Quantitativa de autofluorescência de Avaliação de Doenças da retina

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Armenti, S. T., Greenberg, J. P., Smith, R. T. Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases. J. Vis. Exp. (109), e53577, doi:10.3791/53577 (2016).

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Abstract

Introduction

O epitélio do pigmento da retina (EPR) suporta a função da retina sensorial através de numerosos processos 1. degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é a causa mais importante de cegueira intratável em países industrializados e é caracterizada por alterações na EPR, incluindo perda de pigmento, perda de função e atrofia. Em AMD e no envelhecimento normal, o RPE acumula organelas fluorescentes, derivadas do lisossoma contendo fragmentos fotorreceptoras fagocitado, referidos como grânulos de lipofuscina. A acumulação de lipofuscina EPR foi pensado para indicar disfunção oxidativo 1, mas estudos recentes têm demonstrado que a morfologia do EPR ​​permanece normal em olhos idade com altos níveis de lipofuscina 2. Marcadores No entanto, padrões anormais de distribuição de lipofuscina, nomeadamente a perda de lipofuscina, estão documentados para a progressão AMD e AMD, tanto histologicamente e clinicamente 3,4

proces defeituososcante de lipofuscina EPR foi também demonstrado que ocorrem em certos degenerações retinais hereditárias. Pacientes que sofrem de doença de Stargardt (STGD) acumulam lipofuscina no RPE em uma idade jovem, eventualmente, desenvolver perda de visão semelhante ao visto em AMD 5. Estes achados sugerem que o acúmulo de lipofuscina pode ser ele próprio tóxico e conduzir RPE disfunção 6,7. No entanto, um estudo de imagem detalhada de indivíduos com STGD ao longo do tempo não confirmam que o acúmulo de lipofuscina focal levou a subsequente perda de RPE 8. Por isso, embora anormalidades lipofuscina são marcadores para degenerações da retina, um papel para a toxicidade direta de lipofuscina ainda não foi provado.

O EPR é a camada mais posterior da célula da retina, mas gera a maior parte do sinal fluorescente a partir do fundo ocular. Geração e detecção de autofluorescência (AF) derivado do EPR pode ser realizada utilizando oftalmoscopia de laser confocal de varredura (cSLO), que permite a VIsualização da distribuição espacial da FA fundus. Certos degenerações retinianas demonstram padrões distintos de fundo de olho AF, e auxiliares de imagem AF do diagnóstico e acompanhamento dessas condições. Apesar de imagem AF padrão é clinicamente importante, AF quantitativa (QAF) tornou-se um importante meio de avaliar a saúde RPE. Nós e outros desenvolveram uma abordagem padronizada que podem determinar com confiança níveis QAF em locais específicos da retina 9. QAF tem aplicações potenciais no diagnóstico e monitoramento das condições da retina, e também pode ter utilidade no prognóstico e estratificação de risco. Além disso, as capacidades de diagnóstico de Qaf também foram descritas para certos distúrbios da retina 10-12. Aqui, nós fornecemos detalhes passo a passo para a realização de nossa técnica acompanhada por uma demonstração visual da sua aplicação na avaliação de olhos saudáveis ​​e doentes.

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Protocol

Declaração de Ética: Todos os pacientes incluídos nestes estudos foram feitos lo de acordo com aprovado revisão institucional de supervisão bordo no New York University School of Medicine.

1. Seleção de Pacientes e preparação inicial para criação de imagens

Nota: Os seguintes materiais são necessários: 0,5% solução oftálmica tropicamida, 2,5% solução oftálmica fenilefrina, cSLO equipado com espectral de tomografia de coerência óptica (SD-OCT), e referência interna de fluorescência.

  1. Antes de imagiologia, adequadamente configurado cSLO para aquisição de dados de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Montar uma referência interna fluorescente no cSLO. Nota: A referência fluorescente interno, comprado ao fabricante, está alojado em um anel de metal e é colocado diretamente atrás da lente da câmera. Se um cSLO de outro fabricante, é usado, pode haver uma configuração diferente do que aquele que está descrito emeste protocolo.
    1. A fim de inserir a referência no cSLO, torcer a lente para removê-lo, retire anel de metal da máquina, e substituí-lo com o novo anel de metal que contém a referência.
      Nota: a referência fluorescente interna é essencial para a técnica QAF, uma vez que permite a correção para a variação na potência do laser e um detector de sensibilidade / ganho.
  3. Tenha pacientes recrutados para imagens submeter a um exame de rotina olho dilatado e obter informações básicas sobre a história ocular passado e condições médicas subjacentes que podem se manifestar com achados oculares.
  4. Dilatar os alunos com tropicamida 0,5% e 2,5% de fenilefrina. Passo crítico: Dilatar alunos a pelo menos 6 mm. Nota: Isto é essencial para a passagem ininterrupta de luz, e, portanto, para a visualização ideal e medição do fundo.
  5. Antes da imagem, posicione o paciente adequadamente no cSLO, com o queixo apoiado na chinrest, testa colocado contra a forehead descanso, e ângulo ocular lateral, devidamente alinhados com os indicadores.

2. Base de imagem de fundo de olho

  1. Em primeiro lugar, a imagem do fundo com luz reflectância de infravermelho (IR) próximo (comprimento de onda de 820 nm), a fim de centralizar a câmera sobre a mácula e obter o foco áspero.
    1. Com o paciente posicionado corretamente, mude a configuração de hardware no painel de controle para o modo de imagem IR, câmera posição manualmente até o fundo está em foco completo, e ter uma imagem
    2. Ajuste a configuração no painel de controle para "IR-OCT", que usa espectral-domain tomografia de coerência óptica (SD-OCT) em conjunto com imagem IR para avaliar a mácula para a doença subjacente.
    3. Use as guias presentes na janela de imagem para orientar corretamente a OCT para a imagem IR do fundo. Para obter ótimos SD-OCT qualidade, posicionar a câmera de modo que a imagem OCT é no terço superior da sua janela de imagem. Adquirir pelo menos uma sc linha horizontalum através da fóvea e que mede o campo de imagem inteira.

3. Criação de Imagem QAF

  1. Use aquisição de imagem "alta velocidade". Nota: Esta configuração permite a aquisição de imagem mais rápido, o que diminui o risco de perda de sinal devido ao movimento do paciente e resultando bloqueio da luz pela íris ou pálpebras.
  2. Use "A média de 9" frames. Nota: Esta configuração permite a rápida captura, sequencial de 9 quadros de imagem, que podem ser posteriormente "média" para reduzir o ruído e artefacto (veja abaixo).
  3. Use campo "30 x 30 graus". Nota: Isto se refere aos graus de área da retina capturado durante a aquisição de imagem.
  4. Antes de imagiologia, alertam paciente sobre a luz azul, pois isso pode ser alarmante em primeiro lugar.
  5. Ligue o modo AF e alinhar eixo da câmara de tal modo que a tela é maximamente "preenchido" com AF fundo de olho (escurecimento mínima dos lados e cantos da imagem).
    1. Se os pacientes hdificuldade av tolerar a luz azul brilhante, começar de imagem com a câmera mais longe do olho e, em seguida, levar a câmera lentamente na direção do paciente até o fundo do útero está totalmente à vista.
      Passo crítico: Se a luz que entrem ou deixem a partir do olho é obstruída, diminuição do sinal irá resultar. diminuição localizada é visível como escurecimento assimétrica de um lado imagem ou canto. perda generalizada de sinal é visto quando os movimentos dos olhos sozinho obstruir a passagem de luz.
  6. Alinhe a câmera de modo que o sinal AF está em seu nível mais alto em todo o campo. Apontar para sinal máximo em vez de imagem mais nítida, no entanto, cerca de correlacionar. Ajuste o foco da câmera movendo o cSLO para reposicionar a câmera manualmente ou com o joystick oftalmoscópio.
  7. Ajustar a sensibilidade / ganho de tal forma que fundus AF é facilmente visível, mas evitar o excesso de saturação. Durante a aquisição de imagem, pixels coloridos visíveis tanto na referência interna (localizado na parte superior doimagem) ou do fundo indicam excesso de saturação e, portanto, perda de sinal.

4. Aquisição de Imagem

Nota: passo crítico: O objetivo da aquisição de imagem deve ser a obtenção de 2 qualidade 9-quadro pilhas altas imagem por sessão para controlar a variabilidade entre as imagens dentro de uma sessão. Depois de reposicionar o paciente e câmera, obter uma segunda sessão de duas imagens para avaliar e controle para variabilidade. Todas as imagens estarão em última análise, ser calibrado para a referência interna (descrito abaixo).

  1. Adquirir imagens só depois de pelo menos 20 segundos de "branqueamento" (exposição cheia de retina à luz AF) para minimizar a absorção de luz por rodopsina na retina sensorial 9.
    1. Utilizar este período para otimizar o alinhamento da câmera, foco e sensibilidade.
  2. Têm os assuntos piscar antes de cada aquisição de imagem como um filme lacrimal fresco melhora a qualidade do sinal.
  3. Evitar pálpebras no plano de aquisição.
    Nota: Pode ser útil para manualmente as pálpebras abertas para pacientes mais difíceis. Os autores recomendam que um assistente executa esta tarefa.
  4. Otimizar o alinhamento antes de cada aquisição de imagem para garantir que a luz não é obstruída pela íris, resultando em sinal de diminuição.
    Nota: Como pelo menos uma pequena deslocação é muito comum, os autores recomendam realinhamento bem como necessário antes de cada aquisição de imagem. Orientar e incentivar o paciente enquanto imaging ajuda movimento diminuição. Os autores também recomendo o uso do pé-pedal da máquina como o botão "aquisição" de modo a minimizar a distração do operador.
  5. Executar o processamento pós-imagem, calculando a "média" da pilha de 9-quadro para aumentar a relação sinal-ruído. Calcula-se a média de uma pilha usando o software cSLO, seleccionando a opção para calcular a média.
    Nota: Pode haver pilhas onde alguns quadros não são de ótima qualidade (ou seja, ter localizada ou generalizada diminuiu sinal em relação aos quadros óptimas), portanto verifique cuidadosamente cada pilha e desmarque quadros sub-óptimos antes de cálculo da média.
    Nota: imagens médias com índices aceitáveis ​​de sinal-para-ruído pode ser processado a partir de, pelo menos, 3 quadros. É normal para os lados e cantos de cada imagem para ter sinal de menor do que os centrais 20 graus, devido a limitações dentro do próprio cSLO.
    1. Se o software pergunta se o operador gostaria de normalizar os níveis de cinza (ou seja, alongar o histograma) entre 0 e 255, selecione "Não". Isso mantém níveis de cinza inalterados para análise.

Análise 5. Imagem

  1. Analisar imagens AF como descrito anteriormente usando o software de análise de imagem desenvolvido para a técnica QAF (IGOR; 9). Uma breve descrição de uma análise de imagem típica usando este software está incluído abaixo.
    1. Carregar o programa QAF em IGOR e importar imagens (em formato .bmp) exportados dasoftware cSLO com proporção de pixel 768 x 768 (parâmetro de saída padrão).
    2. Selecione a imagem no menu drop-down e iniciar a análise.
    3. Reposicionar indicadores de calibração na imagem de modo a que os "mira" sobrepor a fóvea e do "suporte" confina com o disco óptico (estes indicadores são usados ​​para dimensionar e posicionar os ROIs). Quando devidamente posicionado, software uso prompts em seguida, preencher a imagem com ROIs circunferenciais em torno da fóvea (ver Figuras 1, 2).
    4. Selecionar a opção no IGOR para calibrar os níveis de cinza globais de cada imagem para esses níveis presentes na referência fluorescente interno. Nota: Esta etapa permite a calibração dos factores relacionados com a máquina, incluindo o nível eletrônico de zero de cada imagem e o fator de calibração de referência interna de cada máquina, bem como fatores relacionados aos pacientes, incluindo idade, refração e curvatura corneana.
      Nota: O software de análise, em seguida, exibe o r fixoegiões sobre a imagem resultante e um valor Qaf é demonstrada no interior de cada região. valores QAF também são inseridos automaticamente em um formato de planilha em uma janela separada ".
    5. Gerar QAF "mapas de calor", selecionando a opção dentro dos prompts de comando. Todas as imagens e os dados podem ser exportados a partir do software IGOR em uma planilha do Excel, selecionando as opções apropriadas.

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Representative Results

Esta técnica foi utilizada para estudar QAF em ambos os saudáveis ​​13 e doença estados 10-12. Em olhos saudáveis ​​(Figura 1), AF emitida a partir da EPR é distribuído relativamente uniforme por todo o fundo (Figura 1A). intensidade reduzida é visto na região macular central devido ao bloqueio da luz pelo pigmento macular, e para os lados e cantos da imagem devido a óptica do olho e câmera. Vasos aparecem escuras e deve estar em foco claro em imagens bem-adquiridos. Figura 1B demonstra uma representação mapa de calor correspondente dos níveis QAF da Figura 1A. cores mais frias correspondem a áreas de menor intensidade enquanto as cores mais quentes correspondem a áreas de maior intensidade. Intensidade máxima é geralmente visto no segundo anel de 8-segmento concêntrico (indicado na Figura 1B). Esta região é também menos sujeito a imagiologia relacionada variabildade do que as regiões mais próximas das bordas da imagem, e está fora da região central onde mácula pigmento tem um grande impacto sobre os níveis de Qaf. Assim, as intensidades médias de este anel são usados ​​para a maioria das análises de dados 13. A Figura 2 apresenta uma análise representativa de um olho com a AMD demonstrando atrofia geográfica (GA), uma forma avançada de AMD. Esta forma de resultados da AMD em áreas localizadas de perda de RPE, evidenciado por acentuadamente reduzida ou ausente AF, e faz com que a perda de visão central progressiva.

figura 1
Figura 1. autofluorescência no olho saudável. Image (A) autofluorescência (AF) do olho direito de um paciente normal. OD: disco óptico, Fo: fóvea, Ma: mácula, Ref: referência interna. (B) pós-processamento QAF mapa de imagem AF de a partir de (A). cores mais quentes se correlacionam com maior intensidade AF. reg fixaiões são mostrados, e os valores Qaf de cada região são indicados. Anel de 8 segmentos perifoveal utilizado na análise dos dados é indicada pela linha tracejada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. autofluorescência no olho exibindo atrofia geográfica devido a AMD. (A) autofluorescência (AF) imagem do olho esquerdo de um paciente com DMRI avançada mostrando atrofia geográfica (GA) de RPE (região representante circunscrito pela linha tracejada) a. OD: disco óptico, Fo: fóvea, Ma: mácula, Ref: referência interna. Nota marcadamente reduzida e ausente FA em regiões correspondentes às GA na mácula. (B) pós-processamento QAF mapa de imagem AF de a partir de (A). regiões fixos são mostrados, e os valores QAF de cada região are indicado. Anel de 8 segmentos perifoveal utilizado na análise dos dados é indicada pela linha tracejada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

distribuição de lipofuscina EPR anormal, quer aumentada ou diminuída, é um marcador sensível da doença da retina e é geralmente associada com a perda da função retina sensorial. Aqui, nós descrevemos a aplicação de Qaf para a avaliação de lipofuscina EPR. Incorporação de uma referência fluorescente interna para corrigir a variável de potência do laser e um detector de sensibilidade 9 juntamente com a nossa técnica de imagem padronizada permite a quantificação confiável dos níveis de AF. É nosso objetivo que este método vai ajudar no diagnóstico e acompanhamento de doenças da retina, e, eventualmente, na avaliação da eficácia de intervenções terapêuticas, como a terapia de droga ou gene. QAF também pode ajudar na estratificação de indivíduos em situação de risco para doenças como a AMD.

Temos gerou um grande banco de dados normativo de dados QAF para ser usado como uma ferramenta de referência para a interpretação da patologia da retina 13, e também descrito QAF em vários sta doençates, incluindo a doença de Stargardt 10, touro maculopatia olho 12 e Melhor doença 11. Na retina saudável, existem diferentes níveis QAF entre grupos étnicos, com significativamente maior QAF em brancos do que negros e asiáticos, e demonstrou que as mulheres têm níveis QAF mais elevados do que os homens. Talvez o mais impressionante, QAF aumenta à medida que a idade do paciente, o que corresponde com os níveis de RPE de lipofuscina, como previamente medidos por espectrofluorometria 14. Embora os dados normativa atual somente se estender até 60 anos de idade, parece que os pacientes têm uma diminuição medido em lipofuscina RPE depois de 70 14 anos. Curiosamente, não parece que as alterações no número de células RPE ocorrer como pacientes de idade 2 e assim os recuos observados em AF pode ser devido a uma redistribuição ou redução de RPE lipofuscina 3. Será interessante para determinar se essas diminuições na AF na velhice se correlacionam com a função de RPE prejudicada e aumento do risco de AMD.

1 em ratinhos5. Outra limitação é que a técnica é difícil de realizar e é altamente dependente do operador. É essencial para obter consistentemente imagens de alta qualidade para garantir medições precisas dos níveis de AF. A fim de alcançar este objectivo, os autores recomendam a estrita observância do protocolo de imagem, bem como a prática adequada. Embora alguns pacientes não toleram os flashes brilhantes de luz necessária para imagens de AF, garantindo pacientes que os níveis de exposição são bem dentro dos limites de segurança é útil 1. Para permitir a imagiologia óptima, é crítico para dilatar os alunos, pelo menos, 6 mm e a obter múltiplas imagens de transmissão de luz com desobstruída (ver acima). Atingir a focagem ideal e evitar supersaturação de pixels também são essenciais. práticas úteis incluem comunicação com o paciente, enquanto imagiologia, o uso de um auxiliar se o pálpebra precisa ser levantado e utilizar o pedal de pé para o desencadeamento da câmara, como descrito acima.

Em resumo, uncompre- a fisiopatologia do EPR em degenerações retinianas continua a ser uma área de pesquisa ativa, e potencialmente importante impacto terapêutico. Como QAF permite a comparação direta dos níveis de AF em imagens obtidas longitudinalmente, entre pacientes e entre os centros, é uma ferramenta valiosa que pode contribuir para esta compreensão, bem como fornecer informações clínicas úteis. O protocolo detalhado descrito aqui vai ajudar os outros na aquisição de dados QAF fiáveis, e que as aplicações clínicas importantes da QAF dinamizarão os centros de pesquisa e especialistas em retina clínicos para fazer uso da técnica QAF.

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Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer aos nossos colaboradores, Francois Delori, Tomas Burke, e Tobias Duncker.

Apoio à Pesquisa: NIH / NEI R01 EY015520 (RTS, JPG), e os fundos irrestritas de Investigação para Prevenir Cegueira (RTB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectralis HRA + OCT Heidelberg Engineering
0.5% tropicamide ophthalmic solution Any brand can be used
2.5% phenylephrine ophthalmic solution Any brand can be used
Internal fluorescent reference Heidelberg Engineering
IGOR Pro software WaveMetrics

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References

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