피부 마이크로 이식 세대를위한 새로운 세분화 방법 후 조직 특성

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Summary

새로운 프로토콜에있어서 인간의 조직들을 분해하고, 콜라겐 스폰지와 함께, 피부 병변의 치료에 사용할 준비 인간 생체 복합체를 야기 미세자가 이식편을 만들 설명. 또한,이 시스템은 기계적 세분화 한 후 다른 시간에 마이크로 이식편의 세포 생존율을 유지.

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Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

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Abstract

몇 가지의 새로운 방법은 급성 및 만성 피부 병변 한 단계 치료를 제공하기 위해 수술 중자가 세포 현탁액을 수득 생명 공학 분야에서 개발되어왔다. 또한, 외상, 당뇨병, 감염증 및 기타 원인으로 인한 만성하지만 급성 상처 관리 도전 남아있다. 이 연구에서 우리는 하나 환자의 피부 조직과 임상 응용 프로그램에서자가 마이크로 이식을 만들 수있는 새로운 방법을 설명합니다. 또한, 피부, 디 epidermized 진피 (DED) 및 다기관 및 / 또는 다중 조직 공여자로부터 유래 된 진피의 피부 조직의 시험 관내 생물학적 특성화 또한 수행 하였다. 모든 조직은 우리가 가능한 마이크로 이식편을 수득 할 수 있도록, 새로운 프로토콜 세분화 하였다. 특히,이 혁신적인 프로토콜 피부 환부에 도포 될 준비자가 이식 및 마이크로 콜라겐 스폰지로 이루어지는 바이오 복합체를 만들 수 있음을보고 하였다. clini다리 병변자가 생체 복합체 학적 애플리케이션은 재 epitalization 처리 및 병변의 부드러움 모두 향상을 보여주는보고되었다. 또한, 우리의 체외 모델은이 시스템을 기계적 세분화 한 후 세포 생존 능력은 문화의 최대 7 일의 시간 동안 유지되는 것으로 나타났다. 또한 세분화로부터 얻은 세포의 풀이 높은 재생 잠재력, 조직 재생 및 복구 과정에서 중요한 역할을 발휘하는 중간 엽 줄기 세포를 포함한 여러 세포 유형으로 구성되어, 유동 세포 계측법 분석으로 관찰 하였다. 마지막으로, 우리는 한천 요리를 배양 할 때이 절차는 마이크로 이식의 불임을 유지 체외에서 보여 주었다. 요약하면, 우리는 의사가 가능한 멸균 일반적인 생물학적 scaffo으로 단독으로 또는 조합하여 적용 할 수있는 마이크로 - 도관을 사용하여 하나의 준비 단계에서 획득하는 새로운 재생 방식은 유망한 수단이 될 수 있다는 결론LDS.

Introduction

지난 몇 년 동안, 몇몇 새로운 방법은 급성 및 만성 피부 병변 원스텝 치료를 제공하기 위해 수술 중자가 세포 현탁액을 수득 생명 공학 분야에서 개발되어왔다. 또한, 외상, 당뇨병, 감염증 및 기타 원인으로 인한 급성하지만 주로 만성 상처 관리 도전 남아있다. 만성 상처 의료 시스템 전 세계적으로 1 막대한 재정 부담의 원인이 심각한 글로벌 건강 문제가 될 것을 장착 증거가있다.

피부 병변의 치료 성공률을 높이기 위해 (셀룰러 인핸스 포함) 광범위한 조작이없는 무균 상태의 유지는 즉시의 손상된 영역에 도포 될 수있다 세포 현탁액을 생성하기 위해 필수적인 환자함으로써 이러한 세포 공장으로 클린 룸에서 더 이상 처리를 피하는. 성작은 피부 생검, 연삭, 원심 분리 등의 분리 방법 (예를 들어, 효소 또는 기계)로부터 arting 자주 성장 배지에서 배양 될 수있는 세포 현탁액을 얻기 위해 사용된다. 이들 모든 방법은 일반적으로 셀 구조를 강조하고, 세포 생존율의 감소를 초래 실행 시간이 필요하다. 또 다른 중요한 양태는 손상된 부분을 복구하는, 예를 들어, 임상의에 의해 사용될 준비자가 세포 현탁액을 수득한다. 또한, 잘자가 ​​조직 이식은 결국 유도와 전도 2, 3의 원리에 의해받는 사이트에서 살아 남기 위해 전송 절차를 살아남을 것으로 설정됩니다. 이상적인 이식 조직은 쉽게 사용할 수 있으며 낮은 항원과 공여부의 이환율 (4)이 있어야합니다.

이 증거에 기초하여, 본 연구의 목적은 제 적합자가 생체 복합체를 만드는 것이었다조직 복구에 임상 응용 프로그램입니다. 이를 위해,이 프로토콜에 의해 세분화 된 피부 조직으로부터 개시자가 미세 이식을 구하는 새로운 방법을 설명한다. 사례 발표도 여기에 콜라겐 스폰지와 함께이 프로토콜에 의해 얻은자가 미세 이식의 임상 응용 프로그램으로 설명한다. 이 방법은 이미 사람 조직 (5)의 기계적인 세분화 효율적인 것으로보고되고있어 이식 및 피부 조직 6,7의 재생뿐만 아니라 구강 악안면 외과 8-10에 결합 조직의 재생 치료를 위해 임상 적으로 사용되어왔다 .

또한,이 연구의 목적은 초이 프로토콜에 의하여 자신의 세분화 후에 피부 조직의 생물학적 특성이었다. 이 목적을 위해 피부 조직의 다른 동종 샘플은 다른 여러 기관의 트렁크 지역에서 유래및 / 또는 다중 조직 기증자는 에밀리아 로마 냐 지역 스킨 은행에서 이식을위한 조직 (CNT 2013) 수확, 처리에 국립 규칙을 다음과 분산 처리 하였다.

CASE 프리젠 테이션 :

자동차 사고로 인한 복합 외상을 보여주는 35 세 여자 환자는 앙 코나 병원의 중환자 실에 입원했다. 환자 인해 열린 상처와 외부 고정 안정화 복합 골절로 다리에 감염을 보였다. 두 급진적 인 변연 절제술을 수행하고 상처 음압 치료 (VAC 치료) 후 깨끗한되었고, 골막 건강 나타 났을 때, 우리는 회복 두 달 후에 프로토콜을 적용 하였다. 이 시스템을 세분화 한 후, 얻어진 마이크로 이식이어서 환부 복구에 미치는 효과를 조사하기 위해 주입 된 콜라겐 스폰지 바이오 복합체를 만들기 위해 사용되었다.

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Protocol

윤리 문 : 프로토콜의 임상 응용 프로그램이 환자의 피부자가 조직의 사용을 필요로하기 때문에, 시험 관내에서의 특성은 수확, 처리에 국가 규정의 지침에 따라 에밀리아 로마 냐 지역 스킨 은행에서 동종 피부 조직에 임상 적으로 사용되기 전에 수행 된 및 이식을위한 조직 (2013 CNT)를 배포.

임상 응용 프로그램 1. 바이오 복합 건물

주 :이 프로토콜은 임상 Rigeneracons (조직 장애 물질) 및 Rigenera 머신 (티슈 교란 시스템) (도 1A)의 사용에 기초한다. 조직 장애 물질은 약 50 미크론의 컷오프 육각형 블레이드 및 필터링 세포의 세포 외 기질 성분에 의해 제공되는 격자를 사용하여 조직의 작은 조각을 방해 할 인체 조직의 생물 의학적 장애 물질이다.

  1. BI를 통해 환자의 skinsamples를 수집opsy 펀치 (도 1b) 및 미세자가 이식 6,7,9을 얻기 위해 각각의 조각에 대한 생리 식염수 1 ㎖를 첨가들을 분해 (또는 단계 2.1 참조).
  2. 콜라겐 스폰지에 마이크로 이식 1 ㎖를 놓습니다 (그림 1C) toform 바이오 단지 임상 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
  3. 배양 5 % CO 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 10 % 태아 소 혈청으로 보충 된 DMEM 배지 6 ㎖의 존재하에 콜라겐 스폰지 마이크로 이식편의 다른 한 용액.
  4. 배양 3 일 후, RT에서 10 분간 0.3 % 파라 포름 알데히드 바이오 복합체를 고정한다. 샘플에 직접 특정 디스펜서 파라핀을 붓고. 5 ㎛의 두께 마이크로톰으로 슬라이스를 구하여 유리 슬라이드에 직접 넣어.
  5. 20 ml의 크실렌 (시판 - - m - 크실렌 (40의 혼합 - 65 %), p- 크실렌 (20 %), O - 크실렌 (20 % (15)를 포함하는, 조직 학적 분석을위한 유리는 5㎛ 파라핀 슬라이스 빠져 ) 및 ETH일 벤젠 (6~20%), 3 분마다 톨루엔, 트리메틸 벤젠, 페놀, 티 오펜, 피리딘 및 황화수소)의 흔적.
  6. 디 paraffinizing 대한 다음 탈 이온수 (1 시간, 1 시간, 80 % 에탄올, 70 % 에탄올을 1 시간 동안 위해 1 시간, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올) 에탄올 감소 학년 슬라이스 (100 % ~ 70 %)을 담가 및 섹션을 돌리는.
  7. 1 1g / L Ematoxylin 2 ㎖ - - 1 섹션을 얼룩 2 분이어서 모든 Ematoxylin 흑자를 제거하기 위해 물에 헹군다.
  8. 에탄올 70 % 혼합 농도의 1 %에 에오신 Y 알코올 용액을 5 분간 물에 희석 - 4 섹션을 얼룩.
  9. 각 슬라이드 섹션 에오신 Y 2 ㎖ 및 실행 수돗물에서 헹구어 - 1을 사용합니다.
  10. 에탄올의 성적을 증가 섹션을 빠져 기반 장착 mediumand 100X 배율 (그림 1D)에서 빛을 현미경으로 관찰과 함께 1 시간에 대한 크실렌의 통로, 커버 슬립 후, 마지막으로하고 (단계 1.6 참조).
  11. </ OL>

    2. 컬렉션, 세분화 및 조직의 생체 외 분석에서

    1. 피부 분절을 사용하여, 각각 0.6 mm, 1mm 또는 4 개의 다기관 및 / 또는 다중의 트렁크 영역에서 두께 2mm 독립적 피부 조직 유두 디 epidermized 진피 (DED) 또는 망상 진피 (진피) 걸릴 수확, 처리 및 이식을위한 조직을 배포에 국가 규칙 (CNT 2013) 다음 40~55년 범위에서 조직 기증자.
      1. 부드럽게 5 분 동안 궤도 통에 접시에 이르렀 0.9 % NaCl 용액에서의 모든 샘플을 씻어.
      2. 5 mm 생검 펀치를 사용하여, 피부 조직, 진피와 DED 직경이 균일하며, 세분화 전에 모든 조직 표본 무게 샘플을 생성한다.
      3. 세분화에 대한 생리 식염수 1.5 ml를 첨가 조직 장애 물질의 피부 조직, DED 또는 각각 진피의 팔, 서너 균일 한 샘플을 삽입합니다.
      4. 다른 수행모든 조직 시료 세분화시기는 표 1에 나타내었다.
      5. 컨트롤과 같은 손상 조직 샘플에서 파생 된 펀치 생검의 상대방 번호를 사용합니다.
      6. 기계적 세분화 후 별도로 12 웰 플레이트의 한 웰에 각 샘플을 마이크로 이식 장소를 포함하는 식염수 대기음. 그대로 제어 펀치 생검에 대해 동일한 프로토콜을 수행합니다.
      7. 각 샘플로 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 항생제가 보충 된 RPMI 1640 배지 1 ㎖를 추가한다.
      8. 즉시 세포 생존 능력을 평가한다. 각 웰 (각각 피부 조직, DED 또는 진피 여덟 서너 균일 한 샘플의 동시 세분화하여 얻어진) 마이크로 - 그래프트를 포함하는 0.5 밀리그램 / MTT의 ㎖ (3- [함유 배지 1 ㎖를 추가 4,5 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5- 디 페닐 브로마이드) 용액 및 CO 2 / 5 % 공기의 분위기에서 37 ℃에서 3 시간 동안 배양한다. 그대로 제어를위한 동일한 프로토콜을 수행생검 펀치.
      9. 배양 후, 배지 모두 함유 MTT를 제거하고 10 분 동안 각 샘플 1 ml의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 추가한다.
      10. 큐벳에 각 샘플 및 DMSO를 전송하고 분광 광도계를 사용하여 570 nm에서 광학 밀도 (OD)에서 참조하십시오. 570 nm에서의 흡광도의 비율 세분화 전에 사용 조직 g (GR)에서의 중량으로 세포 생존율을 계산한다. 그대로 제어 펀치 생검에 대해 동일한 프로토콜을 수행합니다.
    2. 기계적 세분화 한 후 피부 조직을 단일 공여체 DED 진피 샘플로부터 유래 된 마이크로 그래프트 함유 식염수 대기음.
      1. 12 웰 플레이트의 단일 잘 또는 각각 세포 생존 능력 테스트 및 형태 학적 분석을위한 문화 플라스크에 개별적으로 각각의 샘플을 놓습니다.
      2. 5 % CO 2 / AI 분위기 하에서 37 ℃에서 1 ㎖ (12 웰 플레이트) 또는 5 ㎖ 1640 배지는 10 % FBS로 보충 된 RPMI로 (배양 플라스크) 항생제를 추가 배양 마이크로 이식편24 시간 7 일 연구.
      3. 24 시간 또는 칠일 (반복 2.1.8-2.1.10 단계) 후 세포 생존 능력을 평가합니다.
      4. 24 시간 및 플라스크에 문화의 7 일 후 광학 현미경으로 세포 현탁액의 존재를 평가하는 형태 학적 분석을 수행합니다.
      5. FACS 분석 (6)에 의해 CD146, CD34 및 CD45 항원을 포함하는 중간 엽 및 조혈 세포 마커에 양성을 위해 진피의 샘플을 분석 할 수 있습니다.
      6. 층류 후드 시드에서 완전히 분해되지 각각 조직 샘플의 상대 작은 조각 (피부 조직 각각 DED 또는 진피 여덟 서너 균일 한 샘플의 동시 세분화시켜 얻음) 각 마이크로 그래프트 (> 크기가 50 마이크론 5 % 양 혈액 배지 100 μl를 포함 컬럼비아 한천 플레이트에 세분화 과정) 후.
      7. 사흘 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션하고 멸균을 평가하기 위해 컬럼비아 한천 플레이트상에서 미생물 학적 분석을 수행 (11).

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Representative Results

이 예비 연구에서, 제 목표 사용할 준비 바이오 복합체를 제조하는 콜라겐과 같은 생물학적 지원과 함께 인간자가 미세 이식의 능력을 조사 하였다. 이러한 바이오 복합체는 환자에 이식했다 자동차 사고 (도 2A)에 의한 다리 병변 30 일 (도 2b) 후 조직 복구와 관련된 완전한 재 상피화 관찰되었다. 또한, 임상 후속 임상 응용에 평행. 5개월 (도 2C) 후에 손상된 영역 좋은 감촉과 유연성을 보여 관내 연구는 또한 피부 조직으로 다른 피부 조직의 세포 생존율을 평가하기 위해 수행했다 , DED 및 진피 전에이 시스템에 의해 세분화 한 후. 특히, 각각의 조직 유형의 계정에 서로 다른 두께를 가지고, 여덟 임계피부 조직, 진피 DED위한 단일 단계로 처리 될 수있는 네 개의 세 생검 각각 설치되었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 생검 설정된 수는 양호한 세포 생존을 유지하기 위해 세분화의 최적 조건을 식별하기 위해 자신의 생물학적 특성에 따라, 네 개의 서로 다른 시간 세분화 하였다.

조직 처리 자체가 필연적으로 손상 조직에 비해 세포 생존율의 손상을 유발하지만,이 시스템으로 실행 기계적 세분화 피부, DED 및 진피의 모든 샘플에서 30 %의 세포 생존율의 평균치를 유지하는 것 22 OD / GR에서 7 OD / GR FO, 손상 조직 (그림 3B)에 대해 서로 다른 시간에 (그림 3A)에서 평가 (손상 피부 조직 92 OD / GR 29 OD / GR 세분화 이후의 의미R 그대로 세분화에 마지막으로 세분화에 대하여 그대로 진피) 2.7 OD / GR 16 OD / GR에서 대한 DED. 따라서, 이러한 예비 결과는이 시스템이 즉각적으로 세분화 한 후 세포 생존율의 감지 레벨을 유지할 수 있음을 보여준다. 세포 생존의 세분화의 효과도 관찰 24 시간, 7 일 동안 배양 한 결과를 가변 조직 표본에서 조사 하였다. 특히, 피부 조직 샘플에서 세포 생존 능력의 실질적인 변화가 시작 시간 (T 0) (도 4a)와 비교하여 균질화 및 배양 시간에 의해 독립적으로 관찰되지 않았다. 한편, DED 샘플 감소 생존 배양 24 시간을 관찰 하였다 놀랍게도 세포 생존을 배양 7 일 (도 4B) 후 복원 시간 (T 0)를 비교 한 후에 시작. 유사한 결과는 또한도 4C (진피 샘플 관찰). 각 샘플을 이중 및 표 2에보고 된 값으로 평가 하였다.

세포 생존 능력에 더하여 표 3에보고 된 결과에 기초하여, 우리는 피부 조직의 세 유형 세포 생존을 유지하기 세분화의 적절한 시간을 식별 배양 세포 현탁액의 형태 학적 특징은 또한 단일 셀을 식별 평가 조직 세분화에서 24 시간 후이 칠일 모두 피부 조직과 DED / 진피 샘플에서 섬유의 잔류 물이 관찰되었다 후 동안 (그림 5 AB). 또한, 유동 세포 계측법 분석에 의한 셀 특성은 균질화 후 진피 샘플에서 수행 하였다 : 내피 세포 및 중간 엽 줄기 세포를 포함한 여러 세포 유형으로 구성된 셀 이종 풀 (도 6)을 동정 하였다. 또한, 박테리아 증식의 유무를 확인 하였다 I n은 모든 세분화 된 샘플은 마침 좋은시기에 실험 절차 (그림 7)의 불임을 입증, 한천 요리에 시드.

그림 1
그림 1. 바이오 복합체 건물 조직 조직 교란과이어서 분해 된. 바이오 복합체 콜라겐 스폰지 마이크로 이식과 함께 수득 하였다 환자의 병변 면적에서 더마의 작은 조각의 방해 시스템 (A)과 모음 의 병변 수리 (C)에 사용하는 인간의 패치가 준비 얻었다. (D) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색을 대표하는 바이오 복합 DMEM 배지에서 3 일 동안 배양과 현미경의 세계에서 관찰 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.

콘텐츠 "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 그림 2
C (다리 병변 콜라겐 환자로부터 얻은 마이크로 이식으로 이루어진 바이오 복합체에도 2 바이오 복합체 응용 레그 병변 (A)에 도포하고, 권선 30 일 (B) 및도 5 개월 이후 평가 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. C 엘 생존은 즉시 본래 피부 조직 (B). 피부에 대한 피부 조직 (A)의 세 가지 종류의 서로 다른 시간에 세분화 한 후, 네 개의 다른 기증자로부터 파생 DED 및 진피 조직은 조직 disru로 세분화했다같은 ptors 텍스트의 해당 섹션에 나타냅니다. 세포 생존율은 각각의 조직 샘플에 대해 중복으로 수행 MTT 검사로 평가 하였다. 그래프는 각 샘플에 대해 중복으로 수행 네 가지 실험을 나타낸다. 결과를 광학 밀도 (OD) 및 조직의 그램 (GR) 사이의 비로서 표현되며 표준 편차가 조직의 광학 밀도 (OD)와 그램 (GR) 사이의 비율을 계산 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
피부 조직 (A)의 분해 된 샘플 그림 4. C의 엘의 생존 수준은 DED (B) 및 시간 (T 0)를 시작으로 진피 (C) 및 24 시간 7 일 동안 비주류 문화 후. 조직은 조직을 균질화 하였다 바랭이 등의 교란텍스트의 해당 섹션에 테. 분해 샘플을 세분화 한 후 24 시간, 7 일 동안 배양하고이어서 유지 RPMI 1640 배지, 5 % CO2 / 공기 분위기 하에서 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 및 항생제가 보충. 전술 한 바와 같이 세포 생존율은 MTT에 의해 평가 하였다. 그래프는 하나의 공여체 유래의 피부 조직, 진피와 DED 각 샘플에 대해 중복으로 수행 실험을 나타낸다. 그 결과 조직의 광학 밀도 (OD)와 그램 (GR) 사이의 비율로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
분해 된 피부 조직 그림 5. 형태 학적 분석 (A) 및 DED / 진피 (B) 후 24 시간과 숭배의 7 일 URE. 형태 학적 분석은 24 시간 피부 조직과 DED / 진피 조직에 RPMI 매체의 존재 문화의 7 일 후 광학 현미경을 사용하여 수행 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
유동 세포 계측법 분석하여 그림 6 셀 특성화. 기계 세분화 한 후, 진피에 의해 얻어진 마이크로 이식은 문화에 넣어 7 일 CD146, CD34 및 CD45 항원을 포함한 중간 엽 및 조혈 세포 마커에 양성을 분석 한 후. 한 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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분해 된 피부 조직, DED와 진피 샘플 그림 7. 미생물 분석. 세분화 된 조직 샘플의 작은 조각은 층류 후드에서 5 % 양 혈액 (BIOMERIEUX 회사)의 추가 컬럼비아 한천에 접종하고 사흘 동안 37 ℃에서 배양 하였다 프로 시저의 불임을 미생물 학적 분석을 수행하고 평가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

조직 샘플 세분화 TIMES (초 / 분)
피부 30 초
1 분
2 분
5 분
DED 1 분
2 분
5 분
10 분
진피 1 분
2 분
5 분
10 분

피부의 세분화에 사용되는 4 가지 타임즈 표 1. 도식 표현은, DED 및 피부의 진피. 여덟, 네 세 펀치 생검은 DED와 진피는 각각 자신의 생물학적 특성에 따라 네 개의 서로 다른 시간에 세분화 하였다.

피부 조직
24 시간 7 일
(2) ' 5 ' 2 ' 5 ' 2 ' 5 '
37.1 41.07143 41.07143 65.78571 41.14286 37.42857
35.8 43.82143 36.60714 66.5 41.46429 38.67857
DED
T 0 24 시간 7 일
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 7.85567
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
진피
24 시간 7 일
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 2.77193 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

한 생물 복제에 대한 외경 /의 GR으로 표현 값 표 2. 범위. 피부 조직에서 세포 생존 능력의 값은, DED와 진피는 시작 시간과 표시 배 기계적 세분화 후 평가 하였다. 실험 결과는 하나의 중복 수행 및 조직의 광학 밀도 (OD) 및 g (GR) 사이의 비로서 표현 된 대표.

표본 세분화 시간
피부 조직 5 분
DED 1 분
더마 2 분

세분화의 최고의 시간 표 3. 도식 표현은 Differe에 좋은 세포 생존 능력을 유지하기 위해NT 조직 샘플. 피부 DED 진피 조직 샘플 최적 세포 생존율을 보여 세분화 각각 5, 1, 2 분 후.

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Discussion

이 예비 연구. 이미 마이크로 이식 임플란트 (9)의 효과 (10)를 최적화하는 다른 임상 적 적용에보고 된이 프로토콜에 의해 얻어진 마이크로 이식은 콜라겐 스폰지와 결합 될 수 있다는 것을 보여 주었다 특히, 본 연구는 생체의 용량을보고 -complexes, 임상 응용 프로그램에서 30 일 후에 다리 병변의 상처 치유를 보조하기 위해, 마이크로 이식 및 콜라겐 스폰지로 구성. 또한, 체외 결과는 즉시 기계 세분화 후 24 시간과 문화의 7 일 후 모두 상당한 세포 생존 능력을 유지, 세 가지 다른 피부 조직을 해리하는이 프로토콜의 효과에 대한 증거를 제공합니다.

균질화 이런 종류의 후 세포 생존 능력의 유지 보수는 광범위한 조작을 방지 단 하나의 단계 멸균자가 미세 이식에서 얻을 수 있습니다. 이 증거는 일치한다다른 최근의 서류와 함께하는 체외에서이 프로토콜의 효능은 골막, 심장 심방과 안구 (5)의 외 직근의 생검을 포함한 조직의 다른 유형, 또한 시험 하였다. 특히, 아마도 10 % 소 태아 혈청 배지의 사용으로 배양 7 일 후 DED 진피 샘플에서 증가 된 세포 생존 능력을 관찰 하였다.

세포 생존의 유지뿐만 아니라,이 시스템은 안전하고 사용하기 쉽고 잠시 같은 효소와 같은 세포 분리 전통적인 방법에 대하여 기계적 셀 구조의 붕괴를 방지하는 조직의 상이한 유형들을 분해 할 수있다 실행의 긴 시간을 필요로 소화. 또한,이 시스템은 50 미크론의 차단으로 셀을 선택할 수 있으며,이 범위가 포함되어 있기 때문에,이 형태는, 마이크로 주사 이식의 성공을 고려하여 매우 중요많은 세포 유형으로 분화 한 후 병변 수리를 개선 할 수 전구 세포. 이 프로토콜은 기증자의 주제는 이러한 미세 이식의 수용체 것을 주어, 우리는 가능한뿐만 아니라자가 미세 이식을 얻을뿐만 아니라 수 있습니다. 자가 미세 도관을 얻기 위해이 시스템의 용량이 특히 그것 이외의자가 치과 펄프 줄기 세포의 이식 (DPSCs)에 도시 된 치과 분야에서보고 된 infrabony 결함 치주 수리 위축성의 재생에 기여 포함 5,6 상악. 상처 치유 과정을 개선하기 위해 이러한 마이크로 이식편의 기능은 앞서 중재 또는 수술 후의 합병증 4 복소 상처 관리보고되었다.

자가 조직 이식 및 마이크로 사용할 준비의 사용에 대한 다른 장점은 확실히 피부 병변 그들의 후속 임플란트의 관점에서 무균 상태의 유지이다.

결론적으로,이 문서에 기술 프로토콜은 본 연구에 나타난 것과 같은 급성 / 만성 피부 상처의 치유를 향상시키기 위해 임상 적 개입에 사용 인간 마이크로 이식 조직 준비를 생성하는 능력을 나타내었다. 시험 관내 결과를 할 수있는 가능성에 생성 가능한 마이크로 이식도보고되고이 매개 변수는 조직 복구 성공 비율을 증가시키는 의미가 분명히있다. 이와 함께, 데이터는이 새로운 시스템은 피부 상처 관리 신속하고 안전한기구를 필요로하는 의사에 대한 유망한 도구로 간주 될 수 있음을 보여 주었다.

지금이 순간,이 특정 응용 프로그램의 프로토콜에 대한 특정 수정 또는 제한은 피부가 사용하기 쉬운 조직이 나타내는 주어 다른 연구에서 우리는 다른 피부 병변 6,7 동일한 프로토콜의 효능을보고, 거기에 없습니다

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Disclosures

저자 안토니오 그라는 생산과 Rigenera 시스템을 판매하고 인간의 뇌파 Srl의 과학 감독이다. 저자 레티 지아 Trovato는 인간의 뇌파 Srl의 과학 부문의 협력자입니다

Acknowledgments

저자는 유동 세포 계측법 분석을 수행하는 연구에 기여에 대한 감사 박사 페데리카 Zanzottera를 바랍니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

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References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
  2. Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
  3. Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
  4. Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18, (2), 59-70 (2001).
  5. Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. (2015).
  6. Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4, (4), 268-274 (2014).
  7. Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1, (3), 3 (2014).
  8. Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34, (3), s27-s33 (2014).
  9. Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1, (2), 20 (2013).
  10. Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17, (5), 644-647 (2013).
  11. Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).

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