Gewebecharakterisierung nach einer neuen Disaggregation Methode für Haut Micro-Grafts-Generation

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Summary

Das Protokoll beschreibt eine neue Methode menschliche Gewebe zu disaggregieren und autologe Mikrotransplantate zu schaffen, die mit Kollagenschwämmen kombiniert, bereit Anstieg der menschlichen bio-Komplexe geben bei der Behandlung von Hautläsionen zu verwenden. Dieses System erhält die Lebensfähigkeit der Zellen von Mikrotransplantaten zu verschiedenen Zeiten nach der mechanischen Disaggregation weiter.

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Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

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Abstract

Mehrere neue Methoden wurden auf dem Gebiet der Biotechnologie zu erhalten autologe Zellsuspensionen während der Operation, zu schaffen, um einen Schritt Behandlungen bei akuten und chronischen Hautläsionen entwickelt. Darüber hinaus ist die Behandlung der chronischen, aber auch akute Wunden von Trauma, Diabetes, Infektionen und andere Ursachen, bleibt eine Herausforderung. In dieser Studie beschreiben wir eine neue Methode autologe Mikrotransplantate aus Hautgewebe eines einzelnen Patienten und ihre klinische Anwendung zu erstellen. Darüber hinaus kann in vitro biologische Charakterisierung von Hautgewebe , die aus Haut, de-epidermized Dermis (DED) und Dermis von Multi-organ und / oder multi-Gewebespendern wurde ebenfalls durchgeführt. Alle Gewebe wurden durch dieses neue Protokoll aufgeschlüsselt, so dass wir tragfähige Mikrotransplantate zu erhalten. Insbesondere berichteten wir, dass dieses innovative Protokoll ist in der Lage Bio-Komplexe, die durch autologe Mikrotransplantate und Kollagenschwämme bereit, auf Hautläsionen aufgetragen werden zusammensetzt. Die clinical Anwendung autologer Bio-Komplexe auf einem Bein Läsion wurde auch eine Verbesserung sowohl der Wieder epitalization Prozess und Weichheit der Läsion berichtet, zeigt. Zusätzlich haben unsere in vitro Modell zeigte , dass die Lebensfähigkeit der Zellen nach der mechanischen Disaggregation mit diesem System im Laufe der Zeit bis zu sieben (7) Tagen Kultur gehalten wird. Wir beobachteten auch durch Durchflusszytometrie-Analyse, dass der Pool von Disaggregation erhaltenen Zellen aus mehreren Zelltypen zusammengesetzt ist, einschließlich der mesenchymalen Stammzellen, die eine Schlüsselrolle in den Prozessen der Geweberegeneration und -reparatur, für ihre hohe Regenerationsfähigkeit ausüben. Schließlich haben wir gezeigt , in vitro , dass dieses Verfahren die Sterilität von Mikro-Transplantate beibehält , wenn in Agar Gerichte kultiviert. Zusammenfassend schließen wir, dass diese neue regenerative Ansatz ein viel versprechendes Instrument sein kann, für Kliniker in einem Schritt durchführbar, steril und gebrauchsfertig Mikrotransplantationen zu erhalten, die allein oder in Kombination mit den meisten gängigen biologischen scaffo angewendet werden kann,lds.

Introduction

In den letzten Jahren haben mehrere neue Methoden auf dem Gebiet der Biotechnologie zu erhalten autologe Zellsuspensionen während der Operation, um in einem Schritt entwickelt Behandlungen für akute und chronische Hautläsionen bieten. Darüber hinaus, was die Behandlung von akuten, sondern vor allem chronische Wunden von Trauma, Diabetes, Infektionen und andere Ursachen, bleibt eine Herausforderung. Es gibt zunehmend Hinweise darauf , dass chronische Wunden ein ernstes Thema globale Gesundheit geworden sind, was eine enorme finanzielle Belastung für die Gesundheitssysteme weltweit 1.

Um die Erfolgsrate bei der Behandlung von Hautläsionen, die Abwesenheit umfangreiche Manipulation (einschließlich zelluläre Verstärkung) und die Aufrechterhaltung der sterilen Bedingungen sind wichtig, um erhöhen, um eine Zellsuspension zu erstellen, die auf den beschädigten Bereich der angewendet werden kann sofort Patienten, wodurch eine längere Verarbeitung in Reinräumen wie Zellfabriken zu vermeiden. Stervorragend als Start von kleinen Hautbiopsien, Mahlen, Zentrifugation und andere Trennverfahren (beispielsweise enzymatisch oder mechanisch), werden häufig eine Zellsuspension zu erhalten , verwendet, die in einem Wachstumsmedium kultiviert werden kann. Alle diese Methoden erfordern im allgemeinen eine lange Zeit der Ausführung, die Zellstrukturen Beanspruchung und zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen führt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist es, eine autologe Zellsuspension zu erhalten, bereit, durch Kliniker verwendet werden, beispielsweise beschädigte Bereiche zu reparieren. Darüber hinaus ist es bekannt, dass autologe Gewebetransplantate die Transferverfahren überleben 3 in der Empfängerstelle von den Grundsätzen der Induktion und Leitung 2, um schließlich zu überleben. Die ideale Transplantatgewebe sollte leicht zugänglich sein und haben eine geringe Antigenität und Entnahmemorbidität 4.

Auf der Grundlage dieser Beweise, war das erste Ziel dieser Studie autologe bio-Komplexe zu schaffen, geeignet fürklinische Anwendung bei der Reparatur von Gewebe. Zu diesem Zweck beschreiben wir eine neue Methode autologe mikro Transplantaten zu erhalten, aus Hautgewebe ausgehend, die durch dieses Protokoll wurden disaggregiert. Ein Fall Präsentation wird auch hier als eine klinische Anwendung von autologem Mikro-Transplantate durch dieses Protokoll in Kombination mit Kollagenschwämme beschrieben erhalten. Dieser Ansatz wurde bereits berichtet worden , in der mechanischen Zerlegung von menschlichen Geweben 5 effizient zu sein und es ist klinisch für Transplantate und Regeneration von Hautgewebe 6,7 sowie für regenerative Therapien von Bindegewebe in oral-Maxillofazialchirurg 8-10 verwendet worden .

Zusätzlich wurde das zweite Ziel dieser Studie die biologische Charakterisierung der Hautgewebe nach der Disaggregation durch dieses Protokoll. Zu diesem Zweck abgeleitet verschiedene homologe Proben von Hautgewebe von dem Rumpfbereich verschiedener Multi-Organund / oder Multi-Gewebespender wurden folgende nationale Vorschriften verarbeitet auf Ernte, Verarbeitung und Verteilung von Geweben zur Transplantation (CNT 2013) in der Region Emilia Romagna Hautjordanland.

CASE PRÄSENTATION:

Eine 35-jährige Patientin ein komplexes Trauma wegen Autounfall zeigte, wurde auf der Intensivstation von Ancona Krankenhaus eingeliefert. Der Patient zeigte eine Infektion am Bein aufgrund einer offenen Wunde und einer Verbindung Bruch mit Fixateur externe stabilisiert. Zwei radikale Debridement wurden durchgeführt, und wenn die Wunde wurde sauber nach Unterdrucktherapie (VAC-Therapie) und der Knochenhaut erschien gesund, wir angewendet, um das Protokoll nach zwei Monaten aus der Rückgewinnung. Nach Desaggregation mit diesem System wurden die Mikrotransplantate erhalten verwendet bio-Komplexe mit einem Kollagenschwamm zu erzeugen, das anschließend implantiert, um wurden auf ihre Wirksamkeit auf die Läsion Reparatur zu untersuchen.

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Protocol

Ethik - Erklärung: Da die klinische Anwendung des Protokolls die Verwendung von Haut autologe Gewebe des Patienten erfordert, wurde seine Charakterisierung in vitro vor der klinischen Anwendung auf homologe Hautgewebe in Region Emilia Romagna Haut Bank ausgeführt worden nach den Richtlinien der nationalen Vorschriften über die Ernte, Verarbeitung und Verteilung von Geweben zur Transplantation (CNT 2013).

1. Bio-Komplex von Gebäuden für die klinische Anwendung

Hinweis: Dieses Protokoll ist klinisch basiert auf der Verwendung von Rigeneracons (tissue Disruptor) und dem Rigenera Maschine (tissue Disruptor - System) (1A). Verwendung eines Gitters, die von hexagonal Klingen und Filterzellen und Komponenten der extrazellulären Matrix mit einem cut-off von etwa 50 um das Gewebe Disruptor ist eine biologische medizinische Disruptor von menschlichen Geweben können kleine Stücke von Gewebe zu stören.

  1. Sammeln skinsamples des Patienten durch eine biOPSY Stempel (1B) und disaggregieren Zugabe von 1 ml Kochsalzlösung für jedes Stück autologe Mikrotransplantate erhalten 6,7,9 (oder dem Schritt 2.1 zu sehen).
  2. Platz 1 ml Mikrotransplantate auf Kollagenschwämme (1C) toform bio-Komplexe für die klinische Anwendung zu verwenden.
  3. Kultur weitere 1 ml von Mikrotransplantaten auf Kollagenschwämmen in Gegenwart von 6 ml DMEM - Medium mit 10% fötalem Rinderserum bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre.
  4. Nach 3 Tagen nach der Kultur, fixieren die bio-Komplexe mit 0,3% Paraformaldehyd für 10 min bei RT. Gießen Sie das Paraffin mit einem bestimmten Spender direkt auf die Probe. Erhalten Scheiben mit einem Mikrotom mit einer Dicke von 5 & mgr; m und direkt in einem Glasobjektträger gegeben.
  5. Tauchen Paraffinschnitten von 5 um in einem Glas für histologische Analysen, enthaltend 15 - 20 ml Xylene (im Handel erhältlich - eine Mischung aus m-Xylol (40 - 65%), p-Xylol (20%), o-Xylol (20% ) und ethyl benzol (6-20%) und Spuren von Toluol, Trimethylbenzol, Phenol, Thiophen, Pyridin und Schwefelwasserstoff) für 3 min pro.
  6. Eintauchen der Scheiben in abnehmOrten (100% bis 70%) aus Ethanol (100% Ethanol für 1 h, 95% Ethanol für 1 h, 80% Ethanol für 1 h, 70% Ethanol für 1 h) und anschließend entionisiertes Wasser für de-paraffinizing und Rehydratisieren der Abschnitte.
  7. Stain die Abschnitte mit 1 bis 2 ml 1 g / l Ematoxylin mit 1 - 2 Minuten und spülen Sie anschließend in Wasser jeden Ematoxylin Überschuss zu entfernen.
  8. Stain die Abschnitte für 4 - 5 min mit Eosin Y alkoholischer Lösung bei 1% Konzentration gemischt mit Ethanol 70% und in Wasser verdünnt.
  9. Mit 1 - 2 ml Eosin Y für jede Folie Abschnitt und spülen Sie unter fließendem Leitungswasser.
  10. Tauchen Abschnitte in den Klassen von Ethanol zu erhöhen (siehe Schritt 1.6) und schließlich nach einer Passage in Xylen für 1h, Deck mit einer Basis-Montage mediumand beobachten unter einem Lichtmikroskop bei 100 - facher Vergrößerung (Abbildung 1D).
  11. </ Ol>

    2. Erhebung, Disaggregation und In - vitro - Analyse der Gewebe

    1. Mit einem Dermatom, nehmen unabhängige Hautgewebe, papillär de-epidermized Dermis (DED) oder Retikulärdermis (Dermis), die jeweils von 0,6 mm, 1 mm oder 2 mm Dicke aus dem Kofferraum von 4 verschiedenen Multi-Organ-und / oder multi- Gewebespender in einem Bereich von 40 bis 55 Jahren, nach nationalen Vorschriften über die Ernte, Verarbeitung und Geweben zur Transplantation (CNT 2013) zu verteilen.
      1. Spülen Sie vorsichtig alle Proben in 0,9% NaCl-Lösung sie in einer Schale auf einem Orbitalschüttler für 5 Minuten setzen.
      2. Mit dem 5-mm-Biopsie Stempel erstellen Proben, die einen Durchmesser von Hautgewebe einheitlich sind, DED und Dermis und wiegen alle Gewebeproben vor dem Disaggregierung.
      3. Legen Sie acht, drei oder vier einheitliche Proben von Hautgewebe, Ded oder Dermis bzw. im Gewebe Disruptor, Zugabe von 1,5 ml Salzlösung für die Disaggregation.
      4. Führen Sie verschiedeneZeiten der Disaggregation für alle Gewebeproben , wie in Tabelle 1 angegeben.
      5. Verwenden Sie ein Korrespondent Anzahl von Stanzbiopsien abgeleitet aus intakten Gewebeproben als Kontrollen.
      6. Nach der mechanischen Disaggregierung absaugen Salzlösung, die Mikro-Transplantate und Ort separat jede Probe in einer einzigen Vertiefung einer 12-Well-Platte. Führen Sie das gleiche Protokoll für intakte Kontrolle Stanzbiopsien.
      7. 1ml RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika zu jeder Probe.
      8. Bewerten Sie sofort die Lebensfähigkeit der Zellen. Zu jeder Vertiefung ein Mikro-Graft (erhalten durch die gleichzeitige Disaggregation von acht, drei oder vier einheitliche Proben von Hautgewebe, Ded oder Dermis beziehungsweise) enthält, fügen Sie 1 ml Medium, das 0,5 mg / ml MTT (3- [4,5- Dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyltetrazoliumbromid) Lösung und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 / Luft. Führen Sie das gleiche Protokoll für intakte KontrolleStanzbiopsien.
      9. Nach der Inkubation entfernen Sie alle MTT-Medium mit und für 10 Minuten zu jeder Probe 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzuzufügen.
      10. Übertragen, um jede Probe und DMSO in einer Küvette und Lesen bei der optischen Dichte (OD) bei 570 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. Berechnen Zellebensfähigkeit als das Verhältnis der Extinktion bei 570 nm und das Gewicht in Gramm (g) des Gewebes vor Disaggregation verwendet. Führen Sie das gleiche Protokoll für intakte Kontrolle Stanzbiopsien.
    2. Nach der mechanischen Disaggregierung absaugen Salzlösung Mikro-Graft aus Hautgewebe, DED und Dermis Proben von einem einzigen Spender abgeleitet enthält.
      1. Platzieren separat jede Probe in einem einzigen Well einer 12-Well-Platte oder in einer Kulturflasche für Zelllebensfähigkeit-Test und morphologische Analyse sind.
      2. Kultur Mikrotransplantate Zugabe von 1 ml (12-Well - Platte) oder 5 ml (Kulturflasche) RPMI 1640 - Medium mit 10% FBS und Antibiotika ergänzt bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 / air für 24 Stunden oder 7 Tage.
      3. Bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellen nach 24 Stunden oder 7 Tage (wiederholen Sie die Schritte 2.1.8-2.1.10).
      4. Führen Sie die morphologische Analyse das Vorhandensein von Zellsuspension durch Lichtmikroskopie nach 24 Stunden und 7 Tagen der Kultur in der Flasche zu bewerten.
      5. Analysieren Sie die Proben der Dermis für Positivität auf die mesenchymalen und hämatopoetischen Zellmarker, einschließlich CD146, CD34 und CD45 - Antigene durch FACS - Analyse 6.
      6. Unter Laminarströmungsabzug Samen jeder Mikro-Graft (erhalten durch die gleichzeitige Disaggregation von acht, drei oder vier einheitliche Proben von Hautgewebe, Ded oder Dermis beziehungsweise) und einem Korrespondenten kleines Fragment jeder Gewebeprobe nicht vollständig aufgeschlüsselte (> 50 Mikrometer Größe nach Auflösung Prozess) auf Columbia-Agar-Platte 5% Schafblut Brühe 100 & mgr; l enthält.
      7. Die Platte bei 37 ° C für drei Tage und führen die mikrobiologische Analyse auf Columbia - Agar - Platte, um die Sterilität zu bewerten 11.

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Representative Results

In dieser vorläufigen Studie war das erste Ziel, die Fähigkeit von menschlichen autologe mikro Transplantate mit einer biologischen Träger, wie Collagen kombiniert zu untersuchen, bio-Komplexe gebrauchsfertig herzustellen. Diese bio-Komplexe wurden in einem Patienten implantiert mit einer Bein Läsion durch einen Autounfall (2A) verursacht wird und eine vollständige Reepithelialisierung mit Gewebereparatur assoziiert nach 30 Tagen (2B) beobachtet. Darüber hinaus wurden die klinische Follow-up nach 5 Monaten eine gute Textur und Weichheit des beschädigten Bereich zeigte (Abbildung 2C). Parallel zur klinischen Anwendung, in - vitro - Studien auch die Lebensfähigkeit der Zellen von verschiedenen Hautgewebe wie Hautgewebe zu bewerten durchgeführt Ded und Dermis vor und nach durch dieses System Disaggregierung. Insbesondere unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Dicke jeder Art von Gewebe, die Schwelle von acht,vier und drei Biopsien, die jeweils in einem einzigen Schritt für Hautgewebe, DED und Dermis, verarbeitet werden können, hergestellt wurde. Die festgelegte Anzahl von Biopsien wurden dann zu vier verschiedenen Zeiten aufgeschlüsselt , wie in der Tabelle 1, nach ihren biologischen Eigenschaften angegeben , um den optimalen Zustand der Disaggregation zu identifizieren , um eine gute Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht zu erhalten.

Obwohl die Gewebeverarbeitung selbst zwangsläufig eine Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu intaktem Gewebe induziert wird, die mechanische Disaggregation mit diesem System durchgeführt, scheint in allen Proben von Haut, Dermis DED und einen Mittelwert der Lebensfähigkeit der Zellen von 30% zu halten zu unterschiedlichen Zeitpunkten bewertet (3A), in Bezug auf intakte Gewebe (3B) (Mittelwert von 92 OD / gr für intakte Hautgewebe und 29 OD / gr nach Auflösung, von 22 OD / gr bis 7 OD / gr for intakt in Bezug auf Disaggregierung DED und schließlich von 16 OD / gr bis 2,7 OD / gr für intakte Dermis in Bezug auf Disaggregation). Somit zeigen diese vorläufigen Ergebnisse, daß dieses System in der Lage ist, nennenswerte Mengen an Zellebensfähigkeit nach sofortiger Disaggregation aufrechtzuerhalten. Die Wirkung von Disaggregation auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auch für 24 h oder 7 Tage auf Gewebeproben untersucht und unterschiedliche Ergebnisse beobachtet wurden. Insbesondere wurde durch die Zeit der Homogenisierung und Kultur im Vergleich zum Startzeitpunkt (T 0) (4A) unabhängig voneinander keine wesentliche Veränderung der Lebensfähigkeit der Zellen in Proben Hautgewebe beobachtet. Auf der anderen Seite eine verringerte Lebensfähigkeit des DED Proben nach 24 Stunden der Kultur zu Startzeit (T 0) im Vergleich beobachtet wurde aber überraschend wurde die Lebensfähigkeit der Zellen nach 7 Tagen in Kultur (4B) wiederhergestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für Proben von Dermis (4C beobachtet). Jede Probe wurde in Doppelbestimmung und Werte in der Tabelle 2 angegeben ausgewertet.

Auf der Grundlage dieser Ergebnisse haben wir die geeignete Zeit der Disaggregation identifiziert die Lebensfähigkeit der Zellen für drei Arten von Hautgewebe zu halten , wie in Tabelle 3 Zusätzlich zu der Lebensfähigkeit der Zellen berichtet, wurde die morphologische Aspekt der kultivierten Zellsuspension auch einzelne Zellen untersucht, die Identifizierung nach 24 Stunden aus dem Gewebe Disaggregierung, während nach 7 Tagen dort Reste von Fasern in den beiden Hautgewebe und Ded / Dermis Proben wurden beobachtet (Abbildung 5 aB). Zusätzlich wurde eine Zellcharakterisierung mittels Durchflusszytometrie - Analyse in einer Probe von Dermis nach seiner Homogenisierung durchgeführt: a heterogenen Pool von von mehreren Zelltypen zusammengesetzt Zellen, einschließlich Endothelzellen und mesenchymalen Stammzellen identifiziert (Abbildung 6). Darüber hinaus wurde ich das Fehlen von Bakterienwachstum identifiziert n alle aufgeschlüsselte Proben ausgesät opportunely auf Agar Gerichte, zum Nachweis der Sterilität der Versuchsdurchführung (Abbildung 7).

Abbildung 1
Abbildung 1. Bio-Komplexe Gebäude Tissue Brechender - System (A) und Sammlung von einem kleinen Stück Derma aus der Schädigungsbereich des Patienten , die anschließend Disaggregierte mit Gewebe Disruptoren war. Die Bio-Komplexe wurden erhalten die Mikrotransplantate auf Kollagenschwämme Kombination menschliche Patches zu erhalten bereit für Läsion Reparatur zu verwenden (C). (D) Hematoxylin & Eosin (H & E) Färbung eines repräsentativen Bio-Komplex kultiviert für drei Tage in DMEM - Medium , und beobachtet die Mikroskopie Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehen diese Figur.

Inhalt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Abbildung 2. Bio-Komplexe Anwendung auf Leg Lesion Die Bio-Komplexe bestehend aus Kollagen und Mikro-Transplantate von dem Patienten erhalten wurden am Bein Läsion (A) aufgebracht und die Wunde wurde nach 30 Tagen ausgewertet (B) und 5 Monate (C ). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. C ell Viability Unmittelbar nach Disaggregation zu unterschiedlichen Zeiten von drei Arten von Hautgewebe (A) in Bezug auf Intact Hautgewebe (B). Die Haut, DED und Dermis von vier verschiedenen Spendern abgeleitet Gewebe wurden mit Gewebe disru aufgeschlüsseltptors als zeigen in den entsprechenden Abschnitt im Text. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch MTT-Test durchgeführt, in zweifacher Ausfertigung für jede Gewebeprobe bewertet. Der Graph ist repräsentativ für vier verschiedene zweifach durchgeführt Experimente für jede Probe. Die Ergebnisse sind als Verhältnis zwischen der optischen Dichte (OD) und g (gr) von Gewebe exprimiert wird; die Standardabweichung auf dem Verhältnis zwischen der optischen Dichte (OD) und Gramm (g) des Gewebes berechnet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. C ell Viability Ebenen eines Disaggregierte Probe von Hautgewebe (A), Ded (B) und Dermis (C) Startzeit (T 0) und nach Subkultur für 24 Stunden und 7 Tage. Die Gewebe wurden mit Gewebe homogenisiert Disruptoren wie indicate im entsprechenden Abschnitt im Text. Die aufgeschlüsselte Proben wurden anschließend für 24 Stunden und 7 Tage nach der Desaggregation und in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika, bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 / Luft gehalten. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch MTT bewertet wie zuvor beschrieben. Der Graph ist repräsentativ für einen zweifach durchgeführt Experiment für jede Probe von Hautgewebe, DED und Dermis von einem einzigen Spender stammen. Die Ergebnisse werden als Verhältnis zwischen der optischen Dichte (OD) und Gramm (g) des Gewebes ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Morphologische Analyse von Disaggregierte Hautgewebe (A) und Ded / Dermis (B) nach 24 Stunden und 7 Tage von Cult ure. Morphologische Analyse wurde unter Verwendung von Lichtmikroskopie nach 24 Stunden und 7 Tagen der Kultur in Gegenwart von RPMI - Medium auf das Hautgewebe und Ded / Dermis Gewebe durchgeführt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Zellcharakterisierung mittels Durchflusszytometrie Analyse. Nach der mechanischen Disaggregation Mikrotransplantate von Dermis erhalten wurden in Kultur gesetzt und nach 7 Tagen auf Positivität zu mesenchymalen und hämatopoetischen Zellmarker analysiert wurden, einschließlich CD146, CD34 und CD45 - Antigene. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 7. Die mikrobiologische Analyse von Disaggregierte Hautgewebe, DED und Dermis Proben. Kleine Fragmente von disaggregierten Gewebeproben wurden ausgesät auf Columbia Agar von 5% Schafblut (BioMerieux Company) unter Laminar - Flow - Haube und bei 37 ° C für drei Tage führen die mikrobiologische Analyse und Bewertung der Sterilität des Verfahrens. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Gewebeproben Disaggregierung TIMES (sec / min)
Haut 30 sec
1 Minute
2 Minuten
5 Minuten
Ded 1 Minute
2 Minuten
5 Minuten
10 Minuten
Dermis 1 Minute
2 Minuten
5 Minuten
10 Minuten

Tabelle 1 : Schematische Darstellung der vier verschiedenen Zeiten verwendet für Disaggregation von Haut, DED und Dermis. Acht, vier und drei Stanzbiopsien von Haut, DED und Dermis wurden jeweils zu vier verschiedenen Zeiten aufgeschlüsselt nach ihren biologischen Eigenschaften.

Hautgewebe
Nach 24 Stunden 7 Tage
2 ' 5 ' 2 ' 5 ' 2 ' 5 '
37.1 41,07143 41,07143 65,78571 41,14286 37,42857
35.8 43,82143 36,60714 66,5 41,46429 38,67857
Ded
T 0 24 Stunden 7 Tage
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 7,85567
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
Dermis
Nach 24 Stunden 7 Tage
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 2,77193 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

Tabelle 2. Wertebereich in OD / gr ausgedrückt für eine biologische Replizieren. Die Werte der Lebensfähigkeit der Zellen aus Hautgewebe, DED und Dermis ausgewertet Zeit beginnt und nach der mechanischen Disaggregierung zu angegebenen Zeiten. Die Ergebnisse sind repräsentativ für einen Versuch doppelt durchgeführt und als Verhältnis zwischen der optischen Dichte (OD) und g (gr) des Gewebes ausgedrückt.

Probe Zerlegungszeit
Hautgewebe 5 Minuten
Ded 1 Minute
Derma 2 Minuten

Tabelle 3. Schematische Darstellung der Best Time of Disaggregation zu pflegen eine gute Zelllebensfähigkeit in Different - Gewebeproben. Haut, DED und Dermis Gewebeproben zeigen die optimale Lebensfähigkeit der Zellen nach 5, 1 und 2 min von Disaggregierung sind.

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Discussion

Diese vorläufige Studie zeigte , dass Mikrotransplantate dieses Protokoll erhalten werden , können mit Kollagenschwämmen kombiniert werden, wie bereits in anderen klinischen Anwendungen berichtet, um die Wirksamkeit von Mikrotransplantaten Implantate 9, 10 zu optimieren. Insbesondere diese Studie berichtet die Kapazität von bio -Komplexe, gebildet durch Mikrotransplantate und Kollagenschwämmen, die Wundheilung eines Beines Läsion adjuvanten nach 30 Tagen aus der klinischen Anwendung. Darüber hinaus in - vitro - Ergebnisse liefern Beweise über die Wirksamkeit dieses Protokolls drei verschiedenen Hautgewebe aufzuschlüsseln, eine merkliche Lebensfähigkeit der Zellen Aufrechterhaltung sowohl unmittelbar nach der mechanischen Disaggregation und auch nach 24 Stunden und 7 Tagen der Kultur.

Die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen nach dieser Art der Homogenisierung kann in nur einem Schritt sterile autologe mikro Transplantate, die Vermeidung umfangreiche Manipulation zu erhalten. Dieser Nachweis ist in Übereinstimmungmit anderen neueren Arbeiten , in denen die Wirksamkeit dieses Protokolls in vitro wurde auch in einer anderen Art von Gewebe getestet, einschließlich Periost Biopsie von Herzvorkammern und rectus lateralis des Augapfels 5. Insbesondere beobachteten wir in DED und Dermis Proben eine erhöhte Lebensfähigkeit der Zellen nach 7 Tagen Kultur, wahrscheinlich aufgrund der Verwendung eines Mediums mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt war.

Neben der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen ist dieses System sicher und einfach zu bedienen und in wenigen Minuten in der Lage ist, um mechanisch verschiedene Arten von Gewebe zu verhindern, die Störungen der Zellstrukturen in Bezug auf die traditionellen Methoden der Zellisolation, wie enzymatische disaggregieren Verdauung, die längere Zeit der Ausführung erfordern. Darüber hinaus ist dieses System in der Lage Zellen mit einem cut-off von 50 Mikrometern zu wählen, und dieser Aspekt ist sehr wichtig im Hinblick auf den Erfolg der injizierbaren Mikrotransplantate, weil dieser Bereich umfasstVorläuferzellen in vielen Zelltypen zu differenzieren können und dann die Läsion Reparatur zu verbessern. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, nicht nur lebensfähig, sondern auch autologe mikro grafts, gegeben zu erhalten, dass der Spender unterliegt auch der Akzeptor dieser Mikrotransplantate. Die Kapazität dieses Systems autologe mikro Transplantaten zu erhalten, insbesondere im Bereich der Zahnmedizin wurde berichtet, wo es, dass die Transplantation von autologem Zahnpulpa Stammzellen (DPSCs) in einem nicht enthaltenen infraalveolären Defekt der atrophischen beigetragen periodontalen Reparatur und Regeneration gezeigt wurde, Oberkiefer 5,6. Die Fähigkeit dieser Mikrotransplantate wurde auch die Wundheilung zu verbessern , die zuvor in der Verwaltung von komplexen Wunden nach chirurgischen Eingriffen oder Komplikationen 4 berichtet.

Ein weiterer Vorteil für die Verwendung von autologem und bereit Mikrotransplantate zu verwenden ist sicherlich die Aufbewahrung von sterilen Bedingungen im Hinblick auf ihre spätere Implantat auf den Hautläsionen.

Im Ergebnis zeigte das Protokoll in diesem Papier beschrieben , die Kapazität menschlichen Mikrotransplantatgewebe bereit zu schaffen in klinischen Intervention zu verwenden Heilung von akuten / chronischen Hautwunden zu verbessern, wie die in dieser Studie angedeutet ist . In - vitro - Ergebnisse auf die Möglichkeit zu schaffen tragfähige Mikrotransplantate wurden ebenfalls berichtet, und dieser Parameter ist sicherlich signifikant den Prozentsatz des Erfolgs in der Reparatur von Gewebe zu erhöhen. Zusammengenommen zeigten die Daten, dass dieses neue System könnte ein vielversprechendes Werkzeug für Kliniker in Betracht gezogen werden, die in der Notwendigkeit einer schnellen und sicheren Instrument bei der Behandlung von Hautwunden sind.

Im Moment gibt es keine besonderen Änderungen oder Einschränkungen für das Protokoll in dieser speziellen Anwendung, da die Haut ein Gewebe leicht zu bedienen und in anderen Studien stellt berichteten wir über die Wirksamkeit des gleichen Protokolls in verschiedenen Hautläsionen 6,7

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Disclosures

Der Autor Antonio Graziano ist wissenschaftlicher Direktor von Human Brain Wave-srl, die die Rigenera System produziert und vermarktet. Der Autor Letizia Trovato ist Mitarbeiter der wissenschaftlichen Abteilung von Human Brain Wave srl

Acknowledgments

Die Autoren möchten dankt Dr. Federica Zanzottera zu der Studie beigetragen Durchflusszytometrie Analyse durchgeführt wird.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
  2. Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
  3. Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
  4. Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18, (2), 59-70 (2001).
  5. Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. (2015).
  6. Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4, (4), 268-274 (2014).
  7. Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1, (3), 3 (2014).
  8. Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34, (3), s27-s33 (2014).
  9. Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1, (2), 20 (2013).
  10. Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17, (5), 644-647 (2013).
  11. Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).

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