Kwantitatieve fundus autofluorescentie voor de beoordeling van Netvliesaandoeningen

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Armenti, S. T., Greenberg, J. P., Smith, R. T. Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases. J. Vis. Exp. (109), e53577, doi:10.3791/53577 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Het retinale pigmentepitheel (RPE) ondersteunt de functie van de sensorische retina door talrijke werkwijzen 1. Leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD) is de belangrijkste oorzaak van onbehandelbare blindheid in geïndustrialiseerde landen en wordt gekenmerkt door veranderingen in het RPE, waaronder verlies van pigment, functieverlies en atrofie. AMD en normale veroudering, de RPE accumuleert fluorescent, lysosoom afgeleide organellen die gefagocyteerde fotoreceptor fragmenten, aangeduid als lipofuscine granules. De accumulatie van lipofuscine RPE is gedacht oxidatieve dysfunctie 1 geven, maar recente studies hebben aangetoond dat de RPE morfologie blijft normaal verouderde ogen met hoge niveaus lipofuscine 2. Echter, afwijkende patronen van lipofuscine distributie, in het bijzonder het verlies van lipofuscine, zijn gedocumenteerd markers voor AMD en AMD progressie, zowel histologisch en klinisch 3,4

defecte proceszing van RPE lipofuscine is ook aangetoond voor bij bepaalde erfelijke retinale degeneratie. Patiënten die lijden aan de ziekte van Stargardt (STGD) accumuleren lipofuscin in de RPE op jonge leeftijd, uiteindelijk het ontwikkelen van visie verlies vergelijkbaar met dat in AMD 5. Deze bevindingen suggereerden dat lipofuscine accumulatie zelf kan giftig zijn en rijden RPE dysfunctie 6,7. Echter, een gedetailleerde imaging studie bij patiënten met STGD na verloop van tijd niet bevestigen dat focale lipofuscine accumulatie geleid tot latere RPE verlies 8. Daarom hoewel lipofuscine afwijkingen markers voor retinale degeneratie, een rol voor directe toxiciteit van lipofuscine blijft onbewezen.

De RPE is de meest achterste cellaag van het netvlies, maar genereert de meeste fluorescente signaal van de oculaire fundus. Opwekking en detectie van autofluorescentie (AF) afgeleid van het RPE kan worden uitgevoerd met behulp van confocale scanning laser Ophthalmoscopie (cSLO), die zorgt voor visualization van de ruimtelijke verdeling van fundus AF. Bepaalde retinale degeneratie tonen onderscheidende patronen van fundus AF en AF imaging helpt bij de diagnose en monitoring van deze voorwaarden. Hoewel de standaard AF beeldvorming is klinisch belangrijk, is kwantitatieve AF (Qaf) uitgegroeid tot een belangrijk middel voor het beoordelen van gezondheidsrisico RPE. Wij en anderen hebben een gestandaardiseerde aanpak die betrouwbaar QAF niveaus kan bepalen op specifieke netvlies locaties 9 ontwikkeld. QAF heeft potentiële toepassingen in de diagnose en monitoring van retinale aandoeningen, en kunnen ook nut in prognose en risicostratificatie. Bovendien zijn de diagnostische mogelijkheden van qaf eveneens beschreven voor bepaalde retinale aandoeningen 10-12. Hier geven we stapsgewijze informatie voor het uitvoeren van onze techniek vergezeld van een visuele demonstratie van de toepassing bij de beoordeling van gezonde en zieke ogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle patiënten die deelnamen aan deze studies werden gedaan in overeenstemming met goedgekeurde institutionele review board toezicht aan de New York University School of Medicine.

1. selectie van patiënten en de eerste voorbereidingen voor de Imaging

Opmerking: De volgende materialen nodig: 0,5% tropicamide oogdruppels, 2,5% fenylefrine oogdruppels, cSLO uitgerust met spectrale domein optical coherence tomography (SD-oktober), en interne referentiegegevens fluorescentie.

  1. Voorafgaand aan beeldvorming, juist is ingesteld cSLO voor data-acquisitie volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Monteer een interne fluorescerende referentie in de cSLO. Opmerking: De interne fluorescerende referentie, zoals gekocht van de fabrikant, wordt gehuisvest in een metalen ring is direct achter de lens geplaatst. Als een cSLO van een andere fabrikant wordt gebruikt, kan er een andere configuratie dan die welke is beschreven in zijndit protocol.
    1. Om de verwijzing in de cSLO plaatst, draai de lens om het te verwijderen, draai de machine metalen ring en vervang deze door de nieuwe metalen ring met de referentie.
      Opmerking: de interne fluorescerende referentie is essentieel voor het Qaf techniek omdat daarmee correctie voor variaties in laservermogen en detector gevoeligheid / versterking.
  3. Hebben patiënten gerekruteerd voor de beeldvorming worden onderworpen aan een routine verwijde oogonderzoek en achtergrond informatie met betrekking tot het verleden oculaire geschiedenis en de onderliggende medische aandoeningen die kunnen manifesteren met oculaire bevindingen te verkrijgen.
  4. Verwijden de pupillen met 0,5% tropicamide en 2,5% fenylefrine. Kritische stap: Homothetie leerlingen minstens 6 mm. Opmerking: Dit is essentieel voor een ononderbroken doorgang van licht, en dus voor een optimale visualisatie en meting van de fundus.
  5. Voorafgaand aan de beeldvorming, de positie van de patiënt goed op het cSLO, met de kin op de chinrest, voorhoofd geplaatst tegen de forehead rust, en laterale canthi goed uitgelijnd met de indicatoren.

2. Baseline beeldvorming van het oculair Fundus

  1. Ten eerste, de fundus beeld met nabij infrarood reflectie (IR) licht (golflengte van 820 nm) om de camera te centraliseren in de macula en het verkrijgen van ruw focus.
    1. Met de patiënt goed geplaatst, schakelt de hardware-instelling op het bedieningspaneel om IR imaging-modus, positie camera handmatig totdat de fundus is in volle focus, en neem een ​​beeld
    2. Pas de instelling op het bedieningspaneel om "IR-oktober", die spectrale domein optical coherence tomography (SD-oktober) gebruik in combinatie met IR beeldvorming om de macula voor de onderliggende ziekte te evalueren.
    3. Gebruik het heden in de imaging-venster gidsen om correct te oriënteren de oktober de IR-beeld van de fundus op. Voor een optimale SD-oktober kwaliteit te bereiken, plaatst u de camera zodanig dat beeld oktober is in het bovenste derde van de imaging-venster. Verwerven ten minste één horizontale lijn scEen door de fovea en verspreid over het gehele beeldveld.

3. Het opzetten van QAF Imaging

  1. Gebruik "High speed" beeldacquisitie. Opmerking: Deze instelling zorgt voor een snellere beeldverwerking overname, die risico op signaalverlies daalt als gevolg van beweging van de patiënt en de resulterende blokkering van het licht door de iris of oogleden.
  2. Gebruik "Mean van 9" frames. Opmerking: deze instelling kan de snelle, vastlegmodus van 9 beeldrasters, die vervolgens kunnen worden "gemiddeld" ruis en artefacten te verminderen (zie hieronder).
  3. Gebruik "30 x 30 graden" in. Opmerking: Dit verwijst naar de mate van retinale gebied dat wordt vastgelegd tijdens beeldacquisitie.
  4. Voorafgaand aan beeldvorming patiënt waarschuwen over het blauwe licht, want dit alarmerende kan op het eerste.
  5. Schakel de AF-modus en richt de camera-as zodanig dat het scherm is maximaal "gevuld" met fundus AF (minimaal verduistering van de zijden en de hoeken van het beeld).
    1. Als patiënten have moeite tolereren van de heldere blauwe licht, beginnen beeldvorming met de camera verder van het oog en dan brengen de camera langzaam in de richting van de patiënt tot de fundus is in het volle zicht.
      Kritische stap: Als licht in het binnenkomen of verlaten van het oog wordt belemmerd, verminderde signaal zal leiden. Gelokaliseerde daling is zichtbaar als asymmetrische verduistering van een afbeelding zijkant of hoek. Gegeneraliseerde verlies van het signaal wordt gezien als oogbewegingen alleen licht doorgang belemmeren.
  6. Lijn de camera zodat de AF signaal op het hoogste niveau gehele veld. Streven naar maximale signaal eerder dan scherpste beeld, maar ze ruwweg correleren. Stel de camera scherp door het verplaatsen van de cSLO om de camera handmatig of met de oftalmoscoop joystick verplaatsen.
  7. Pas de gevoeligheid / gain zodanig dat fundus AF is goed zichtbaar, maar vermijd oververzadiging. Tijdens beeldverwerving, gekleurde pixels zichtbaar in het interne referentie (aan de bovenzijde van deafbeelding) of de fundus te geven over-verzadiging en daarmee het verlies van signaal.

4. Image Acquisition

Let op: Kritische stap: het doel in beeldopname moet zijn om 2 hoge kwaliteit 9-frame stacks per sessie te verkrijgen om te controleren voor variatie tussen de afbeeldingen in een sessie. Na de herpositionering van de patiënt en de camera, het verkrijgen van een tweede sessie van twee beelden te beoordelen en controle voor de variabiliteit. Alle beelden uiteindelijk worden geijkt om de interne referentie (hieronder beschreven).

  1. Acquire beelden pas na ten minste 20 sec van "bleaching" (volledige blootstelling van het netvlies te AF licht) om de absorptie van licht minimaliseren door rhodopsine in de sensorische retina 9.
    1. Gebruik deze periode om camera uitlijning, aandacht en gevoeligheid te optimaliseren.
  2. Hebben de proefpersonen knipperen voordat elk beeld acquisitie als een frisse traan film verbetert de kwaliteit van het signaal.
  3. Vermijd oogleden in het vlak van de overname.
    Opmerking: Het kan handig zijn om handmatig geopende oogleden meer uitdagende patiënten. De auteurs bevelen aan dat een assistent deze taak uitvoert.
  4. Optimaliseer uitlijning voor elke beeldopname om ervoor te zorgen dat het licht wordt niet belemmerd door de iris resulteert in verminderde signaal.
    Let op: Als ten minste kleine beweging is heel gebruikelijk, de auteurs bevelen boete herschikking als nodig is voor elk beeld acquisitie. Het begeleiden en stimuleren van de patiënt, terwijl imaging helpt bij het verminderen beweging. De auteurs raden ook aan het gebruik van de machine voetpedaal als de "overname knop" om zo operator afleiding te minimaliseren.
  5. Post-beeldverwerking door het berekenen van de "gemiddelde" van de 9-kader stack signaal-ruisverhouding te verhogen. Bereken het gemiddelde van een stapel met de cSLO software van de optie om het gemiddelde te berekenen selecteren.
    Let op: Er kunnen stapels waar sommige frames zijn niet van optimale kwaliteit te zijn (dat wil zeggen, gelokaliseerde of gegeneraliseerde verlaagde signaal opzichte van de optimale frames), derhalve zorgvuldig inspecteren elke stapel en suboptimale frames schakel voor berekening van het gemiddelde.
    Opmerking: Mean beelden met acceptabele signaal-ruisverhouding kan uit ten minste 3 frames worden verwerkt. Het is normaal dat de zijkanten en de hoeken van elk beeld een lagere signaal dan de centrale 20 graden als gevolg van beperkingen in de cSLO zelf hebben.
    1. Als de software vraagt ​​of de exploitant wil de grijswaarden normaliseren (dat wil zeggen, strek de histogram) tussen 0 en 255, selecteert u "Nee". Hierdoor blijft ongewijzigd grijswaarden voor analyse.

5. Image Analysis

  1. Analyseer AF beelden zoals eerder beschreven met behulp van beeldanalyse-software die is ontwikkeld voor de QAF techniek (IGOR; 9). Een korte beschrijving van een typische beeldanalyse met behulp van deze software is hieronder opgenomen.
    1. Laad het QAF programma in IGOR en afbeeldingen importeren (in bmp-formaat) die uit decSLO software met pixelverhouding 768 x 768 (standaard-parameter).
    2. Selecteer de afbeelding in het drop-down menu en initiëren analyse.
    3. Verplaats kalibratie indicatoren op het beeld zodanig dat het "vizier" liggen over de fovea en de 'beugel' grenst aan de optische schijf (deze indicatoren worden gebruikt op schaal en de positie van de ROI). Wanneer goed gepositioneerd, prompts gebruiken software dan bevolken de afbeelding met de omtrek ROI rond de fovea (zie figuren 1, 2).
    4. Selecteer de optie IGOR de totale grijsniveaus van elk beeld te kalibreren met die in de interne fluorescerende referentieniveaus. Opmerking: Deze stap maakt kalibratie van machinegerelateerde factoren, zoals de elektronische nulniveau van elk beeld en de interne referentie kalibratiefactor van elke machine, evenals patiëntenfactoren, zoals leeftijd, breking en corneale kromming.
      Let op: De analyse software geeft vervolgens het vaste rREGIO 'S over de resulterende afbeelding en een QAF waarde wordt gedemonstreerd in elke regio. QAF waarden worden ook automatisch in een spreadsheet in een apart venster ingevoerd. "
    5. Genereer QAF "heat maps" door de optie in het commando prompts selecteren. Alle beelden en gegevens kunnen van de IGOR software in een Excel-spreadsheet worden uitgevoerd door het selecteren van de gewenste opties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze techniek werd gebruikt om qaf bestuderen in zowel gezonde 13 en ziektetoestanden 10-12. Bij gezonde ogen (figuur 1), wordt AF uitgezonden door de RPE relatief gelijkmatig in de fundus (Figuur 1A). Verminderde intensiteit waargenomen in het centrale maculaire gebied wegens blokkering van licht door maculaire pigment, en aan de zijden en hoeken van het beeld door de lens in het oog en de camera. Schepen verschijnen donker en moet in duidelijke focus op goed verkregen beelden. Figuur 1B toont een overeenkomstige heat map representatie van de QAF levels uit figuur 1A. Cooler kleuren corresponderen met gebieden van lagere intensiteit, terwijl warmere kleuren corresponderen met gebieden van hogere intensiteit. Maximumintensiteit wordt doorgaans in de tweede concentrische 8-ring segment (in figuur 1B). Deze regio is ook minder onderhevig aan imaging gerelateerde variability dan gebieden dichter bij het beeld grenzen en buiten het centrale gebied waar macula pigment heeft een grote invloed op Qaf niveaus. Zo is de gemiddelde intensiteiten van deze ring wordt gebruikt voor de meeste data-analyses 13. Figuur 2 toont een representatieve analyse in een oog met AMD tonen geografische atrofie (GA), een geavanceerde vorm van AMD. Deze vorm van AMD resulteert in gelokaliseerde gebieden van RPE verlies, blijkt uit aanmerkelijk verminderd of afwezig zijn AF, en veroorzaakt progressief centrale visie verlies.

Figuur 1
Figuur 1. autofluorescentie bij gezonde oog. Beeld (A) autofluorescentie (AF) van het rechteroog van een normale patiënt. OD: optische schijf, Fo: fovea, Ma: macula, Ref: interne referentie. (B) post-processing QAF kaartbeeld AF van uit (A). Warmere kleuren correleren met hogere AF intensiteit. vaste regionen worden getoond en qaf waarden van elk gebied aangegeven. 8-segment perifoveal ring gebruikt in de data-analyse wordt aangegeven door de stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. autofluorescentie in het oog weergave geografische atrofie door AMD. (A) autofluorescentie (AF) beeld van het linkeroog van een patiënt met gevorderde AMD blijkt geografische atrofie (GA) van het RPE (vertegenwoordiger gebied begrensd door onderbroken lijn). OD: optische schijf, Fo: fovea, Ma: macula, Ref: interne referentie. Opmerking duidelijk verminderd en afwezig AF in gebieden die overeenkomen met GA in de macula. (B) post-processing QAF kaartbeeld AF van uit (A). Vaste gebieden worden getoond en qaf waarden van elk gebied eenre aangegeven. 8-segment perifoveal ring gebruikt in de data-analyse wordt aangegeven door de stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Abnormale RPE lipofuscine distributie, of verhoogd of verlaagd, is een gevoelige marker van retinale ziekte en wordt meestal geassocieerd met het verlies van sensorische retina-functie. Hier beschrijven we de toepassing van qaf voor de evaluatie van RPE lipofuscine. Opname van een interne fluorescerende referentie voor het corrigeren van variabele laservermogen en detectorsensitiviteit 9 naast onze standaard beeldtechniek maakt betrouwbare kwantificering van AF niveaus. Het is ons doel dat deze methode zal helpen bij de diagnose en bewaking van retinale ziekte, en uiteindelijk de beoordeling van de effectiviteit van therapeutische interventies, zoals geneesmiddel of gentherapie. QAF kan ook helpen bij stratificatie van individuen at-risk voor aandoeningen zoals AMD.

We hebben een grote normatieve database met QAF gegevens die moeten worden gebruikt als een referentie-instrument voor de interpretatie van retinale pathologie 13 gegenereerd, en hebben ook beschreven QAF in verschillende ziekte states, waaronder de ziekte van Stargardt 10, bull's eye maculopathie 12 en Best ziekte 11. Bij gezonde netvlies, zijn er verschillende QAF niveaus tussen de etnische groepen, met aanzienlijk hogere QAF bij blanken dan zwarten en Aziaten, en toonde aan dat vrouwen hebben hogere QAF niveau dan mannen. Misschien wel het meest opvallend, qaf verhoogt als patiënten leeftijd, wat overeenkomt met RPE lipofuscin levels, zoals eerder gemeten door spectrofluorimetrie 14. Hoewel de huidige normatieve gegevens slechts betrekking tot de leeftijd van 60, blijkt dat patiënten een gemeten afname RPE lipofuscine voorbij leeftijd 70 14. Interessant blijkt niet dat veranderingen in RPE celaantal voorkomen als patiënten van 2 en dus de waargenomen afname AF kan worden veroorzaakt door een herverdeling of vermindering RPE lipofuscine 3. Het zal interessant zijn om te bepalen of deze afname in AF op oudere leeftijd correleren met een verminderde RPE functie en een verhoogd risico van AMD.

15. Een andere beperking is dat de techniek moeilijk uit te voeren en is sterk afhankelijk van de operator. Het is essentieel om consequent te verkrijgen beelden van hoge kwaliteit nauwkeurige metingen van AF niveaus. Om dit te bereiken, de auteurs bevelen strikte naleving van de imaging protocol evenals voldoende praktijk. Hoewel sommige patiënten slecht de felle lichtflitsen die nodig zijn voor AF imaging, verzekeren patiënten tolereren dat de blootstelling niveaus zijn ruim binnen de veilige grenzen is nuttig 1. Om optimale beeldvorming, is het essentieel om pupillen te vergroten tot minimaal 6 mm en meerdere beelden met vrij lichttransmissie (zie boven) te verkrijgen. Het bereiken van optimale scherpstelling en het vermijden van oververzadiging van pixels zijn ook essentieel. Nuttige methoden omvatten communicatie met de patiënt tijdens beeldvorming, gebruik van een assistent of het ooglid moet worden opgetild en gebruik het voetpedaal voor het activeren van de camera, zoals hierboven beschreven.

Samengevat, understanding de pathofysiologie van de RPE in retinale degeneratie blijft een gebied van actief onderzoek, en van potentieel belangrijke therapeutische impact. Als QAF zorgt voor een directe vergelijking van AF niveaus in beelden lengterichting verkregen, tussen patiënten en tussen de centra, het is een waardevol instrument dat kan bijdragen aan dit begrip en leveren nuttige klinische informatie. De gedetailleerde protocol hier geschetste zullen anderen helpen bij het verkrijgen van betrouwbare QAF gegevens, en dat de belangrijke klinische toepassingen van QAF onderzoekscentra en klinische retina specialisten zal aanmoedigen om gebruik te maken van de Qaf techniek te maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wij willen graag onze medewerkers, Francois Delori, Tomas Burke, en Tobias Duncker bedanken.

Onderzoek Ondersteuning: NIH / NEI R01 EY015520 (RTS, JPG), en onbeperkte middelen uit onderzoek ter voorkoming van Blindheid (RTB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectralis HRA + OCT Heidelberg Engineering
0.5% tropicamide ophthalmic solution Any brand can be used
2.5% phenylephrine ophthalmic solution Any brand can be used
Internal fluorescent reference Heidelberg Engineering
IGOR Pro software WaveMetrics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological reviews. 85, 845-881 (2005).
  2. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 4832-4841 (2014).
  3. Ach, T., et al. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 56, 3242-3252 (2015).
  4. Schmitz-Valckenberg, S., Jorzik, J., Unnebrink, K., Holz, F. G., Group, F. A. M. S. Analysis of digital scanning laser ophthalmoscopy fundus autofluorescence images of geographic atrophy in advanced age-related macular degeneration. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 240, 73-78 (2002).
  5. Weng, J., et al. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell. 98, 13-23 (1999).
  6. Holz, F. G., et al. Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin. Investigative ophthalmology & visual science. 40, 737-743 (1999).
  7. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1981-1989 (2000).
  8. Smith, R. T., et al. Lipofuscin and autofluorescence metrics in progressive STGD. Investigative ophthalmology & visual science. 50, 3907-3914 (2009).
  9. Delori, F., et al. Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 9379-9390 (2011).
  10. Burke, T. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 2841-2852 (2014).
  11. Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in best vitelliform macular dystrophy. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 1471-1482 (2014).
  12. Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence distinguishes ABCA4-associated and non-ABCA4-associated bull's-eye maculopathy. Ophthalmology. 122, 345-355 (2015).
  13. Greenberg, J. P., et al. Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 5684-5693 (2013).
  14. Delori, F. C., Goger, D. G., Dorey, C. K. Age-related accumulation and spatial distribution of lipofuscin in RPE of normal subjects. Investigative ophthalmology & visual science. 42, 1855-1866 (2001).
  15. Sparrow, J. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in mice: correlation with HPLC quantitation of RPE lipofuscin and measurement of retina outer nuclear layer thickness. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2812-2820 (2013).
  16. Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. American National Standards Institute. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision. 24, 1250-1265 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics