त्वचा माइक्रो Grafts पीढ़ी के लिए एक नई विधि disaggregation के बाद ऊतक विशेषता

Medicine

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Summary

प्रोटोकॉल एक नई विधि मानव ऊतकों disaggregate और ऑटोलॉगस सूक्ष्म ग्राफ्ट कि, कोलेजन स्पंज के साथ संयुक्त, त्वचा के घावों के उपचार में उपयोग के लिए तैयार मानव जैव परिसरों को जन्म दे बनाने के लिए वर्णन करता है। इसके अलावा, इस प्रणाली यांत्रिक disaggregation के बाद अलग अलग समय पर सूक्ष्म grafts के सेल व्यवहार्यता को बरकरार रखता है।

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Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

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Abstract

कई नए तरीकों, सर्जरी के दौरान ऑटोलॉगस सेलुलर निलंबन प्राप्त करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में विकसित किया गया है क्रम में तीव्र और जीर्ण त्वचा के घावों के लिए एक कदम और उपचार प्रदान करने के लिए। इसके अलावा, पुरानी लेकिन यह भी तीव्र आघात, मधुमेह, संक्रमण और अन्य कारणों से उत्पन्न घावों के प्रबंधन, चुनौती बनी हुई है। इस अध्ययन में हम एक भी रोगी की त्वचा के ऊतक और उनके नैदानिक ​​आवेदन से ऑटोलॉगस सूक्ष्म ग्राफ्ट बनाने के लिए एक नई विधि का वर्णन है। इसके अलावा, इन विट्रो त्वचा, डे-epidermized डर्मिस (डेड) और बहु अंग और / या बहु ऊतक दाताओं के डर्मिस से निकाली गई त्वचीय ऊतक के जैविक लक्षण वर्णन भी किया गया था। सभी ऊतकों इस नए प्रोटोकॉल द्वारा disaggregated रहे थे, हमें व्यवहार्य सूक्ष्म ग्राफ्ट प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, हम रिपोर्ट है कि इस अभिनव प्रोटोकॉल ऑटोलॉगस सूक्ष्म ग्राफ्ट और कोलेजन स्पंज त्वचा के घावों पर लागू किया जा करने के लिए तैयार द्वारा रचित जैव परिसरों बनाने में सक्षम है। Cliniएक पैर पर घाव ऑटोलॉगस जैव परिसरों की कैलोरी आवेदन भी सूचना मिली थी, दोनों फिर से epitalization प्रक्रिया और घाव की कोमलता का सुधार दिखा। इसके अतिरिक्त, हमारे लिए इन विट्रो मॉडल से पता चला है कि इस प्रणाली के साथ यांत्रिक disaggregation के बाद सेल व्यवहार्यता अप करने के लिए सात (7) संस्कृति के दिनों के लिए समय के साथ बनाए रखा है। हम यह भी विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा मनाया, कि disaggregation से प्राप्त कोशिकाओं के पूल mesenchymal स्टेम सेल सहित कई प्रकार की कोशिकाओं, कि ऊतक उत्थान और मरम्मत की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका डालती है, उनके उच्च पुनर्योजी क्षमता के लिए बना है। अंत में, हम इन विट्रो में प्रदर्शन किया है कि इस प्रक्रिया के सूक्ष्म ग्राफ्ट के बाँझपन जब अग्रवाल बर्तन में सुसंस्कृत बनाए रखता है। सारांश में, हम निष्कर्ष है कि इस नए दृष्टिकोण पुनर्जन्म का एक आशाजनक उपकरण चिकित्सकों के एक कदम है, व्यवहार्य बाँझ और सूक्ष्म ग्राफ्ट कि अकेले या संयोजन में सबसे आम जैविक scaffo के साथ लागू किया जा सकता का उपयोग करने के लिए तैयार में प्राप्त करने के लिए हो सकता हैएलडीएस।

Introduction

पिछले वर्षों में, कई नए तरीकों आदेश तीव्र और जीर्ण त्वचा के घावों के लिए एक कदम उपचार प्रदान करने के लिए सर्जरी के दौरान ऑटोलॉगस सेलुलर निलंबन प्राप्त करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में विकसित किया गया है। इसके अलावा, आघात, मधुमेह, संक्रमण, और अन्य कारणों से उत्पन्न तीव्र लेकिन मुख्य रूप से पुराने घावों के प्रबंधन, चुनौती बनी हुई है। बढ़ते सबूत है कि पुराने घावों एक गंभीर वैश्विक स्वास्थ्य के मुद्दे बन गए हैं, हेल्थकेयर सिस्टम दुनिया भर में 1 पर एक भारी वित्तीय बोझ के कारण नहीं है।

त्वचा के घावों के उपचार में सफलता की दर में वृद्धि करने के लिए, (सेलुलर वृद्धि सहित) व्यापक गड़बड़ी की अनुपस्थिति और बाँझ शर्तों के रखरखाव के लिए एक सेलुलर निलंबन की है कि तुरंत क्षतिग्रस्त क्षेत्र पर लागू किया जा सकता बनाने के लिए, आवश्यक हैं रोगियों, जिससे इस तरह के सेल कारखानों के रूप में cleanrooms में एक लंबे समय तक प्रसंस्करण से परहेज। सेंटछोटे त्वचा बायोप्सी, पीस, centrifugation और अन्य जुदाई तरीकों (जैसे, enzymatic या यांत्रिक) से arting, अक्सर एक सेलुलर निलंबन, जो एक मध्यम विकास में संवर्धित किया जा सकता प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इन तरीकों के सभी आम तौर पर निष्पादन के एक लंबे समय की आवश्यकता है, सेल संरचनाओं पर जोर दिया, और सेल व्यवहार्यता की कमी करने के लिए अग्रणी। एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू एक ऑटोलॉगस सेलुलर निलंबन के लिए तैयार चिकित्सकों द्वारा इस्तेमाल किया जा रहा प्राप्त करने के लिए, उदाहरण के लिए, क्षतिग्रस्त क्षेत्रों की मरम्मत करने के लिए है। इसके अलावा, यह अच्छी तरह से स्थापित है कि ऑटोलॉगस ऊतक ग्राफ्ट हस्तांतरण प्रक्रियाओं जीवित रहने के अंत में प्रेरण और चालन 2, 3 के सिद्धांतों से प्राप्तकर्ता साइट में जीवित रहने के लिए। आदर्श भ्रष्टाचार ऊतक आसानी से उपलब्ध हो सकता है और कम प्रतिजनकता और दाता साइट रुग्णता 4 होनी चाहिए।

इन सबूतों के आधार पर, इस अध्ययन के पहले उद्देश्य के लिए उपयुक्त ऑटोलॉगस जैव परिसरों बना रहा थाऊतकों की मरम्मत में नैदानिक ​​आवेदन। इस प्रयोजन के लिए, हम त्वचीय ऊतकों जो इस प्रोटोकॉल के द्वारा disaggregated रहे थे से शुरू ऑटोलॉगस सूक्ष्म ग्राफ्ट प्राप्त करने के लिए एक नई विधि का वर्णन है। इस मामले में भी प्रस्तुति के साथ साथ ऑटोलॉगस सूक्ष्म ग्राफ्ट कोलेजन स्पंज के साथ संयोजन में इस प्रोटोकॉल के द्वारा प्राप्त की एक नैदानिक ​​आवेदन के रूप में वर्णन किया गया है। यह दृष्टिकोण पहले से ही मानव ऊतकों 5 के यांत्रिक disaggregation में कुशल होने की सूचना दी गई है और यह ग्राफ्ट और चमड़े के ऊतकों के उत्थान के लिए 6.7 के साथ ही मौखिक-मैक्सिलोफेशियल सर्जरी 8-10 में संयोजी ऊतक के पुनर्योजी उपचार के लिए चिकित्सकीय इस्तेमाल किया गया है ।

इसके अलावा, इस अध्ययन के दूसरे उद्देश्य के लिए इस प्रोटोकॉल के द्वारा अपने disaggregation के बाद त्वचीय ऊतकों की जैविक लक्षण वर्णन किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, त्वचीय ऊतक के नमूने अलग अलग मुताबिक़ कई अंगों के ट्रंक क्षेत्र से निकाली गईऔर / या बहु ऊतक दाताओं कटाई, प्रसंस्करण पर राष्ट्रीय नियमों का पालन और एमिलिया रोमाग्ना क्षेत्रीय त्वचा बैंक में प्रत्यारोपण के लिए ऊतकों (CNT 2013) वितरण प्रोसेस किया गया।

केस प्रस्तुतिकरण:

एक 35 वर्षीय महिला कार दुर्घटना के कारण एक जटिल आघात दिखा रोगी एंकोना अस्पताल के गहन चिकित्सा कक्ष में भर्ती कराया गया था। मरीज को एक खुला घाव और एक यौगिक फ्रैक्चर बाहरी नियतन के साथ स्थिर होने के कारण पैर पर एक संक्रमण दिखाया। दो कट्टरपंथी क्षतशोधन प्रदर्शन किया गया और जब घाव नकारात्मक दबाव थेरेपी (VAC चिकित्सा) के बाद साफ हो गया और periosteum स्वस्थ दिखाई दिया, हम वसूली से दो महीने के बाद प्रोटोकॉल लागू होता है। इस प्रणाली के साथ disaggregation के बाद, सूक्ष्म ग्राफ्ट प्राप्त एक कोलेजन स्पंज जो बाद में क्रम में प्रत्यारोपित किया गया घाव की मरम्मत पर उनकी प्रभावकारिता की जांच करने के साथ जैव परिसरों को बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया।

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Protocol

आचार बयान: के बाद से प्रोटोकॉल के नैदानिक ​​आवेदन रोगी की त्वचा संबंधी ऑटोलॉगस ऊतक के उपयोग की आवश्यकता है, इन विट्रो में इसके लक्षण वर्णन कटाई, प्रसंस्करण पर राष्ट्रीय नियमों के दिशा निर्देशों का पालन एमिलिया रोमाग्ना क्षेत्रीय त्वचा बैंक में मुताबिक़ त्वचीय ऊतक पर नैदानिक ​​उपयोग करने से पहले प्रदर्शन किया गया था और प्रत्यारोपण के लिए ऊतकों (CNT 2013) के वितरण।

1. नैदानिक ​​आवेदन के लिए जैव परिसर के निर्माण

नोट: इस प्रोटोकॉल चिकित्सकीय Rigeneracons (ऊतक disruptor) और Rigenera मशीन (ऊतक disruptor प्रणाली) (चित्रा 1 ए) के उपयोग पर आधारित है। ऊतक disruptor के बारे में 50 माइक्रोन की कट-ऑफ के साथ हेक्सागोनल ब्लेड और छानने कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स के घटकों द्वारा प्रदान की एक ग्रिड का उपयोग ऊतकों के छोटे टुकड़े को बाधित करने में सक्षम मानव ऊतकों की एक जैविक चिकित्सा disruptor है।

  1. एक द्वि के माध्यम से रोगी की skinsamples लीजिएopsy पंच (चित्रा 1 बी) और प्रत्येक टुकड़े के लिए खारा समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने disaggregate ऑटोलॉगस सूक्ष्म ग्राफ्ट 6,7,9 प्राप्त करने के लिए (या 2.1 कदम देखें)।
  2. कोलेजन स्पंज पर सूक्ष्म ग्राफ्ट के 1 मिलीलीटर की जगह (चित्रा 1 सी) toform जैव परिसरों नैदानिक ​​आवेदन के लिए उपयोग करने के लिए।
  3. संस्कृति एक और 1 एक 5% सीओ 2 humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर DMEM मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक के 6 मिलीलीटर की उपस्थिति में कोलेजन स्पंज पर सूक्ष्म ग्राफ्ट की मिलीलीटर।
  4. संस्कृति के 3 दिन बाद, आरटी पर 10 मिनट के लिए 0.3% paraformaldehyde के साथ जैव परिसरों को ठीक। नमूना पर एक विशेष मशीन के साथ सीधे आयल डालो। 5 माइक्रोन की मोटाई के साथ एक microtome के साथ स्लाइस प्राप्त करें और एक गिलास स्लाइड में सीधे डाल दिया।
  5. ऊतकीय विश्लेषण के लिए एक गिलास में 5 माइक्रोन का पैराफिन स्लाइस को विसर्जित कर दिया, जिसमें 15 - 20 मिलीलीटर ज़ाइलीन (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध - M-xylene (40 का एक मिश्रण - 65%), पी-xylene (20%), ओ-xylene (20% ) और ETHYL बेंजीन (6 - 20%) और टोल्यूनि, trimethyl बेंजीन, फिनोल, thiophene, पिरिडीन और हाइड्रोजन सल्फाइड) 3 मिनट प्रत्येक के लिए के निशान।
  6. और फिर विआयनीकृत पानी de-paraffinizing के लिए (1 घंटा, 1hr के लिए 80% इथेनॉल, 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल के लिए 1hr के लिए 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल) इथेनॉल के घटते ग्रेड में स्लाइस (100% से 70%) विसर्जित और वर्गों rehydrating।
  7. 1 के लिए 1 जी / एल Ematoxylin के 2 मिलीलीटर - - 1 के साथ वर्गों दाग 2 मिनट और बाद में पानी में कुल्ला किसी भी Ematoxylin अधिशेष हटा दें।
  8. साथ इथेनॉल 70% मिश्रित एकाग्रता के 1% से कम Eosin Y शराबी समाधान के साथ 5 मिनट और पानी में पतला - 4 के लिए वर्गों दाग।
  9. प्रत्येक अनुभाग के लिए स्लाइड Eosin Y के 2 मिलीलीटर और चल रहे पानी के नल के नीचे कुल्ला - 1 का प्रयोग करें।
  10. इथेनॉल के ग्रेड बढ़ाने में विसर्जित कर दिया वर्गों और अंत में (1.6 कदम देखें), एक आधारित बढ़ते mediumand 100X बढ़ाई (चित्रा -1) पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण के साथ 1 के लिए xylene में एक मार्ग है, coverslip के बाद।
  11. </ राजभाषा>

    2. संग्रह, disaggregation और ऊतकों की इन विट्रो विश्लेषण में

    1. एक dermatome का प्रयोग, 0.6 मिमी, 1 मिमी या 4 अलग बहु अंग और / या बहु के ट्रंक क्षेत्र से मोटाई में 2 मिमी क्रमश स्वतंत्र त्वचा के ऊतक, इल्लों से भरा हुआ de-epidermized डर्मिस (डेड) या जालीदार डर्मिस (dermis) ले 40 से 55 साल से एक रेंज में ऊतक दाताओं, कटाई, प्रसंस्करण और प्रत्यारोपण के लिए ऊतकों के वितरण पर राष्ट्रीय नियमों (सीएनटी 2013) के बाद।
      1. धीरे 5 मिनट के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर एक थाली में उन्हें लगा 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान में सभी नमूनों कुल्ला।
      2. 5 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग, नमूने जो त्वचा के ऊतक, देद और dermis से व्यास में एक समान हैं और disaggregation से पहले सभी ऊतक नमूनों का वजन पैदा करते हैं।
      3. त्वचा के ऊतक, देद या डर्मिस क्रमश ऊतक disruptor में से आठ, तीन या चार वर्दी के नमूने, disaggregation के लिए खारा समाधान के 1.5 मिलीलीटर जोड़ने डालें।
      4. अलग अलग प्रदर्शन करनासभी ऊतकों के नमूनों के लिए disaggregation के समय के रूप में 1 टेबल में संकेत दिया।
      5. नियंत्रण के रूप में बरकरार ऊतकों के नमूनों से निकाली गई पंच बायोप्सी के एक संवाददाता संख्या का उपयोग करें।
      6. यांत्रिक disaggregation के बाद, एक 12 अच्छी तरह से थाली का एक भी कुएं में प्रत्येक नमूना सूक्ष्म ग्राफ्ट और जगह युक्त अलग से खारा समाधान aspirate। बरकरार नियंत्रण पंच बायोप्सी के लिए एक ही प्रोटोकॉल का प्रदर्शन।
      7. RPMI 1640 मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और प्रत्येक नमूने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक के 1ml जोड़ें।
      8. सेल व्यवहार्यता तुरंत मूल्यांकन। प्रत्येक अच्छी तरह से एक माइक्रो भ्रष्टाचार (क्रमशः त्वचा के ऊतक, देद या डर्मिस की आठ, तीन या चार वर्दी नमूने के एक साथ disaggregation द्वारा प्राप्त) युक्त 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर MTT (3 [युक्त मध्यम के 1ml जोड़ने 4,5- dimethylthiazol-2-YL] -2,5 diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) समाधान और 5% सीओ 2 / हवा के माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए सेते हैं। बरकरार नियंत्रण के लिए एक ही प्रोटोकॉल प्रदर्शनबायोप्सी पंच।
      9. ऊष्मायन के बाद, सभी मध्यम युक्त MTT को हटा दें और 10 मिनट के लिए प्रत्येक नमूना 1 मिलीलीटर डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में जोड़ें।
      10. एक क्युवेट में प्रत्येक नमूना और DMSO स्थानांतरण और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 570 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) में पढ़ा। 570 एनएम पर absorbance के अनुपात और ऊतकों की ग्राम (जीआर) disaggregation से पहले इस्तेमाल में वजन के रूप में सेल व्यवहार्यता की गणना। बरकरार नियंत्रण पंच बायोप्सी के लिए एक ही प्रोटोकॉल का प्रदर्शन।
    2. यांत्रिक disaggregation के बाद, सूक्ष्म भ्रष्टाचार त्वचा के ऊतक, एक एकल दाता की देद और dermis के नमूनों से निकाली गई युक्त खारा समाधान aspirate।
      1. अलग से एक 12 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह से या सेल व्यवहार्यता परीक्षण और रूपात्मक विश्लेषण के लिए क्रमश: एक संस्कृति फ्लास्क में प्रत्येक नमूना रखें।
      2. संस्कृति सूक्ष्म ग्राफ्ट 5% सीओ 2 / AI के माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर (12 अच्छी तरह से थाली) या 5 मिलीलीटर (संस्कृति कुप्पी) RPMI 1640 मध्यम 10% FBS के साथ पूरक और एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने24 घंटा या 7 दिनों के लिए आर।
      3. 24 घंटा या 7 दिन (दोहराने कदम 2.1.8-2.1.10) के बाद सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन।
      4. 24 घंटा और फ्लास्क में संस्कृति के 7 दिनों के बाद प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा रूपात्मक विश्लेषण प्रकोष्ठ निलंबन की उपस्थिति का मूल्यांकन कार्य करें।
      5. Mesenchymal और FACS विश्लेषण 6 से CD146, CD34 और CD45 एंटीजन सहित hematopoietic सेल मार्कर, को सकारात्मकता के लिए डर्मिस की नमूनों का विश्लेषण।
      6. लामिना का प्रवाह हुड बीज के तहत प्रत्येक सूक्ष्म भ्रष्टाचार और पूरी तरह से अलग-अलग नहीं प्रत्येक ऊतक के नमूने के एक संवाददाता छोटा सा टुकड़ा (त्वचा के ऊतक, देद या डर्मिस क्रमश: आठ, तीन या चार वर्दी नमूने के एक साथ disaggregation द्वारा प्राप्त) (> आकार में 50 माइक्रोन disaggregation प्रक्रिया) कोलंबिया अगर 100 μl युक्त 5% भेड़ रक्त शोरबा प्लेट पर बाद।
      7. तीन दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं और व्यवस्था बाँझपन का आकलन करने में कोलंबिया अगर प्लेट पर सूक्ष्मजीवविज्ञानी विश्लेषण प्रदर्शन 11

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Representative Results

इस प्रारंभिक अध्ययन में, पहला उद्देश्य ऐसी कोलेजन के रूप में मानव ऑटोलॉगस सूक्ष्म ग्राफ्ट एक जैविक समर्थन के साथ संयुक्त, की क्षमता है, का उपयोग करने के लिए तैयार जैव परिसरों का निर्माण करने के जांच करने के लिए किया गया था। इन जैव परिसरों एक मरीज में प्रत्यारोपित किया गया एक पैर एक कार दुर्घटना (2A चित्रा) की वजह से घाव और एक पूर्ण फिर से epithelialization 30 दिन (चित्रा 2 बी) के बाद ऊतकों की मरम्मत के साथ जुड़े के साथ मनाया गया। इसके अलावा, नैदानिक ​​अनुवर्ती नैदानिक ​​आवेदन करने के लिए 5 महीने (चित्रा 2 सी) के बाद एक अच्छा बनावट और क्षतिग्रस्त क्षेत्र की कोमलता दिखाया। समानांतर में, इन विट्रो अध्ययन में भी इस तरह के त्वचा के ऊतकों के रूप में विभिन्न त्वचीय ऊतकों की सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया गया , देद और dermis से पहले और इस प्रणाली के द्वारा disaggregation के बाद। विशेष रूप से, खाते में ऊतक के प्रत्येक प्रकार के अलग-अलग मोटाई ले रही है, आठ की दहलीज,चार और तीन बायोप्सी है कि त्वचा के ऊतक, देद और dermis के लिए एक भी कदम में कार्रवाई की जा सकती, क्रमश: स्थापित किया गया था। बायोप्सी की स्थापना की संख्या तो आदेश disaggregation का इष्टतम स्थिति की पहचान करने के लिए एक अच्छा सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए उनके जैविक विशेषताओं के अनुसार चार अलग अलग समय पर disaggregated रहे थे के रूप में 1 टेबल में संकेत दिया।

हालांकि ऊतक प्रसंस्करण खुद को अनिवार्य रूप से बरकरार ऊतक की तुलना में सेल व्यवहार्यता की एक हानि प्रेरित, यांत्रिक इस प्रणाली के साथ प्रदर्शन किया disaggregation त्वचा, देद और डर्मिस के सभी नमूनों में 30% की सेल व्यवहार्यता का एक मतलब मूल्य बनाए रखने के लिए लगता है से 22 ओवर ड्राफ्ट / जीआर के लिए 7 ओवर ड्राफ्ट / जीआर के लिए, अलग अलग समय (चित्रा 3 ए), अक्षत ऊतक (चित्रा 3 बी) के संबंध में मूल्यांकन (92 ओवर ड्राफ्ट / 29 आयुध डिपो बरकरार त्वचा के ऊतकों के लिए जीआर और / जीआर disaggregation के बाद का मतलबआर disaggregation और अंत में disaggregation के लिए सम्मान के साथ बरकरार डर्मिस) के लिए 2.7 से आयुध डिपो / जीआर करने के लिए 16 ओवर ड्राफ्ट / जीआर सम्मान के साथ बरकरार ded। इस प्रकार, इन प्रारंभिक परिणाम बताते हैं कि इस प्रणाली को तत्काल disaggregation के बाद सेल व्यवहार्यता का सराहनीय स्तर को बनाए रखने में सक्षम है। सेल व्यवहार्यता पर disaggregation का असर भी 24 घंटा या 7 दिनों और चर परिणामों के लिए सुसंस्कृत मनाया गया ऊतकों के नमूनों पर जांच की गई। विशेष रूप से, त्वचा के ऊतकों के नमूनों में सेल व्यवहार्यता का कोई पर्याप्त भिन्नता का मूल्य उस समय (0 टी) (चित्रा -4 ए) की तुलना में homogenization और संस्कृति के समय तक स्वतंत्र रूप से मनाया गया। दूसरी ओर, देद नमूने का एक कम व्यवहार्यता के बाद संस्कृति के 24 घंटा समय (0 टी) शुरू करने की तुलना में मनाया गया था, लेकिन हैरत की बात है सेल व्यवहार्यता संस्कृति के 7 दिन (चित्रा 4 बी) के बाद बहाल किया गया। इसी तरह के परिणाम भी डर्मिस के नमूने के लिए मनाया गया (चित्रा 4C)। प्रत्येक नमूना डुप्लिकेट और 2 टेबल में सूचना दी मूल्यों में मूल्यांकन किया गया था।

इन परिणामों के आधार पर, हम त्वचीय ऊतक के तीन प्रकार के लिए सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए disaggregation का उपयुक्त समय पहचान के रूप में 3 तालिका में सूचना दी सेल व्यवहार्यता के अलावा, सुसंस्कृत सेलुलर निलंबन की रूपात्मक पहलू भी मूल्यांकन किया गया था, एकल कक्षों की पहचान ऊतक disaggregation से 24 घंटा के बाद थोड़ी देर के बाद 7 दिनों वहाँ दोनों त्वचा के ऊतक और देद / डर्मिस नमूनों में फाइबर के अवशेषों मनाया गया (चित्रा 5 एबी)। इसके अलावा, विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा एक सेल लक्षण वर्णन अपनी homogenization के बाद डर्मिस के एक नमूने में प्रदर्शन किया गया था: endothelial कोशिकाओं और mesenchymal स्टेम कोशिकाओं सहित कई सेलुलर प्रकार, द्वारा रचित कोशिकाओं की एक विषम पूल (चित्रा 6) की पहचान की थी। इसके अलावा, बैक्टीरिया विकास के अभाव मैं पहचान की थी n सब अलग-अलग नमूने वक्त अग्रवाल व्यंजन पर वरीयता प्राप्त, प्रयोगात्मक प्रक्रिया (चित्रा 7) के बाँझपन साक्ष्य।

आकृति 1
चित्रा 1. जैव परिसरों का निर्माण ऊतक में खलल न डालें प्रणाली (ए) और रोगी के घाव क्षेत्र से Derma का एक छोटा सा टुकड़ा है कि ऊतक disruptors के साथ बाद में अलग-अलग। जैव परिसरों कोलेजन स्पंज पर सूक्ष्म ग्राफ्ट के संयोजन प्राप्त किया गया था का संग्रह मानव पैच घाव की मरम्मत (सी) के लिए उपयोग करने के लिए तैयार प्राप्त करने के लिए। (डी) Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) का धुंधला एक प्रतिनिधि जैव जटिल DMEM मध्यम में तीन दिनों के लिए सुसंस्कृत और माइक्रोस्कोपी के लिए मनाया का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

सामग्री "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> चित्र 2
चित्रा पैर घाव जैव परिसरों कोलेजन और सूक्ष्म ग्राफ्ट रोगी से प्राप्त द्वारा रचित पर 2. जैव परिसरों आवेदन सी पैर घाव (ए) पर लागू किया गया है और घाव 30 दिन (बी) और 5 महीने बाद मूल्यांकन किया गया था ( )। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. सी पक्ष व्यवहार्यता तुरंत बरकरार Cutaneous ऊतकों (बी)। त्वचा के लिए सम्मान के साथ Cutaneous ऊतकों (ए) के तीन प्रकार के अलग अलग समय पर disaggregation के बाद, देद और dermis ऊतकों चार अलग अलग दाताओं से व्युत्पन्न ऊतक disru साथ disaggregated रहे थेके रूप में ptors पाठ में उपयुक्त खंड में संकेत मिलता है। सेल व्यवहार्यता प्रत्येक ऊतक के नमूने के लिए दो प्रतियों में प्रदर्शन किया MTT परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया था। ग्राफ प्रत्येक नमूना के लिए दो प्रतियों में प्रदर्शन किया चार अलग-अलग प्रयोगों का प्रतिनिधि है। परिणाम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) और ऊतकों की ग्राम (जीआर) के बीच एक अनुपात के रूप में व्यक्त कर रहे हैं; मानक विचलन ऊतक के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) और ग्राम (जीआर) के बीच का अनुपात पर गणना की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
त्वचा के ऊतकों (ए) के एक अलग-अलग नमूना की चित्रा 4. सी पक्ष व्यवहार्यता स्तर, देद (बी) और dermis (सी) समय (0 टी) शुरू करने के लिए और 24 घंटा और 7 दिनों के लिए उपसंस्कृति के बाद। ऊतकों ऊतक के साथ homogenized थे इंडिका के रूप में disruptorsपाठ में उपयुक्त खंड में ते। अलग-अलग नमूने disaggregation के बाद 24 घंटे और 7 दिनों के लिए बाद में सुसंस्कृत थे और RPMI में बनाए रखा 1,640 मध्यम 5% सीओ 2 / हवा के माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक। सेल व्यवहार्यता MTT द्वारा मूल्यांकन किया गया था के रूप में पहले से वर्णन किया। ग्राफ एक प्रयोग त्वचा के ऊतक, देद और dermis एक एकल दाता से प्राप्त की प्रत्येक नमूना के लिए दो प्रतियों में प्रदर्शन का प्रतिनिधि है। परिणाम ऊतक के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) और ग्राम (जीआर) के बीच अनुपात के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. रूपात्मक अलग-अलग त्वचा के ऊतकों का विश्लेषण (ए) और देद / डर्मिस (बी) के बाद 24 घंटे और 7 दिनों के पंथ Ure। रूपात्मक विश्लेषण 24 घंटा और त्वचा के ऊतकों और देद / डर्मिस ऊतकों पर RPMI माध्यम की उपस्थिति में संस्कृति के 7 दिनों के बाद प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 सेल से फ्लो विश्लेषण द्वारा विशेषता। यांत्रिक disaggregation के बाद, सूक्ष्म ग्राफ्ट डर्मिस द्वारा प्राप्त संस्कृति में डाल रहे थे और बाद 7 दिनों के mesenchymal और CD146, CD34 और CD45 एंटीजन सहित hematopoietic सेल मार्कर, को सकारात्मकता के लिए विश्लेषण किया गया। कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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चित्रा 7. सूक्ष्मजीवविज्ञानी अलग-अलग त्वचा के ऊतक, देद और dermis के नमूनों का विश्लेषण। अलग-अलग ऊतकों के नमूनों के छोटे टुकड़े कोलंबिया अगर पर वरीयता प्राप्त थे 5% भेड़ रक्त (BIOMERIEUX कंपनी) लामिना का प्रवाह हुड के तहत की गयी और तीन दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated सूक्ष्मजीवविज्ञानी विश्लेषण करते हैं और प्रक्रिया के बाँझपन का आकलन करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ऊतक के नमूने Disaggregation टाइम्स (सेकंड / मिनट)
त्वचा 30 सेकंड
1 मिनट
2 मिनट
5 मिनट
देद 1 मिनट
2 मिनट
5 मिनट
दस मिनट
डर्मिस 1 मिनट
2 मिनट
5 मिनट
दस मिनट

तालिका 1. चार अलग त्वचा के disaggregation के लिए इस्तेमाल टाइम्स की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, देद और dermis। आठ, चार और तीन त्वचा के पंच बायोप्सी, देद और dermis क्रमश: चार अलग अलग समय पर disaggregated रहे थे, उनके जैविक विशेषताओं के अनुसार।

त्वचा ऊतक
को 24 घंटा 7 दिन
2 ' 5 ' 2 ' 5 ' 2 ' 5 '
37.1 ४१.०७,१४३ ४१.०७,१४३ ६५.७८,५७१ ४१.१४,२८६ ३७.४२८५७
35.8 ४३.८२,१४३ ३६.६०,७१४ 66.5 ४१.४६,४२९ ३८.६७८५७
देद
टी 0 24 घंटा 7 दिन
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 ७.८५५६७
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
डर्मिस
को 24 घंटा 7 दिन
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 २.७७,१९३ 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

टेबल 2. एक जैविक को दोहराने के लिए आयुध डिपो / जीआर में व्यक्त मूल्यों की रेंज। त्वचा के ऊतकों से सेल व्यवहार्यता के मूल्यों, देद और डर्मिस समय शुरू करने के लिए और संकेत समय के लिए यांत्रिक disaggregation के बाद मूल्यांकन किया है। परिणाम एक प्रयोग दो प्रतियों में प्रदर्शन किया और ऊतक के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) और ग्राम (जीआर) के बीच का अनुपात के रूप में व्यक्त की प्रतिनिधि हैं।

नमूना disaggregation समय
त्वचा ऊतक 5 मिनट
देद 1 मिनट
Derma 2 मिनट

तालिका 3. disaggregation के लिए सबसे अच्छा समय की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व differe में एक अच्छा सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिएNT ऊतकों के नमूनों। disaggregation के बाद 5, 1 और 2 मिनट में क्रमश: त्वचा, देद और dermis ऊतकों के नमूनों इष्टतम सेल व्यवहार्यता दिखा।

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Discussion

इस प्रारंभिक अध्ययन से पता चला है कि सूक्ष्म ग्राफ्ट इस प्रोटोकॉल के द्वारा प्राप्त की, के रूप में पहले से ही अन्य नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में सूचना दी, सूक्ष्म ग्राफ्ट प्रत्यारोपण 9 की प्रभावकारिता, 10 अनुकूलन करने के लिए कोलेजन स्पंज के साथ जोड़ा जा सकता है। विशेष रूप से, इस अध्ययन की क्षमता जैव सूचना दी -complexes, सूक्ष्म ग्राफ्ट और कोलेजन स्पंज द्वारा गठित नैदानिक ​​आवेदन से 30 दिनों के बाद एक पैर घाव के घाव भरने के लिए सहायक। इसके अलावा, इन विट्रो परिणाम इस प्रोटोकॉल के प्रभाव को तीन अलग-अलग त्वचीय ऊतकों disaggregate करने के बारे में सबूत उपलब्ध कराने, दोनों तुरंत यांत्रिक disaggregation के बाद और भी 24 घंटा और संस्कृति के 7 दिनों के बाद एक प्रशंसनीय सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने।

homogenization के इस तरह के बाद सेल व्यवहार्यता के रखरखाव के व्यापक हेरफेर से परहेज है, केवल एक कदम बाँझ ऑटोलॉगस सूक्ष्म ग्राफ्ट में प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। यह सबूत समझौते में हैअन्य हाल के कागजात के साथ जो इन विट्रो में इस प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता के ऊतकों के अन्य प्रकार, periosteum, हृदय अटरिया और नेत्रगोलक 5 के पार्श्व rectus मांसपेशियों की बायोप्सी सहित भी परीक्षण किया गया था। विशेष रूप से, हम देद और डर्मिस नमूनों में एक वृद्धि सेल व्यवहार्यता संस्कृति के 7 दिनों के बाद शायद एक माध्यम के 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक के उपयोग की वजह से मनाया।

सेल व्यवहार्यता के रखरखाव के अलावा, इस प्रणाली को सुरक्षित और प्रयोग करने में आसान है और कुछ ही मिनटों में यंत्रवत् सेल संरचनाओं के विघटन को रोकने के ऊतकों के विभिन्न प्रकार disaggregate करने में सक्षम है, इस तरह के रूप में enzymatic सेल अलगाव के पारंपरिक तरीकों के संबंध में पाचन कि निष्पादन के लंबे समय की आवश्यकता है। इसके अलावा, इस प्रणाली में 50 माइक्रोन की कट-ऑफ के साथ कोशिकाओं का चयन करने में सक्षम है और इस पहलू इंजेक्शन सूक्ष्म ग्राफ्ट की सफलता के विचार में बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि इस श्रेणी में शामिलपूर्वज कोशिकाओं कई प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए और फिर घाव की मरम्मत सुधारने में सक्षम। इस प्रोटोकॉल दिया है कि दाता विषय भी इन सूक्ष्म grafts के स्वीकर्ता है, हमें न केवल व्यवहार्य लेकिन यह भी ऑटोलॉगस सूक्ष्म ग्राफ्ट प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। ऑटोलॉगस सूक्ष्म ग्राफ्ट प्राप्त करने के लिए इस प्रणाली की क्षमता विशेष रूप से दंत चिकित्सा के क्षेत्र में जहां यह एक गैर में ऑटोलॉगस डेंटल पल्प स्टेम सेल की कि प्रत्यारोपण (DPSCs) में दिखाया गया है की सूचना मिली थी निहित infrabony दोष periodontal मरम्मत और atrophic के उत्थान के लिए योगदान दिया 5,6 जबडा। घाव भरने की प्रक्रिया में सुधार करने के लिए इन सूक्ष्म ग्राफ्ट की क्षमता भी पहले शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप या जटिलताओं 4 के बाद परिसर में घाव के प्रबंधन में सूचना दी थी।

ऑटोलॉगस और सूक्ष्म ग्राफ्ट का उपयोग करने के लिए तैयार के उपयोग पर एक और लाभ यह निश्चित रूप से त्वचा के घावों पर उनके बाद प्रत्यारोपण के मद्देनजर बाँझ शर्तों के रखे हुए है।

अंत में, प्रोटोकॉल इस पत्र में वर्णित करने की संभावना पर मानव सूक्ष्म भ्रष्टाचार ऊतक नैदानिक ​​हस्तक्षेप में उपयोग करने के लिए इस तरह के अध्ययन में संकेत के रूप में उन तीव्र / पुरानी त्वचा घावों के उपचार में सुधार करने के लिए तैयार बनाने के लिए क्षमता से पता चला है। इन विट्रो परिणाम व्यवहार्य बनाने के सूक्ष्म ग्राफ्ट भी सूचित किया गया है और निश्चित रूप से इस पैरामीटर ऊतकों की मरम्मत में सफलता का प्रतिशत बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। साथ में ले ली, आंकड़ों से पता चला है कि इस नई प्रणाली के चिकित्सकों जो त्वचा के घावों के प्रबंधन में एक तेजी से और सुरक्षित साधन की जरूरत होती है के लिए एक आशाजनक उपकरण माना जा सकता है।

फिलहाल, वहाँ विशेष संशोधन या इस विशिष्ट आवेदन में प्रोटोकॉल के लिए सीमाओं दिया है कि त्वचा के एक ऊतक का उपयोग करने के लिए आसान प्रतिनिधित्व करता है और अन्य अध्ययनों में हम अलग अलग त्वचा के घावों 6.7 में एक ही प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता रिपोर्ट नहीं कर रहे हैं,

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Disclosures

लेखक एंटोनियो ग्रैजियानो मानव मस्तिष्क वेव SRL ​​है कि उत्पादन और Rigenera प्रणाली बाजारों के वैज्ञानिक निदेशक है। लेखक Letizia Trovato मानव मस्तिष्क वेव SRL ​​का वैज्ञानिक डिवीजन के एक सहयोगी है

Acknowledgments

लेखकों प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन अध्ययन करने के लिए योगदान के लिए धन्यवाद डॉ Federica Zanzottera करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

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References

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