floresan oluşturur beri mümkün olduğunca az iç floresan ile parlak hücreleri ve loş hücreler hem test etmek için uyarılır.

Diğer bir faktör Şekil 3. Kromomorfların olgunlaşma oranı alıcı chromoph bir floresan uyumsuzluğunu gösterirDonör kromofor (Clover) daha uzun bir olgunlaşma süresi vardır cevheri (mRuby2).

Şekil 3,
HEK 293 hücreleri Şekil 3. Konfokal Çıkan Geçici FRET Tabanlı GeVi ile transfekte Nabi2.242. (A) (B), potansiyel bir sonucu gösteren Konfokal görüntü FRET verici ve alıcı zar lokalize floresan gösteren bir HEK hücre Konfokal görüntüler mRuby2 yavaş olgunlaştırma. Sadece iki sergi mRuby2 floresan. Iken Dört hücreleri Clover floresan sergileyen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

görüntüleri konfokal mikroskop tarafından satın alındı. FRET donör için, Clover, 488 nm lazer uyarma kullanıldı ve emisyon Kaptan edildiedili- ile 525/50 nm bant geçiş filtresi. FRET kabul edici, mRuby2, 561 nm uyarım için lazer ve 595/50 nm bant-geçiş filtresi ile aydınlatılmıştır emisyonu için kullanıldı. Konfokal görüntüleme için örnekler, pH 7.4 ayarlanır, fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 paraformaldehid / sukroz çözeltisi ile işlem görmüş ve daha sonra, bir anti-solma tepkin maddesi ile monte edilmiştir.

transfeksiyon koşulları optimize sonra, varyasyon sonraki kaynak analiz edilecek faiz belirleme bölgesi geliyor. En yüksek floresans değişikliği ile hücrenin bölgelerinin belirlenmesi için kare çıkarma kullanılması genellikle kadar taşınmış / F değeri maksimize etmek için kullanılır. Alternatif hücresinden ışığı alan tüm pikselleri seçmektir. Bu gürültünün azaltılması ile sonuçlanan piksel sayısını artıran, ancak yanıt olmayan iç floresan dahil beri sinyal boyutunu azaltır. Her iki yöntem de sürece deneyci tutarlı kalır gayet iyi.

Şekil 4A tek FP tabanlı GeVi, Bongwoori ifade eden bir HEK hücre floresan değişimi gösterir. Bu basamaklı voltaj darbeleri yanıt olarak, tipik bir floresan değişikliktir. Bu verilerden yola çıkarak bir GeVi gerilim hassasiyeti arsa ve üzerinde ve tek veya çift üstel çürüme işlevi takarak farklı gerilimlerde τ sabitleri kapalı belirler. Küçük gerilim adımları SNR geliştirmek ve kayıt sırasında herhangi bir potansiyel ağartma tespit etmek HEK hücreleri görüntüleme sırasında 16 denemeler genellikle ortalaması alınır. 100 mV güçlü bir sinyal vermek, bu sondalar ayrışmış hipokampal nöronlar (Şekil 4C) test edilebilir. hipokampal nöron floresan iz, tek bir çalışmadır.

Şekil 4,
Tek FP Tabanlı GeVi Şekil 4. Gerilim Görüntüleme ifadeHEK 293 Hücreler ve Hipokampal İlköğretim Nöronlar. yüksek hızlı CCD kamera ile 1 kHz kaydedildi basamaklı voltaj darbeleri tepkileri gösteren tek bir FP tabanlı GeVi, Bongwoori (A) kadar taşınmış / F iz, içinde. (B) yüksek hızda CCD kamera ile görüntülenmiş bir HEK 293 hücre; Bongwoori ve floresans değişikliği gözlenmiştir piksel gösteren (sağ) çerçeve çıkarma görseli eksprese eden bir hücrenin (sol) istirahat ışık yoğunluğu (RLI). (C) Bongwoori ifade eden fare hipokampal birincil nöronlardan uyarılan aksiyon potansiyellerinin Optik kaydı. aksiyon potansiyelleri tüm hücre akım kelepçe modunda altında uyarılmış bulundu. Kadar taşınmış / F iz soma korelasyon piksel seçildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir temsilci fluoverici ve alıcı kromoforlarının rescence saati Şekil 5A'da gösterilmiştir. Oranlı metrik analiz sağlayarak donör ve alıcı ilişkili gürültü kaynaklarını, örneğin., Hareketi azaltmak için floresan değişimi polaritesi tersidir. Örneğin, hareket korelasyon gürültü hem donör ve akseptör floresan aynı yönde floresan bir değişiklik gösterecektir. FRET prob göre rasyometrik görüntüleme kapasitesine sahip olmakla birlikte, sadece daha parlak kromoforu analiz genellikle daha iyidir. Dimer kromofor esas kayıt gürültü artırabilir olmasıdır. Şekil 5B, bu etkiyi göstermektedir. Optik sinyal hücrede olduğu parlak Clover gelen Şekil 5B çerçeve çıkarma açıkça göstermektedir. Bunun aksine, mRuby2 floresans çerçevesi çıkartma hücre boyunca gürültü yüksek derecelerde göstermektedir. Bu nedenle, Clover sadece donör sinyali Fi bir hipokampal nöron gösterilmiştirşekil 5C.

Şekil 5,
GeVi dayalı bir FRET ile Şekil 5. Gerilim görüntüleme HEK 293 hücre ve hipokampal birincil nöronlar olarak ifade edilmiştir. (A) yüksek hızlı CCD kamera ile 1 kHz kaydedildi basamaklı voltaj darbeleri iki dalga boylarında yanıtları gösteren bir FRET tabanlı GeVi, Nabi2.242, bir mesafe kadar taşınmış / F iz. (B) Üst; Donör (Clover-RLI, Yonca-kare çıkarma) ve alıcı (mRuby2-RLI, mRuby2 çerçeve çıkarma) her FP, Bottom için iki farklı eşikleri ile işlenmiş görüntüler; aynı eşik mRuby2 göreli loşluğu göstermek için, her iki vericiden (yonca RLI, yonca çerçeve çıkarma) ve alıcı (mRuby2-RLI, mRuby2 çerçeve çıkarma) görüntüler için kullanılmıştır. Tüm görüntüler Nabi2.242 ifade aynı HEK 293 hücre alınmıştır. (C) 520 nm dalga boyu trNabi2.244 sensörü ifade eden bir fare hipokampal birincil nöron kaynaklı aksiyon potansiyelleri ası. Kadar taşınmış / F iz soma korelasyon piksel seçildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Mesafe kadar taşınmış ve mesafe kadar taşınmış / F değerleri için Değişen Işık Seviyeleri Şekil 6. Sonuçları. (A) tek FP tabanlı GeVi, Bongwoori ifade eden bir HEK 293 hücre bir görüntü, Dinlenme Işık Şiddeti gösterilen (RLI), (B) floresan izleri gösteren çekirdek ortalama Parlak iç floresan ile bir bölge, bir: iyi lokalize floresan sinyali, bölge 2 membran bölgesi: mesafe kadar taşınmış üç farklı bölgelerde, bölge 1 değerleri (F -F 0 x)d bölgesi 3:. optik sinyalin uzak bölge, (C) çekirdek gösteren floresan izleri (B) Aynı bölgelerinden kadar taşınmış / F değerleri ortalama bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

kavramlar denklemler dikkat
Fraksiyonel floresan değişimi (mesafe kadar taşınmış / F) denklem 2 Bir zaman noktasında ölçülen F 1 = ışık yoğunluğu, K = 0 ışık şiddeti tutma potansiyeli ölçülür
Boltzmann fonksiyonu denklem 3 y = mesafe kadar taşınmış / F, mV V = zar potansiyeli, V 1/2 yarı-maksimum mesafe kadar taşınmış / F, A mV membran potansiyeli 2 = maksimum değer, dx = eğim
Çift üstel çürüme işlevi Y = y, 0 + A 1 E - (T - t = 0) / τ 1 + A 2E - (T - t = 0) / τ 2 τ 1, τ 2 = zaman sabitleri, A 1, A 2 = genlikleri, T, t = 0, iki zaman noktası, y, 0 = ofset

Tablo 2. Denklemler

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

sinir sistemi çeşitli yollarla voltaj inhibisyon hafif hiperpolarizasyon, sinaptik girişi nispeten büyük bir gerilim değişikliği hafif bir depolarizasyonu ve hareket potansiyeli sonuçlar neden olur kullanır. GeViS tarafından membran potansiyeli değişiklikleri ölçmek yeteneği aynı anda nöronal devrelerin çeşitli bileşenleri analiz umut verici bir potansiyel sunmaktadır. Bu yazıda GeViS kullanarak membran potansiyelindeki görüntüleme değişiklikler için temel bir yöntem ortaya koymaktadır.

Gerilim görüntüleme değişiklikler için önemli bir anahtar plazma membranında GeVi etkin ifadesidir. Hücre içi ifade prob SNR azaltan duyarlı olmayan floresan oluşturur. transfeksiyon koşulları optimize çok optik ölçümlerin tutarlılığını artırır. yeni bir GeVi test Gerçekte, optik aktivite farklılıklar KD tamamen bağlı olduğundan emin olmak için, aynı zamanda, bilinen bir sonda test edilmesi önerilirw prob ve hücrelerin değil koşullar.

Şekil 6, gerilim görüntüleme duyarlılığını azaltmak iç floresan etkisini göstermektedir, mesafe kadar taşınmış / F değeri. Şekil 6B, mesafe kadar taşınmış tek AP göre GeVi, Bongwoori ifade eden HEK hücre değerlerini gösterir. İz 2 nispeten parlak iç floresan Şekil 6A görülen bölge 2 (mavi renk) geliyor. Bu iz yüzünden kadar taşınmış / F azalır parlak iç floresan 2 damla anlamlı Şekil 6B'de izleri kadar taşınmış / F değerleri için RLI değerlerine göre ayrıldı Şekil 6C, iz de, ancak iz 1 olarak mesafe kadar taşınmış değeri benzer düzeyine sahip değerleri. Floresan iz 3 çok küçük bir mesafe kadar taşınmış vardır ama aynı zamanda çok küçük RLI değeri (F) sahiptir. Sonuç kayıt gürültü önemli bir artış vardır yanıltıcı bir mesafe kadar taşınmış / F sinyaldir. Ayrıca, Bu örnekte kadar taşınmış göstermek için dahil edilmiştirönemli. F ile başlamak çok düşükse kadar taşınmış / F büyük bir değişim yararlı değildir.

Bir görüntü ayırıcı kullanılması tek bir CCD kamera üzerinde iki dalga boyunda eş zamanlı ölçüm sağlar. Bu büyük ölçüde prob gelişimi için FRET bağımlı floresan değişikliklerin ölçümü yardımcı olur ve kurulum maliyetini düşürür. Ancak, renk sapmaları nedeniyle, bu iki görüntü bir apochromatic amaç için ihtiyaç gerektiren odak dışında hafifçe olacak. bu yüzden en yüksek sayısal diyafram ile hedefleri seçerek daha fazla ışık daha iyi SNR, aynı zamanda floresan imajını geliştirir. Buna ek olarak, böyle bir ışık yayan diyotlar (LED) ya da SNR artırmak için lazer gibi kuvvetli ışık kaynakları kullanabilirsiniz. LED'ler mekanik bir deklanşör gerektirmez.

Bu yazıda bir tek FP GeVi ve FRET tabanlı GeVi optik sinyaller. FRET tabanlı GeVi ana avantajı rasyometrik görüntüleme ilişkili ses d azaltılmasını mümkün kılmasıdırin vivo solunum ve kan akışına ue. Floresan sinyallerin ters polarite membran potansiyeli gerçek bir değişim doğruluyor. İki kromomorfların floresan yoğunlukları genellikle önemli ölçüde değişebilir çünkü Ancak, SNR de değişecektir. Bu oranlı metrik analiz boşa ve yararlılığını 28 sınırlar. Bir FRET bağımsız sinyal 29 olabilir. Bu nedenle bazen daha iyi zar potansiyeli değişiklikleri analiz etmek için FRET kullanırken sadece parlak floresan kromofor kullanmaktır.

Gerilim görüntüleme nedeniyle hız ve kalsiyum akı ölçen kalsiyum görüntüleme ile karşılaştırıldığında zar potansiyeli değişim değişkenlik kalsiyum görüntüleme daha zordur. Nöronlarda membran kalsiyum iyonu akı ile karşılaştırıldığında çok hızlı zaman ölçekleri potansiyel değişiklikler ve eşik altı olaylar kalsiyum görüntüleme 30 ile ölçülen olamaz. Bundan başka, voltaj prob plazma membranında olmalıdırMembran potansiyeli optik raporu değişikliklere uygun prob miktar olan etkili olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak, aslında CCD çipi varabilir fotonların sayısı nispeten azdır. Bu yüksek kuantum verimliliği ve membran potansiyelindeki değişiklikler üzerine yüksek SNR ortaya çıkarır bir prob ile yüksek hız ve düşük okuma-gürültü kamera ihtiyacını gerektirir. In vitro hücre görüntüleme, araştırmacılar daha iyi in vivo ölçümlerinde çalışmadan önce GeViS potansiyel yararları ve tuzaklar anlayacaksınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted Microscope Olympus IX71
60X objective lens (numerical aperture = 1.35) Olympus UPLSAPO 60XO
Excitation filter Semrock  FF02-472/30 For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Semrock FF01-497/LP
75W Xenon arc lamp CAIRN OptoSource Illuminator LEDs and lasers are also effective light sources
Slow speed CCD camera Hitachi KP-D20BU
Dual port camera adaptor Olympus U-DPCAD
High speed CCD camera RedShirtImaging, LLC NeuroCCD-SM
Image splitter CAIRN Optosplit 2
Excitation filter Semrock FF01-475/23-25 For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2)
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Chroma ET520/40
Dichroic mirror Semrock FF560-FDi01-25X36
Emission filter Chroma ET645/75
Vibration isolation system Kinetic systems 250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching chamber Warner instruments RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) Electron Microscopy Sciences 72198-20
Temperature controller Warner instruments TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip Ted Pella 260366
Lipofection agent Life Technologies 11668-027
Calcium phosphate reagent Clontech - Takara 631312
Patch clamp amplifier HEKA EPC 10 USB amplifier
Multi-channel data acquisition software HEKA Patchmaster
Image acquisition and analysis software RedShirtImaging Neuroplex
Spreadsheet application software Microsoft Microsoft Excel 2010
Data analysis software OriginLab OriginPro 8.6.0
Demagnifier Qioptiq LINOS Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp
Confocal microscope Nikon Nikon A1R confocal microscope
Anti-fade reagent Life Technologies P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
  2. Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
  3. Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
  4. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
  5. Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
  6. Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
  7. St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
  8. Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
  9. Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
  10. Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
  11. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
  12. Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
  13. Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
  14. Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
  15. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
  16. Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
  17. Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
  18. Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
  19. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
  20. Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
  21. Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. Academic Press. 115-140 (2007).
  22. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  23. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  24. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
  25. Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
  26. Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
  27. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
  28. Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
  29. Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
  30. Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics