Tissue Characterization efter en ny Disaggregation metod för Skin Micro-Grafts Generation

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protokollet beskriver en ny metod för att dela upp mänskliga vävnader och skapa autologa mikro transplantat som, i kombination med kollagen tvättsvamp, ger upphov till bio-komplex mänskliga redo att använda vid behandling av hudskador. Vidare bevarar detta system cellviabilitet mikro transplantat vid olika tidpunkter efter mekanisk uppdelning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Flera nya metoder har utvecklats inom bioteknik för att få autologa cellulära suspensioner under operation, för att ge ett steg behandlingar för akuta och kroniska hudskador. Dessutom förvaltningen av kroniska men också akuta sår till följd av trauma, diabetes, infektioner och andra orsaker, förblir utmanande. I denna studie beskriver vi en ny metod för att skapa autologa mikro transplantat från kutan vävnad av en patient och deras kliniska tillämpning. Dessutom in vitro biologisk karaktärisering av kutan vävnad som härrör från huden, de-epidermized dermis (Ded) och dermis av flera organ och / eller flera vävnadsdonatorer utfördes också. Alla vävnader uppdelat efter denna nya protokollet, vilket tillåter oss att få livskraftiga mikro transplantat. I synnerhet rapporterade vi att denna innovativa protokoll kan skapa bio-komplex som består av autologa mikro transplantat och kollagensvampar redo att appliceras på hudskador. den Clinical tillämpning av autologa biologiska komplex på ett ben skada rapporterades också, visar en förbättring av både åter epitalization process och mjukhet av skadan. Dessutom, vår in vitro-modell visade att cellviabiliteten efter mekanisk uppdelning med detta system bibehålls över tid för upp till sju (7) dagars odling. Vi observerade också, genom flödescytometrianalys, att poolen av celler erhållna från uppdelning består av flera celltyper, inklusive mesenkymala stamceller, som utövar en nyckelroll i processerna för vävnadsregenerering och reparation, för sin höga regenerativ potential. Slutligen är vi demonstreras in vitro att detta förfarande bibehåller steriliteten hos mikro transplantat när de odlas i agar rätter. Sammanfattningsvis, vi dra slutsatsen att den nya regenerativ metod kan vara ett lovande verktyg för kliniker för att få i ett steg livskraftig, steril och redo att använda mikro-transplantat som kan användas separat eller i kombination med de vanligaste biologiska scaffoLDS.

Introduction

Under de senaste åren har flera nya metoder utvecklats inom bioteknik för att få autologa cellulära suspensioner under operationen för att tillhandahålla ett steg behandlingar för akuta och kroniska hudskador. Dessutom behandling av akuta men främst kroniska sår till följd av trauma, diabetes, infektioner, och andra orsaker, förblir utmanande. Det finns bevis för att kroniska sår har blivit ett allvarligt globalt hälsoproblem, som orsakar en enorm ekonomisk börda för hälso- och sjukvårdssystemen i hela världen en.

För att öka graden av framgång vid behandling av hudskador, avsaknad av omfattande manipulation (inbegripet cell förbättring) och upprätthållande av sterila förhållanden är viktigt för att skapa en cellulär suspension som omedelbart kan tillämpas på det skadade området av patienter på så sätt undvika en längre behandling i renrum som cellfabriker. stArting från små hudbiopsier, slipning, centrifugering och andra separationsmetoder (t.ex. enzymatisk eller mekanisk), används ofta för att erhålla en cellulär suspension, som kan odlas i ett tillväxtmedium. Alla dessa metoder kräver i allmänhet en lång tid för utförande, betonar de cellstrukturer, och leder till en minskning av cellviabilitet. En annan viktig aspekt är att erhålla en autolog cellulär suspension redo att användas av läkare, till exempel för att reparera skadade områden. Dessutom är det väl etablerat att autologa vävnadstransplantat överleva överföringsförfaranden för att så småningom överleva i mottagarens sida av principerna om induktion och ledning 2, 3. Bör Den ideala transplantatvävnad vara lätt tillgängliga och har låg antigenicitet och tagstället sjuklighet 4.

På grundval av dessa bevis, det första målet med denna studie var att skapa autologa bio-komplex som är lämpliga förklinisk tillämpning i vävnadsreparation. För detta ändamål beskriver vi en ny metod för att få autologa mikro transplantat från och kutana vävnader som uppdelade efter detta protokoll. Ett fall presentation också häri beskrivas som en klinisk tillämpning av autologa mikro transplantat som erhålls genom detta protokoll i kombination med kollagensvampar. Detta tillvägagångssätt har redan rapporterats vara effektiv i den mekaniska uppdelning av mänskliga vävnader 5 och det har använts kliniskt för transplantat och regenerering av dermala vävnader 6,7 samt regenerativa terapier av bindväv i oral-käkkirurgi 8-10 .

Dessutom andra syftet med denna studie var den biologiska karakteriseringen av de kutana vävnader efter sin uppdelning av detta protokoll. För detta syfte, olika homologa prover av kutan vävnad härledd från stammen område med olika många organoch / eller flera vävnadsdonatorer bearbetades efter nationella regler om avverkning, bearbetning och distribution av vävnader för transplantation (CNT 2013) på Emilia Romagna regionala Skin Bank.

CASE PRESENTATION:

En 35-årig kvinnlig patient som visar en komplex trauma på grund av bilolycka medgavs till intensivvårdsavdelning Ancona sjukhus. Patienten visade en infektion i benet på grund av ett öppet sår och en sammansatt fraktur stabiliserad med extern fixering. Två radikal debridering utfördes och när såret blev ren efter undertryck terapi (VAC terapi) och benhinnan verkade frisk, tillämpade vi protokollet efter två månader från återhämtning. Efter uppdelning med detta system var mikro transplantat erhållna används för att skapa bio-komplex med en kollagensvamp som därefter implanterades i syfte att undersöka deras effekt på den skada reparation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: eftersom den kliniska tillämpningen av protokollet kräver användning av kutan autolog vävnad hos patienten, dess karakterisering in vitro utfördes innan klinisk användning på homolog kutan vävnad vid Emilia Romagna regionala Skin Bank följer riktlinjerna av nationella bestämmelser om avverkning, bearbetning och distribuera vävnader för transplantation (CNT 2013).

1. Bio-komplex byggnad för klinisk tillämpning

OBS: Detta protokoll är kliniskt baserat på användningen av Rigeneracons (vävnadsstörande) och Rigenera Machine (vävnads disruptor system) (Figur 1A). Vävnads disruptor är en biologisk medicinsk disruptor av mänskliga vävnader som kan störa små bitar av vävnader med hjälp av ett galler som tillhandahålls av hexagonala blad och filtreringsceller och komponenter i extracellulär matris med en cut-off på ungefär 50 mikron.

  1. Samla skinsamples hos patienten genom en biopsy stansen (Figur 1B) och disaggregera sätta 1 ml koksaltlösning för varje del för att erhålla autologa mikro transplantat 6,7,9 (eller se steg 2.1).
  2. Placera 1 ml mikro transplantat på kollagensvampar (Figur 1C) toform bio-komplex att använda för klinisk tillämpning.
  3. Kultur ytterligare 1 ml mikro transplantat på kollagensvampar i närvaro av 6 ml DMEM-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad atmosfär.
  4. Efter 3 dagars odling, fixa bio-komplex med 0,3% paraformaldehyd under 10 minuter vid RT. Häll paraffin med en specifik dispenser direkt på provet. Erhålla skivor med en mikrotom med en tjocklek av 5 | j, m och sätta direkt i en glas-slide.
  5. Doppa paraffin skivor av 5 | am i ett glas för histologiska analyser, innehållande 15 - 20 ml Xylen (kommersiellt tillgänglig - en blandning av m-xylen (40 - 65%), p-xylen (20%), o-xylen (20% ) och ethyl bensen (6 - 20%) och spår av toluen, trimetylbensen, fenol, tiofen, pyridin och vätesulfid) under 3 min vardera.
  6. Doppa skivorna i minskande grader (100% till 70%) av etanol (100% etanol under 1 timme, 95% etanol under 1 timme, 80% etanol under 1 timme, 70% etanol under 1 timme) och därefter avjoniserat vatten för de-paraffinizing och återfukt sektionerna.
  7. Fläcka sektionerna med 1 - 2 ml av 1 g / L Ematoxylin under 1 - 2 min och därefter skölj i vatten för att avlägsna eventuell Ematoxylin överskott.
  8. Färga sektioner för 4-5 min med Eosin Y alkohollösning vid 1% av koncentrationen blandas med etanol 70% och späddes i vatten.
  9. Använd 1 - 2 ml Eosin Y för varje bild sektion och skölj under rinnande kranvatten.
  10. Fördjupa sektioner i att öka kvaliteter av etanol (se steg 1.6) och slutligen, efter en passage i Xylen under 1 h, täckglas med ett baserat montering mediumand observera under ett ljusmikroskop vid 100 gångers förstoring (Figur 1D).
  11. </ Ol>

    2. Insamling, Disaggregation och In Vitro Analys av vävnader

    1. Med hjälp av en dermatom, ta oberoende hudvävnad, papillär de-epidermized dermis (Ded) eller retikulära dermis (Dermis) respektive 0,6 mm, 1 mm eller 2 mm i tjocklek från bagageutrymmet 4 olika multi-organ och / eller multi- vävnadsdonatorer i ett område från 40 till 55 år, efter nationella regler om avverkning, bearbetning och distribution av vävnader för transplantation (CNT 2013).
      1. Skölj försiktigt alla prover i 0,9% NaCl-lösning att sätta dem i en skål på en skakapparat under 5 minuter.
      2. Använda 5-mm biopsistans, skapa prover som är likformig diameter från hudvävnad, Ded och dermis och väger alla vävnadsprover före uppdelning.
      3. Sätt åtta, tre eller fyra enhetliga prover av hudvävnad, Ded eller Dermis respektive i vävnaden disruptor, lägga 1,5 ml saltlösning för uppdelning.
      4. utföra olikatider uppdelning för alla vävnadsprover som anges i tabell 1.
      5. Använd en korrespondent antal stansbiopsier härledda från intakta vävnadsprover som kontroller.
      6. Efter mekanisk disaggregation, aspirera saltlösning innehållande mikro transplantat och plats separat varje prov i en enda brunn i en 12-brunnars platta. Utför samma protokoll för intakt kontroll stansbiopsier.
      7. Tillsätt 1 ml RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och antibiotika till varje prov.
      8. Utvärdera cellviabiliteten omedelbart. Till varje brunn innehållande en mikro-transplantat (erhållen genom samtidig uppdelning av åtta, tre eller fyra likformiga prover av hudvävnad, Ded eller Dermis respektive) Tillsätt 1 ml medium innehållande 0,5 mg / ml MTT (3- [4,5- dimetyltiazol-2-yl] -2,5 difenyltetrazoliumbromid) lösning och inkubera under 3 h vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2 / luft. Utför samma protokoll för intakt kontrollstansbiopsier.
      9. Efter inkubation, ta bort alla medium innehållande MTT och lägga till varje prov en ml dimetylsulfoxid (DMSO) under 10 minuter.
      10. Överföra varje prov och DMSO i en kyvett och avlästes vid optiska densiteten (OD) vid 570 nm med användning av en spektrofotometer. Beräkna cellviabilitet som förhållandet mellan absorbansen vid 570 nm och vikten i gram (GR) av vävnad som används före uppdelning. Utför samma protokoll för intakt kontroll stansbiopsier.
    2. Efter mekanisk uppdelning, aspirera saltlösning innehållande mikro transplantat som härrör från hudvävnad, Ded och dermis prover av en enda donator.
      1. Placera separat varje prov i en enda brunn i en 12-brunnsplatta eller i en odlingskolv för cellviabilitet test och morfologisk analys respektive.
      2. Kultur mikro transplantat tillsats av 1 ml (12-brunnar) eller 5 ml (odlingskolv) i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% FBS och antibiotika vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2 / air under 24 h eller 7 dagar.
      3. Utvärdera cellviabiliteten efter 24 h eller 7 dagar (upprepa steg 2.1.8-2.1.10).
      4. Utför morfologisk analys utvärderar närvaron av cellsuspensionen med Ijusmikroskopi efter 24 timmar och 7 dagar av kultur i kolven.
      5. Analysera prover av Dermis för positivitet till mesenkymala och hematopoetiska cellmarkörer, inklusive CD146, CD34 och CD45 antigener genom FACS-analys 6.
      6. Under laminärt flöde huva frö varje mikro transplantat (erhållen genom samtidig uppdelning av åtta, tre eller fyra likformiga prover av hudvävnad, Ded eller Dermis respektive) och en korrespondent litet fragment av varje vävnadsprov inte totalt uppdelad (> 50 mikron i storlek efter uppdelningsprocessen) på Columbia-agarplatta innehållande 5% fårblod buljong 100 pl.
      7. Inkubera plattan vid 37 ° C under tre dagar och utföra mikrobiologiska analyser på Columbia agarplatta för att bedöma steriliteten 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denna förstudie, det första målet var att undersöka förmågan hos humana autologa mikro transplantat i kombination med ett biologiskt stöd, såsom kollagen, för att producera bio-komplex redo att använda. Dessa bio-komplex implanterades i en patient med ett ben skada som orsakas av en bilolycka (figur 2A) och en fullständig återepitelisation i samband med vävnadsreparation efter 30 dagar (figur 2B) observerades. Dessutom visade klinisk uppföljning en bra konsistens och mjukhet det skadade området efter 5 månader (Figur 2C). Parallellt med klinisk tillämpning, har in vitro-studier också för att utvärdera cellviabiliteten olika kutana vävnader såsom hud vävnad , Ded och dermis före och efter uppdelning av det här systemet. I synnerhet, med hänsyn tagen till olika tjocklek av varje typ av vävnad, tröskeln på åtta,fyra och tre biopsier som kan bearbetas i ett enda steg för hudvävnad, Ded och dermis respektive grundades. Den etablerade antal biopsier ades sedan uppdelad vid fyra olika tidpunkter såsom anges i tabell 1, i enlighet med deras biologiska egenskaper i syfte att identifiera den optimala villkor för disaggregation att upprätthålla en god cellviabilitet.

Även om vävnadsbehandling i sig oundvikligen inducerade en försämring av cellviabilitet jämfört med intakt vävnad, den mekaniska disaggregation utförs med detta system verkar för att bibehålla ett medelvärde på cellviabilitet av 30% i alla prover av hud, Ded och dermis utvärderas vid olika tidpunkter (figur 3a), med avseende på intakt vävnad (Figur 3B) (medelvärde av 92 OD / GR för intakt hudvävnad och 29 OD / g efter uppdelning, från 22 OD / GR till 7 OD / gr for intakt Ded med avseende på uppdelning och slutligen från 16 OD / GR till 2,7 OD / GR för intakta dermis med avseende på uppdelning). Således är dessa preliminära resultat visar att detta system kan bibehålla märk nivåer av cellviabiliteten efter omedelbar uppdelning. Effekten av uppdelning på cellviabilitet undersöktes också på vävnadsprover odlades under 24 h eller 7 dagar och varierande resultat observerades. Framför allt var ingen väsentlig variation av cellviabilitet i huden vävnadsprover observer oberoende av tiden för homogenisering och kultur jämfört med starttid (T 0) (Figur 4A). Å andra sidan, en minskad livsduglighet hos Ded prover efter 24 h av odling i jämförelse med starttiden (T 0) observerades men överraskande cellviabiliteten återställdes efter 7 dagars odling (Figur 4B). Liknande resultat observerades också för prover av Dermis (Figur 4C). Varje prov utvärderades i duplikat och värdena redovisas i tabell 2.

På grundval av dessa resultat, identifierade vi den lämpliga tidpunkten för disaggregation att bibehålla cellviabiliteten för tre typer av kutan vävnad såsom rapporteras i tabell 3. Förutom cellviabilitet, den morfologiska aspekten av odlade cellulär suspension utvärderades också, identifiera enskilda celler efter 24 timmar från vävnads uppdelning, medan efter 7 dagar där rester av fibrer i både hudvävnad och Ded / dermis prover observerades (Figur 5 AB). Dessutom genomfördes en cellkarakterisering genom flödescytometri analys utförd i ett prov av dermis efter dess homogenisering: en heterogen pool av celler som består av flera cellulära typer, inklusive endotelceller och mesenkymala stamceller identifierades (Figur 6). Dessutom var frånvaron av bakterietillväxt identifierats i n alla uppdelade prover lägligt såddes på Agar rätter, bevisar sterilitet försöksförfarandet (Figur 7).

Figur 1
Figur 1. Bio-komplexen Building Tissue störande System (A) och Insamling av en liten bit av Derma från Lesion område av patientens som var Därefter disaggregerade med Vävnads Desarmeringsanordningar. De bio-komplexen erhölls kombinera mikro transplantat på kollagensvampar att erhålla mänskliga fläckar klar att använda för skada reparation (C). (D) Hematoxylin & eosin (H & E) färgning av en representativ bio-komplex odlades under tre dagar i DMEM-medium och observerades mikroskopi klicka här för att se en större version av denna siffra.

innehåll "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 2
Figur 2. Bio-komplex Ansökan om Leg Lesion bio-komplex som består av kollagen och mikro transplantat erhållna från patienten applicerades på benet skada (A) och såret utvärderades efter 30 dagar (B) och 5 månader (C ). klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. C ell livskraft Omedelbart efter Uppdelning på olika tider på tre typer av kutan vävnad (A) med avseende på intakt Kutana vävnader (B). Skin, Ded och dermis vävnader som härrör från fyra olika givare uppdelad med vävnads disruptors som visar i motsvarande avsnitt i texten. Cellviabilitet bestämdes med MTT-test utfördes i duplikat för varje vävnadsprov. Grafen är representativt för fyra olika experiment utförda i duplikat för varje prov. Resultaten uttrycks som ett förhållande mellan optisk densitet (OD) och gram (gr) av vävnad; standardavvikelsen beräknades på förhållandet mellan optisk densitet (OD) och gram (g) av vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. C ell Viability Nivåer av en disaggregerade Exempel på hudvävnad (A), Ded (B) och Dermis (C) till Starta Tid (T 0) och efter subkultur under 24 h och 7 dagar. Vävnaderna homogeniserades med vävnad störande som indicate i motsvarande avsnitt i texten. De disaggregerade prover var därefter odlades under 24 h och 7 dagar efter disaggregation och upprätthölls i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och antibiotika vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2 / luft. Cellviabilitet uppskattades genom MTT såsom beskrivits tidigare. Grafen är representativ för ett experiment utfördes i duplikat för varje prov av hudvävnad, Ded och Dermis härledd från en enda donator. Resultaten uttrycks som förhållandet mellan optisk densitet (OD) och gram (g) av vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Morfologisk analys av disaggregerade hudvävnad (A) och Ded / Dermis (B) efter 24 timmar och 7 dagar av Cult ure. Morfologisk analys utfördes med hjälp av ljusmikroskop efter 24 timmar och 7 dagars odling i närvaro av RPMI medium på hudvävnad och Ded / dermis vävnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Cell Karakterisering av flödescytometrianalys. Efter mekanisk uppdelning, var mikro transplantat som erhålls genom dermis sätta i kultur och efter 7 dagar analyserades med avseende positivitet till mesenkymala och hematopoetisk cellmarkör, inklusive CD146, CD34 och CD45 antigener. Klicka här att se en större version av denna siffra.

les / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg "/>
Figur 7. Mikrobiologisk analys av disaggregerade hudvävnad, Ded och dermis Samples. Små fragment av disaggregerade vävnadsprover ympades på Columbia-agar som tillförs genom 5% fårblod (BioMerieux Company) under huv med laminärt flöde och inkuberades vid 37 ° C under tre dagar för att utföra mikrobiologisk analys och bedömning av sterilitet förfarande. klicka här för att se en större version av denna siffra.

vävnadsprover Disaggregation TIDER (sek / min)
Hud 30 sek
1 min
2 min
5 min
ded 1 min
2 min
5 min
10 min
dermis 1 min
2 min
5 min
10 min

Tabell 1. Schematisk bild av fyra olika tillfällen används för Uppdelning av hud, Ded och dermis. Åtta, fyra och tre stans biopsier av hud, Ded och dermis respektive var uppdelade på fyra olika tillfällen, beroende på deras biologiska egenskaper.

hudvävnad
Till 24 tim 7 dagar
2 ' 5 ' 2 ' 5 ' 2 ' 5 '
37,1 41,07143 41,07143 65,78571 41,14286 37,42857
35,8 43,82143 36,60714 66,5 41,46429 38,67857
ded
T 0 24 tim 7 dagar
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 7,85567
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
dermis
Till 24 tim 7 dagar
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 2,77193 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

Tabell 2. Användningsområde värden uttryckta i OD / GR för en biologisk replikera. Värden för cellviabilitet från hudvävnad, Ded och dermis utvärderas för att starttid och efter mekanisk uppdelning till angivna tiderna. Resultaten är representativa för ett experiment utfördes i duplikat och uttrycktes som förhållandet mellan optisk densitet (OD) och gram (gr) av vävnad.

Prov disaggregering Tid
hudvävnad 5 min
ded 1 min
Derma 2 min

Tabell 3. Schematisk bild av den bästa tiden på Disaggregation att upprätthålla en god cellviabilitet i different vävnadsprover. Hud, Ded och dermis vävnadsprover visar den optimala cellviabiliteten efter 5, 1 och 2 min av disaggregering, respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna förstudie visade att mikro transplantat som erhålls genom detta protokoll kan kombineras med kollagen tvättsvamp, som redan rapporterats i andra kliniska tillämpningar, för att optimera effekten av mikro transplantat implantat 9, 10. I synnerhet, rapporterade studien kapacitet bio -complexes, utgörs av mikro transplantat och kollagensvampar, till adjuvant sårläkningen av ett ben skada efter 30 dagar från klinisk tillämpning. Dessutom in vitro resultat ger bevis om effektiviteten av detta protokoll att dela upp tre olika kutana vävnader, upprätthålla en märkbar cellviabiliteten både omedelbart efter den mekaniska uppdelning och även efter 24 timmar och 7 dagars odling.

Upprätthållandet av cellviabilitet efter denna typ av homogenisering gör det möjligt att erhålla endast ett steg sterila autologa mikro transplantat, undvika omfattande manipulation. Detta bevis är överensmed andra nya papper där effekten av detta protokoll in vitro testades också i andra typer av vävnader, inklusive benhinna, biopsi av hjärt förmak och sido muskeln i ögongloben 5 rectus. I synnerhet, observerade vi i Ded och dermis samplar en ökad cellviabiliteten efter 7 dagars odling, troligtvis på grund av användningen av ett medium som kompletterats med 10% fetalt bovint serum.

Förutom upprätthållande av cellviabilitet, är detta system säker och enkel att använda och i några minuter är i stånd att mekaniskt dela upp olika typer av vävnader som förhindrar störning av cellstrukturer, i förhållande till traditionella metoder för cellisolering, såsom enzymatisk matsmältning som kräver längre tid för utförande. Dessutom är detta system kunna välja celler med en cut-off på 50 mikrometer och denna aspekt är mycket viktigt med tanke på framgången av injicerbara mikro transplantat, eftersom detta område ingårprogenitorceller som kan differentiera i många celltyper och sedan förbättra lesionen reparation. Detta protokoll gör att vi inte bara att få livskraftiga men också autologa mikro transplantat, med tanke på att givaren ämne är också acceptorn av dessa mikro transplantat. Kapaciteten i detta system för att erhålla autologa mikro transplantat var speciellt rapporterades inom tandvården där det har visat sig att transplantation av autologa tandens pulpa stamceller (DPSC) i en icke innehöll infrabony defekt bidragit till periodontal reparation och regenerering av atrofisk maxilla 5,6. Förmågan hos dessa mikro transplantat för att förbättra sårläkningsprocessen har också tidigare rapporterats i förvaltningen av komplexa sår efter kirurgiska ingrepp eller komplikationer 4.

En annan fördel om användningen av autologa och klar att använda mikro-transplantat är säkert hållande av sterila förhållanden med tanke på deras senare implantat på hudskador.

Sammanfattningsvis, det protokoll som beskrivs i detta dokument visade förmåga att skapa mänsklig mikrotransplantatvävnad redo för användning i klinisk intervention för att förbättra läkningen av akuta / kroniska hudsår, såsom de som anges i denna studie. In vitro-resultat om möjligheten till skapa livskraftiga mikro transplantat har också rapporterats och denna parameter är verkligen viktigt att öka andelen framgång i vävnadsreparation. Sammantaget visade data att detta nya system kan betraktas som ett lovande verktyg för kliniker som är i behov av en snabb och säker instrument i förvaltningen av hudsår.

För närvarande finns det inte särskilda ändringar eller begränsningar för protokollet i detta specifika program, med tanke på att huden är en vävnad lätt att använda och i andra studier rapporterade vi effekten av samma protokoll i olika hudskador 6,7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författaren Antonio Graziano är vetenskaplig direktör för Human Brain Wave srl som tillverkar och marknadsför Rigenera systemet. Författaren Letizia Trovato är en medarbetare till vetenskaplig Avdelningen för Human Brain Wave srl

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr Federica Zanzottera för att bidra till studien utför flödescytometrianalys.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
  2. Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
  3. Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
  4. Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18, (2), 59-70 (2001).
  5. Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. (2015).
  6. Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4, (4), 268-274 (2014).
  7. Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1, (3), 3 (2014).
  8. Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34, (3), s27-s33 (2014).
  9. Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1, (2), 20 (2013).
  10. Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17, (5), 644-647 (2013).
  11. Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics