Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

protokol yeni bir yöntem, insan doku ayrıştırmak ve kollajen sünger ile birlikte, deri lezyonlarının tedavisinde kullanıma hazır insan biyo-kompleksleri doğuran otolog mikro greft oluşturmak açıklar. Bundan başka, bu sistem, mekanik ayrıştırma sonra farklı zamanlarda mikro greft hücre canlılığı korur.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Birkaç yeni yöntemler akut ve kronik deri lezyonları için bir adım tedaviler sağlamak amacıyla, ameliyat sırasında otolog hücre süspansiyonları elde etmek için biyoteknoloji alanında geliştirilmiştir. Ayrıca, travma, diyabet, enfeksiyon ve diğer nedenlere bağlı kronik fakat akut yaraların yönetimi, zorlu kalır. Bu çalışmada, tek bir hastanın cilt dokusuna ve klinik uygulama otolog mikro greft oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, deri, de-epidermized dermis (DED) ve çok-organ ve / veya çok doku donörlerin dermis türetilen cilt dokusuna in vitro biyolojik karakterizasyonu de yapıldı. Bütün dokular bize canlı mikro greft elde etmek için izin, bu yeni protokolün göre ayrıştırılmış bulundu. Özellikle, bu yenilikçi protokol deri lezyonları uygulanacak hazır otolog mikro greftler ve kollajen sünger tarafından bestelenen biyo-kompleksleri oluşturmak mümkün olduğunu bildirdi. CliniBir bacak lezyon otolog biyo-komplekslerinin cal uygulaması da yeniden epitalization süreci ve lezyonun yumuşaklık hem de bir gelişme göstererek, bildirildi. Buna ek olarak, in vitro bir model bu sistem ile, mekanik ayrıştırma sonra hücre canlılığı, kültür kadar yedi (7) gün süre ile uzun süre devam eder gösterdi. Ayrıca ayrıştırma elde edilen hücre havuzu yüksek rejeneratif potansiyeli, doku yenilenmesi ve onarım süreçlerinde önemli bir rol meydana mezenkimal kök hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin, oluştuğunu, akış sitometri analizi ile saptanmıştır. Son olarak, Ağar levhalarına kültüre Bu prosedür mikro greft kısırlığı tutar in vitro olarak gösterilmiştir. Özet olarak, klinisyen, uygun bir steril ve en sık görülen biyolojik scaffo tek başına ya da kombinasyon halinde uygulanabilir mikro greft kullanıma hazır tek bir adımda elde etmek için yeni bir reaktif yaklaşım, umut verici bir araç olabilir sonucunalds.

Introduction

Son yıllarda, birçok yeni yöntemler akut ve kronik deri lezyonlarında tek adım tedaviler sağlamak amacıyla ameliyat sırasında otolog hücre süspansiyonları elde etmek için biyoteknoloji alanında geliştirilmiştir. Ayrıca, travma, diyabet, enfeksiyonlar ve diğer nedenlere bağlı akut ama esas kronik yaraların yönetimi, zorlu kalır. Kronik yaralar sağlık sistemleri, dünya çapında 1 üzerinde çok büyük bir mali yük neden ciddi bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir montaj kanıtlar vardır.

deri lezyonlarının tedavisi başarı oranını artırmak için, (hücre geliştirme dahil) geniş bir manipülasyon olmaması ve steril koşullar bakımı hemen hasarlı alan üzerinde uygulanabilen bir hücresel süspansiyon oluşturmak için, gerekli olan Hastalar, böylece bu tür hücre fabrikalarında olarak temiz oda daha uzun bir işlem önler. Stküçük bir deri biyopsisi, öğütme, santrifüjleme ve diğer ayırma yöntemlerinin (örneğin, enzimatik veya mekanik) arasında Arting, sık sık bir büyüme ortamında kültürlenebilir bir hücresel süspansiyon elde etmek için kullanılır. Tüm bu yöntemler, genellikle hücre yapıları vurgulayarak ve hücre canlılığının bir azalmaya yol açan, uygulama, uzun bir süre gerektirir. Bir diğer önemli bir yönü zarar görmüş alanların onarmak, örneğin, klinisyenler tarafından kullanılmak üzere hazır bir otolog hücre süspansiyonu elde etmektir. Ayrıca, iyi otolog doku greftleri sonunda indüksiyon ve iletim 2, 3 ilkeleri ile alıcı sitesine hayatta transfer prosedürleri hayatta olduğu saptanmıştır. İdeal greft dokusu hazır olması ve düşük antigenesiti ve donör saha morbiditesi 4 olmalıdır.

Bu delillerden, bu çalışmanın ilk amacı için uygun otolog biyo-kompleksleri oluşturmak oldudoku onarımında klinik uygulama. Bu amaçla, bu protokol ile ayrıştırılmış edildi deri dokulardan başlayarak otolog mikro greft elde etmek için bir yeni bir yöntem tarif. Bir olgu sunumu da burada kollajen sünger ile birlikte bu protokolü tarafından elde edilen otolog mikro greftler bir klinik uygulama olarak tarif edilir. Bu yaklaşım, daha önce insan dokularıyla 5 mekanik ayrıştırma etkili olduğu rapor edilmiştir ve greft ve dermal dokularda 6,7 rejenerasyonu için hem de oral çene cerrahisi 8-10 bağlantı dokularının rejeneratif terapisi için klinik olarak kullanılmaktadır .

Buna ek olarak, bu çalışmanın ikinci amacı da bu protokol tarafından kendi ayrıştırma sonrası deri dokuların biyolojik karakterizasyonu oldu. Bu amaçla, cilt dokusuna farklı homolog numuneler farklı çoklu organ gövde alanından türetilmişve / veya çoklu doku bağış Emilia Romagna Bölge Cilt Bankası nakli için dokular (CNT 2013) hasat, işleme Ulusal Kuralları takip eden ve dağıtan işlenmiştir.

Olgu Sunumu:

Trafik kazası nedeniyle karmaşık bir travma gösteren 35 yaşındaki kadın hasta Ancona Hastanesi Yoğun Bakım Ünitesi'ne yatırıldı. Hastada bir açık yara ve eksternal fiksatör ile stabilize bir bileşik kırık bacak bir enfeksiyon gösterdi. Iki radikal debridman ve yara negatif basınç terapisi (VAC tedavisi) sonra temiz oldu ve periost sağlıklı göründü, biz kurtarma iki ay sonra protokol uygulandı. Bu sistem ile ayrıştırma sonra, elde edilen mikro-greftler, daha sonra lezyon tamir üzerindeki etkinliğini araştırmak için implante edildi kollajen sünger ile biyo-kompleksleri oluşturmak için kullanıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik deyimi: protokolün klinik uygulama hastanın deri otolog doku kullanımını gerektirir çünkü, in vitro karakterizasyonu hasadı, işlenmesi Milli Kuralları yönergeleri izleyerek Emilia Romagna Bölge Cilt Bankası homolog deri dokusu üzerinde klinik kullanımdan önce gerçekleştirildi ve nakli için dokular (2013 CNT) dağıtılması.

Klinik Uygulama için 1. Bio-kompleks Yapı

NOT: Bu protokol, klinik Rigeneracons (doku Topu) ve RiGenera Machine (doku Topu sistemi) (Şekil 1A) kullanımına dayanmaktadır. Doku Topu yaklaşık 50 mikronluk bir kesme altıgen bıçaklar ve filtreleme hücreleri ve hücre dışı matris bileşenleri tarafından sunulan bir ızgara ile dokuların küçük parçalar bozmak için mümkün insan dokularının biyolojik, tıbbi bozan bir.

  1. Bir bi aracılığıyla hastanın skinsamples toplayınOPSY delme (Şekil 1B) ve otolog mikro greft 6,7,9 elde etmek için her bir parça için tuzlu su çözeltisi 1 ml ilave parçalamak (veya adım 2.1).
  2. Kollajen sünger mikro greft 1 ml koyun (Şekil 1C) toform biyo-kompleksleri klinik uygulama için kullanılacak.
  3. Kültür, bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş atmosfer içinde 37 ° C 'de% 10 fetal inek serumu ile desteklenmiş DMEM aracı maddesi içinde 6 ml mevcudiyetinde kolajen süngeri üzerine mikro greft bir 1 mi.
  4. Kültür, 3 gün sonra, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile% 0.3 paraformaldehid ile biyo-kompleksleri düzeltin. numune üzerine doğrudan belirli bir dağıtıcı ile parafin dökün. 5 um kalınlığında bir mikrotom ile dilimleri elde edilir ve cam slayt doğrudan koydu.
  5. 20 mi ksilen (ticari olarak temin - - m-ksilen (40 karışımı -% 65), p-ksilen (% 20), o-ksilen (20% 15 ihtiva eden, histolojik analizler için bir cam içinde 5 um'lik parafin dilim daldırın ) ve ETHil benzen (6-20%) ve 3 dakika her biri için, tolüen, trimetil benzen, fenol, tiyofen, piridin ve hidrojen sülfid) izleri.
  6. de-paraffinizing ve daha sonra deiyonize su (1 saat, 1 saat için% 80 etanol,% 70 etanol, 1 saat boyunca için 1 saat için% 100 etanol,% 95 etanol), etanol azalan sınıflarda dilimleri (% 100 ila% 70) daldırın ve bölümleri rehidrasyon.
  7. 1 1 g / L Ematoxylin 2 ml - 1 - ile bölümleri Leke 2 dakika ve daha sonra herhangi bir Ematoxylin fazlası çıkarmak için su ile durulayın.
  8. etanol% 70 ile karıştırılmış konsantrasyonunun% 1 Eosin Y alkolik çözelti, 5 dakika karıştırıldı ve su içinde seyreltildi - 4 bölümler Leke.
  9. Her slayt bölümü için Eosin Y 2 ml ve akan musluk suyu altında durulayın - 1 kullanın.
  10. Etanol sınıflarda artan bölümleri daldırın dayalı bir montaj mediumand 100X büyütme (Şekil 1D) bir ışık mikroskobu altında gözlemlemek bir 1 saat süreyle Ksilen içinde geçit, lamel sonra, nihayet ve (adım 1.6 bakınız).
  11. </ Ol>

    2. Toplama, Ayrıştırma ve Doku Vitro Analizinde

    1. Bir dermatom kullanarak, sırasıyla 0,6 mm, 1 mm ya da 4 farklı çoklu organ ve / veya çok bagaj alanından kalınlığı 2 mm bağımsız cilt dokusu, papiller de-epidermized dermis (Ded) ya da retiküler dermis (dermis) almak hasat, işleme ve nakli için doku dağıtımını Milli Kuralları (CNT 2013) takip eden 40 ile 55 yıl arasında değişen bir aralıkta doku bağış.
      1. Yavaşça 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde bir çanak koyarak% 0.9 NaCI çözeltisi tüm örnekleri yıkayın.
      2. 5 mm biyopsi yumruk kullanarak, deri dokusunun, Ded ve Dermisinde çapı muntazam ve ayrıştırma önce tüm doku örneklerinin tartmak örnekleri oluşturmak.
      3. ayrıştırma için tuzlu su çözeltisi, 1.5 ml ilave doku bozucu deri dokusu, DED sırasında veya dermiş sekiz, üç ya da dört tip numuneler, yerleştirin.
      4. farklı gerçekleştirinTüm doku örnekleri için ayrıştırma kat, Tablo 1 'de gösterilen.
      5. kontrol olarak bozulmamış doku örneklerinden elde edilen punch biyopsi bir muhabir numarasını kullanın.
      6. Mekanik ayrıştırma sonra ayrı ayrı 12 plaka tek bir kuyuda her numune mikro greft ve yeri ihtiva eden tuz çözeltisi aspire. bozulmamış kontrol punch biyopsi için aynı protokolü gerçekleştirin.
      7. Her bir örnek için,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotikler ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde 1 ml ekleyin.
      8. hemen hücre canlılığı değerlendirmek. her bir (sırasıyla deri dokusu, DED veya dermişi sekiz, üç ya da dört tek tip numuneler aynı anda ayrıştırma ile elde edilir), bir mikro-greft ihtiva eden 0.5 mg / MTT ml (3- [ihtiva eden ortam 1 ml ilave 4,5- dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolyum bromür) çözeltisi ve CO2 / hava% 5 bir atmosferde 37 ° C de 3 saat inkübe edilir. sağlam kontrolü için aynı protokol gerçekleştirmebiyopsi yumruk.
      9. İnkübasyondan sonra, her MTT ihtiva eden ortam çıkarın ve 10 dakika süre ile, her bir numune, 1 ml dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
      10. bir küvet içinde her bir örnek ve DMSO aktarın ve bir spektrofotometre kullanılarak 570 nm'de optik yoğunluk (OD) okunmuştur. 570 nm'de absorbans oranı ve ayrıştırma daha önce kullanılan doku gram (gr) ağırlık hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması. bozulmamış kontrol punch biyopsi için aynı protokolü gerçekleştirin.
    2. Mekanik ayrıştırma sonra, deri dokusu, tek bir vericinin aşınmıştır ve dermis örneklerinden türetilmiş mikro greft ihtiva eden tuzlu su çözeltisi aspire.
      1. 12 oyuklu bir plaka, tek bir oyuk ya da sırasıyla, hücre canlılığı testi ve morfolojik analiz için bir kültür şişesi içinde ayrı ayrı örnek yerleştirin.
      2. % 5 CO2 / AI bir atmosferde 37 ° C 'de, 1 ml (12 çukurlu plaka) ya da 5 ml 1640 ortamında% 10 FCS ile takviye edilmiş RPMI (kültür şişesi) ile antibiyotik ilave kültür mikro greft24 saat ya da 7 gün süre ile R.
      3. 24 saat ya da 7 gün (tekrar 2.1.8-2.1.10 adımlar) sonra hücre canlılığı değerlendirmek.
      4. 24 saat ve şişe içindeki kültür 7 gün sonra ışık mikroskobu ile hücre süspansiyonu varlığını değerlendiren morfolojik analizi yapın.
      5. FACS analizi 6 ile CD146, CD34 ve CD45 antijenleri de dahil olmak üzere mezenşimal ve hematopoetik hücre belirteçleri, için pozitiflik için Dermisinde örneklerini analiz edin.
      6. Laminer akış kapağı tohum altında ve tamamen ayrıştırılmış olup, her doku numunesinde bir muhabir küçük bir parçası (deri dokusu sırasıyla Ded veya dermişi sekiz, üç ya da dört tek tip numuneler aynı anda ayrıştırma ile elde edilir), her mikro-grefti (> büyüklüğü 50 mikron % 5 koyun kanlı Broth 100 ul içeren Columbia agar plaka üzerine parçalanma sürecine sonra).
      7. Üç gün boyunca 37 ° C'de inkübe plakası ve kısırlık değerlendirmek için Columbia agar plakası üzerinde mikrobiyolojik analizler gerçekleştirmek 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu ön çalışmada, ilk hedefimiz kullanıma hazır biyo-kompleksleri üretmek için kolajen gibi bir biyolojik destekle birlikte insan otolog mikro greftler, yeteneğini, araştırmaktır. Bu biyo-kompleksleri, bir hastada yerleştirildi Bir araba kazası (Şekil 2A) yol açtığı bir bacak lezyon ve 30 gün (Şekil 2B) sonra doku onarımı ile ilgili tam bir reepitelizasyon gözlenmiştir. Ayrıca, klinik takip, klinik uygulamaya paralel olarak. 5 aydır (Şekil 2C) sonra hasarlı alanın iyi bir doku ve yumuşaklık gösterdi, in vitro çalışmalar aynı zamanda cilt dokusu gibi farklı deri dokularının hücre canlılığı değerlendirmek için yapılmıştır , Ded ve dermis önce ve bu sistem ile ayrıştırma sonra. Özel olarak, doku, her tür dikkate farklı kalınlık alarak, sekiz eşiğideri dokusu, DED ve derma için tek bir aşamada işlenebilir dört ve üç biyopsiler sırasıyla oluşturulmuştur. Tablo 1 'de gösterildiği gibi biyopsi kurulan sayı daha sonra iyi bir hücre canlılığını korumak için ayrıştırma en iyi durumda belirlemek için biyolojik özelliklerine göre, dört farklı zamanlarda ayrıştırılmış edildi.

Doku işlenmesini kaçınılmaz sağlam doku ile karşılaştırıldığında hücre canlılığının bir bozulma neden olmakla birlikte, bu sistem ile yapılan mekanik parçalanma deri, DED ve dermis tüm örneklerde% 30 hücre canlılığının bir ortalama değerini korumak için görünmektedir 22 OD / gr ila 7 OD / gram FO, sağlam doku (Şekil 3B) ile ilgili olarak farklı zamanlarda (Şekil 3A), değerlendirildi (bozulmamış deri dokusunun 92 OD / gr ve 29 OD / gram ayrıştırma sonrası ortalamar bozulmamış ayrıştırma ve nihayet ayrıştırma açısından sağlam dermis) 2.7 OD / gr 16 OD / gr dan saygı ile ded. Bu nedenle, bu ilk sonuçlar, bu sistem, acil ayrıştırma sonra hücre canlılığı kayda değer seviyesini korumak mümkün olduğunu göstermektedir. hücre canlılığı üzerindeki ayrıştırma etkisi de gözlenmiştir 24 saat ya da 7 gün ve değişken sonuçlar için kültürlendi doku örnekleri üzerinde araştırıldı. Özel olarak, cilt dokusu örneklerinde hücre canlılığının esaslı bir değişiklik başlangıç ​​zamanı (T 0) (Şekil 4A) ile karşılaştırıldığında homojenizasyon ve kültür zaman bağımsız olarak gözlenmiştir. Öte yandan, Ded örnekleri azaltılmış canlılığı kültür 24 saat gözlendi ama şaşırtıcı hücre canlılığı 7 günlük bir kültürden (Şekil 4B) sonra restore süresi (t 0) başlayan kıyasla sonra. Benzer sonuçlar, Şekil 4C (dermis örnekleri gözlenmiştir). Her bir numune, yinelenen ve Tablo 2'de gösterilen değerleri değerlendirildi.

Hücre canlılığı ile birlikte, Tablo 3'te belirtildiği gibi, bu sonuçlar temelinde, cilt dokusuna üç tip hücre canlılığını korumak için ayrıştırma uygun bir zaman tespit kültürlenmiş hücresel süspansiyon morfolojik kısmı da, tek hücreler, belirleme değerlendirilmiştir doku ayrıştırma 24 saat sonra, orada 7 gün ve deri dokusu ve Ded / dermis örneklerinde lif kalıntıları gözlenmiştir süre sonra (Şekil 5 AB). Buna ek olarak, akış sitometri analizi ile hücre karakterizasyonu ve homojenizasyon sonrasında dermiş numunesinde gerçekleştirildi: endotel hücreleri ve mezenkimal kök hücreleri dahil olmak üzere birçok hücre tipi tarafından oluşan hücre heterojen havuzu (Şekil 6) tespit edilmiştir. Ayrıca, bakteriyel büyüme olmaması i tanımlandı n tüm ayrıştırılmış örnekler vaktinde deneysel prosedür (Şekil 7) steril kanıtlayan, Ağar yemekleri numaralı seribaşı.

Şekil 1
Şekil 1. Bio-kompleksleri Bina Doku Doku bozucular ile Ardından Ayrıştırılmış. Biyo-kompleksleri kollajen sünger mikro greft birleştirerek elde edildi oldu Hastanın Lezyon Alanı'ndan Derma bir küçük Piece Bozucu Sistemi (A) ve Koleksiyon lezyon onarımı (C) için kullanılacak insan yamalar hazır elde etmek. (D) Hematoksilen & eozin (H & E) boyama temsili biyo-kompleks DMEM ortamında üç gün boyunca kültüre ve mikroskop gözlenen büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.

içerik "fo: keep-together.within-page =" 1 "> şekil 2
C (Bacak Lezyonu kollajen ve hastadan elde edilen mikro-greft oluşan biyo-Kompleksi Şekil 2. Biyo-Kompleksi uygulama ayağı lezyon (A) uygulanmış ve yara, 30 gün (B) ve 5 ay sonra değerlendirildi ). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. C ell Canlılık hemen Bozulmamış deri Dokular (B). Cilt bakımından deri Dokuların (A) Üç Türü Farklı Times parçalanma sonra, dört farklı donörlerden elde edilen Ded ve dermis dokular doku disru ile ayrıştırılmış edildiolarak ptors metinde uygun bölümünde göstermektedir. Hücre canlılığı, her doku numunesi için iki kopya halinde yapılan MTT testi ile değerlendirildi. Grafik, her numune için iki kopya halinde yapılan dört ayrı deneyi temsil etmektedir. Sonuçlar optik yoğunluk (OD) ve doku gram (gr) arasındaki oran olarak ifade edilmiştir; standart sapma dokusunun Optik yoğunluğun (OD) ve gram (gr) arasındaki oran hesaplandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Cilt Doku (A) Ayrıştırılmış Numunenin Şekil 4. C ell Canlılık Düzeyleri, Ded (B) ve Zaman (T 0) Başlama dermis (C) ve 24 saat ve 7 gün için alt kültürden sonra. Dokular doku ile homojenize edildi indica olarak bozucularMetinde uygun bölümünde te. ayrıştırılmış örnekleri ayrıştırma 24 saat sonra, 7 gün süre ile, daha sonra kültürlendi ve RPMI 1640 ortamında muhafaza,% 5 CO2 / hava atmosferinde 37 ° C 'de% 10 fetal bovin serumu ve antibiyotiklerin ile takviye edilmiştir. daha önce tarif edildiği gibi hücre canlılığı MTT ile değerlendirildi. Grafik, tek bir donörden türetilmiş deri dokusu, DED ve dermis her bir örnek için iki kopya halinde yapılan bir deneyin temsilcisidir. Sonuçlar doku Optik yoğunluğun (OD) ve gram (gr) arasındaki oran olarak ifade edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Ayrıştırılmış Cilt Doku Şekil 5. Morfolojik Analizi (A) ve Ded / dermis (B) sonra 24 saat ve Kültü 7 Gün ure. Morfolojik analiz 24 saat ve cilt dokusu ve Ded / dermis dokularda RPMI ortamında varlığında kültür 7 gün sonra ışık mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Sitometrisi Analizi ile Şekil 6. Hücre Karakterizasyonu. Mekanik ayrıştırma sonra, dermis ile elde edilen mikro greftler kültürde koymak ve 7 gün CD146, CD34 ve CD45 antijenleri de dahil olmak üzere mezenşimal ve hematopoetik hücre belirteci, için pozitiflik için analiz edildikten sonra. Edildi tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

les / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg "/>
Ayrıştırılmış deri dokusu, aşınmıştır ve dermis Örneklerinde Şekil 7. Mikrobiyolojik analizi. Ayrıştırılmış doku örneklerinin küçük fragmanları laminer akış başlığı altında,% 5 koyun kanı (BioMerieux Company) ilave Columbia agar üzerine ekilmiş ve üç gün boyunca 37 ° C'de inkübe edildi prosedürün sterilite mikrobiyolojik analizi gerçekleştirmek ve değerlendirmek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

DOKU ÖRNEKLERİ Ayrıştırma TIMES (sn / dk)
cilt 30 sn
1 dakika
2 dakika
5 dakika
ded 1 dakika
2 dakika
5 dakika
10 dakika
alt deri 1 dakika
2 dakika
5 dakika
10 dakika

Cilt ayrıştırılması için kullanılan dört farklı Times Tablo 1. şematik Temsil, Ded ve Deri Dermis. Sekiz, dört ve üç punch biyopsi, Ded ve dermis sırasıyla biyolojik özelliklerine göre, dört farklı zamanlarda ayrıştırılmış bulundu.

cilt dokusu
için 24 saat 7 gün
2 ' 5 ' 2 ' 5 ' 2 ' 5 '
37.1 41,07143 41,07143 65,78571 41,14286 37,42857
35.8 43,82143 36,60714 66.5 41,46429 38,67857
ded
T 0 24 saat 7 gün
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 7,85567
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
alt deri
için 24 saat 7 gün
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 2,77193 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

Bir Biyolojik Replicate OD / gr olarak ifade Değerleri Tablo 2. Range. Deri dokusundan hücre canlılığı değerleri, Ded ve dermis başlangıç ​​zamanı ve belirtilen sürelerde mekanik ayrıştırma sonra değerlendirilir. sonuçlar, bir deney iki kopya halinde yapıldı ve doku optik yoğunluk (OD) ve gram (gr) arasındaki oran olarak ifade temsilidir.

Örnek Çarpma zamanının
cilt dokusu 5 dakika
ded 1 dakika
derma 2 dakika

Ayrıştırma iyi Zaman Tablo 3. şematik Temsil differe İyi hücre canlılığını korumak içinnt doku örnekleri alındı. Cilt aşınmıştır ve dermis doku örnekleri optimum hücre canlılığı, sırasıyla, ayrıştırma 5, 1 ve 2 dakika sonra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu ön çalışma. Zaten mikro greftler implantların 9 etkinliğini, 10 optimize etmek için, diğer klinik uygulamalarda bildirilen Bu protokol ile elde edilen mikro greftler, kollajen sünger ile kombine edilebilir olduğunu gösterdi Özellikle, bu çalışma bio kapasitesini bildirdi komplekslerdeki klinik uygulamadan 30 gün sonra, bir bacak lezyon yara iyileşmesi adjuvan, mikro-greft ve kolajen süngeri oluşmuştur. Ayrıca, in vitro sonuçlar hemen mekanik ayrıştırma sonra da 24 saat ve kültür 7 gün sonra her ikisi de kayda değer bir hücre canlılığı sürdürmek, üç farklı deri dokuları ayrıştırmak için bu protokolün etkinliği hakkında kanıtlar sunmaktadır.

homojenizasyon bu tür sonra hücre canlılığı bakım geniş manipülasyon kaçınarak, sadece bir adım steril otolog mikro greft halinde elde etmesini sağlar. Bu kanıt uyum içindedirDiğer yeni kağıtları ile hangi in vitro bu protokolün etkinliği periost, kalp atriyum ve göz küresinin 5 lateral rektus kasının biyopsi de dahil olmak üzere dokuların diğer tip, içinde de test edilmiştir. Özellikle, muhtemelen% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş bir ortam kullanılması ile, 7 günlük bir kültürden sonra, aşınmıştır ve dermiş örneklerde artmış hücre canlılığı gözlendi.

hücre canlılığı bakım ek olarak, bu sistem, güvenli ve kullanımı kolay ve birkaç dakika içinde örneğin enzimatik hücre izolasyonu için geleneksel yöntemler ile ilgili olarak, mekanik hücre yapılarının bozulmasını önlemek dokuların farklı parçalamak edebilmektedir yürütme daha uzun zamana ihtiyacı sindirim. Ayrıca, bu sistem 50 mikronluk bir cut-off ile hücreleri seçmek mümkün ve bu aralığı içerir çünkü bu yönü, enjektabl mikro greft başarısı dikkate alınarak çok önemlidirBirçok hücre tiplerinde farklılaştırmak ve daha sonra lezyon onarım iyileştirmek mümkün progenitör hücreler. Bu protokol donör konusu da bu mikro-greft alıcı olduğu göz önüne alındığında, bize canlı değil, aynı zamanda otolog mikro greft elde etmek için değil sadece izin verir. otolog mikro greft elde etmek için bu sistemin kapasitesi özellikle olmayan bir otolog Diş Pulp Kök Hücrelerin bu nakli (DPSCs) gösterilmiştir diş hekimliği alanında bildirildi kemik içi defekt periodontal tamir ve atrofik yenilenmesine katkıda bulunan 5,6 maksilla. Yara iyileşmesi sürecini iyileştirmek için bu mikro-greft yeteneği de daha önce cerrahi müdahaleler veya komplikasyonlar 4 sonra karmaşık yaraların tedavisinde bildirildi.

otolog ve mikro greft kullanıma hazır kullanımı ile ilgili diğer bir avantaj, deri lezyonları üzerindeki sonraki implant görünümünde, steril koşullar tutmaktadır.

Sonuç olarak, bu yazıda anlatılan protokol böyle bu çalışmada belirtilen gibi akut / kronik deri yaraların iyileşmesini geliştirmek için klinik müdahale kullanmak insan mikro greft doku hazır oluşturmak için kapasitesini gösterdi. In vitro sonuçları için olasılığı üzerinde oluşturmak canlı mikro greftler de rapor edilmiştir ve bu parametre doku onarımında başarı yüzdesini arttırmak için kesinlikle önemli olduğunu var. Birlikte ele alındığında, veriler, bu yeni sistem deri yaralarının tedavisi hızlı ve güvenli bir alet ihtiyacı olan klinisyenler için gelecek vaat eden bir araç olarak kabul edilebilir olduğunu göstermiştir.

Şu anda, bu özel uygulamada protokolü için özel modifikasyonlar veya sınırlamalara cilt kullanımı kolay bir doku temsil verilen ve diğer çalışmalarda farklı deri lezyonları 6,7 aynı protokolün etkinliğini rapor, yok

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar Antonio Graziano üretir ve RiGenera sistemini pazarlayan İnsan Beyin Dalga srl ​​Bilimsel Direktörü. Yazar Letizia Trovato İnsan Beyin Dalga srl ​​Bilimsel Bölümü işbirlikçisi olduğu

Acknowledgments

Yazarlar flow sitometri analizi gerçekleştirmek çalışmaya katkıda bulunmak için teşekkürler Dr. Federica Zanzottera istiyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
  2. Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
  3. Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
  4. Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18, (2), 59-70 (2001).
  5. Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. (2015).
  6. Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4, (4), 268-274 (2014).
  7. Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1, (3), 3 (2014).
  8. Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34, (3), s27-s33 (2014).
  9. Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1, (2), 20 (2013).
  10. Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17, (5), 644-647 (2013).
  11. Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics