Weefsel karakterisering na een New Uitsplitsing Methode voor de huid Micro-Enten Generation

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Het protocol beschrijft een nieuwe methode om menselijke weefsels te splitsen en micro-autologe transplantaten die in combinatie met collageen sponzen, tot menselijk biologisch complexen klaar voor gebruik in de behandeling van huidletsels te maken. Verder dit systeem bewaart cellevensvatbaarheid van micro-grafts op verschillende tijdstippen na mechanische disaggregatie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Purpura, V., Bondioli, E., Graziano, A., Trovato, L., Melandri, D., Ghetti, M., Marchesini, A., Cusella De Angelis, M. G., Benedetti, L., Ceccarelli, G., Riccio, M. Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation. J. Vis. Exp. (109), e53579, doi:10.3791/53579 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Verschillende nieuwe werkwijzen ontwikkeld op het gebied van biotechnologie autologe cellulaire suspensies tijdens de operatie te verkrijgen, teneinde een stap behandelingen voor acute en chronische huidletsels. Bovendien is de behandeling van chronische maar ook acute wonden gevolg van trauma, diabetes, infecties en andere oorzaken, blijft een uitdaging. In deze studie beschrijven we een nieuwe methode om autologe micro-transplantaten van huidweefsel van een enkele patiënt en hun klinische toepassing. Bovendien werd in vitro biologische karakterisering van cutane weefsel afkomstig van de huid-de epidermized dermis (Ded) en de dermis van meerdere organen en / of multi-weefsel donoren ook uitgevoerd. Alle weefsels werden uitgesplitst naar dit nieuwe protocol, waardoor we levensvatbare micro-implantaten te verkrijgen. In het bijzonder hebben we gemeld dat deze innovatieve protocol kan bio-complexen bestaande uit autologe micro-transplantaten en collageensponzen klaar om te worden aangebracht op de huid laesies. de clinischappelijke toepassing autologe bio-complexen op een been laesie werd gemeld, dat een verbetering van zowel opnieuw epitalization proces en zachtheid van de laesie. Bovendien, onze in vitro model bleek dat de levensvatbaarheid van de cel na mechanische uitsplitsing met dit systeem voor maximaal zeven (7) dagen van de cultuur in stand wordt gehouden in de tijd. We hebben ook opgemerkt door middel van flowcytometrie-analyse, dat de verzameling van cellen verkregen uit uitsplitsing bestaat uit verschillende celtypen, waaronder mesenchymale stamcellen, dat een sleutelrol speelt bij de processen van weefselregeneratie en herstel uitoefenen, voor hun hoge regeneratieve mogelijkheden. Tenslotte hebben we aangetoond dat in vitro procedure handhaaft de steriliteit van micro-implantaten wanneer gekweekt in Agar gerechten. Samengevat concluderen wij dat deze nieuwe regeneratieve benadering veelbelovend hulpmiddel kan zijn voor clinici te verkrijgen in één stap levensvatbare, steriel en klaar voor micro-grafts die alleen of in combinatie kunnen worden toegepast met de meest voorkomende biologische scaffo gebruikenlds.

Introduction

In de afgelopen jaren zijn verscheidene methoden ontwikkeld in de biotechnologie autologe cellulaire suspensies tijdens chirurgie verkrijgen om éénfasige behandelingen voor acute en chronische huidletsels. Bovendien is de behandeling van acute maar vooral chronische wonden gevolg van trauma, diabetes, infecties, en andere oorzaken, blijft een uitdaging. Er is steeds meer bewijs dat chronische wonden een ernstige wereldwijde gezondheidsprobleem geworden, waardoor een enorme financiële last voor de gezondheidszorg systemen wereldwijd 1.

Om de mate van succes bij de behandeling van huidletsels verhogen, gebrek aan uitgebreide manipulatie (inclusief cellulaire versterking) en het handhaven van steriele omstandigheden essentieel, om een ​​celsuspensie die direct kunnen worden aangebracht op het beschadigde gebied van het creëren patiënten, waardoor een langere verwerking in cleanrooms vermijden, zoals Cell Factories. StArting van kleine huidbiopten, slijpen, centrifugeren en andere scheidingsmethoden (bijvoorbeeld enzymatisch of mechanisch), worden vaak gebruikt om een celsuspensie, die kunnen worden gekweekt in een groeimedium verkrijgen. Al deze werkwijzen vereisen in het algemeen een lange tijd van uitvoering, benadrukt de celstructuren, en leidt tot een vermindering van cellevensvatbaarheid. Een ander belangrijk aspect is een autologe cellulaire suspensie gereed voor gebruik door artsen te verkrijgen, bijvoorbeeld om beschadigingen bij. Bovendien is het bekend dat autoloog weefsel enten overleven de procedures overdracht uiteindelijk overleven in de receptorplaats die de beginselen van inductie en geleiding 2, 3. Moet de ideale implantaat weefsel beschikbaar zijn en lage antigeniteit en donorplaats morbiditeit 4.

Op basis van deze bewijzen, was de eerste doelstelling van dit onderzoek om lichaamseigen bio-complexen geschikt voor creërenklinische toepassing in het weefselherstel. Hiervoor beschrijven we een nieuwe werkwijze voor autologe micro-grafts vanaf cutane weefsels die zijn opgesplitst dit protocol verkregen. Een case-presentatie wordt hierin ook beschreven als een klinische toepassing van autologe micro-transplantaten verkregen door dit protocol in combinatie met collageen sponzen. Deze aanpak is reeds gemeld efficiënte mechanische disaggregatie van menselijk weefsel 5 te zijn en het is klinisch gebruikt voor het enten en regeneratie van huidweefsels 6,7 en regeneratieve therapieën bindweefsel in orale kaakchirurgie 8-10 .

Daarnaast is het tweede doel van deze studie was de biologische karakterisering van de cutane weefsels na de opsplitsing van dit protocol. Hiertoe verschillende homologe monsters van huidweefsel afgeleid van de bagageruimte van verschillende meerdere organenen / of multi-weefsel donoren werden verwerkt na de nationale regels inzake de oogst, verwerking en distributie van weefsels voor transplantatie (CNT 2013) in Emilia Romagna Regional Skin Bank.

CASE PRESENTATIE:

Een 35-jarige vrouwelijke patiënt met een complex trauma als gevolg van auto-ongeluk werd toegelaten tot de Intensive Care Unit van Ancona Hospital. De patiënt toonde een besmetting van het been door een open wond en een gecompliceerde breuk gestabiliseerd met externe fixatie. Twee radicale debridement werden uitgevoerd en wanneer de wond werd schoon te maken na de negatieve druk therapie (VAC therapie) en het periost verscheen gezond, we passen het protocol na twee maanden van herstel. Na disaggregatie met dit systeem werden de micro-transplantaten verkregen wordt gebruikt voor bio-complexen met een collageenspons die vervolgens om geïmplanteerd hun doeltreffendheid op de laesie reparatie onderzoeken maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek statement: sinds de klinische toepassing van het protocol het gebruik van cutane autoloog weefsel van de patiënt vereist, de karakterisering in vitro werd uitgevoerd voor klinisch gebruik op homologe huidweefsel in Emilia Romagna Regionale Skin Bank volgens de richtlijnen van de nationale regels inzake de oogst, verwerking en distribueren van weefsels voor transplantatie (CNT 2013).

1. Bio-complex Building for Clinical Application

Opmerking: Dit protocol is klinisch gebaseerd op het gebruik van Rigeneracons (weefsel verbreker) en Rigenera Machine (weefsel verbreker systeem) (figuur 1A). Het weefsel verbreker is een biologisch medische disruptor van menselijke weefsels kunnen kleine stukjes weefsel gebruik van een matrix door hexagonale bladen en filtering cellen en componenten van de extracellulaire matrix met een cut-off van ongeveer 50 micron verstoren.

  1. Verzamel skinsamples van de patiënt door een biopsy punch (Figuur 1B) en splitsen het toevoegen van 1 ml zoutoplossing voor elk stuk op autologe micro-transplantaten 6,7,9 te verkrijgen (of zie stap 2.1).
  2. Plaats 1 ml micro-grafts collageensponzen (figuur 1C) toform bio-complexen gebruikt voor klinische toepassing.
  3. Cultuur nog 1 ml van micro-grafts collageensponzen in aanwezigheid van 6 ml DMEM medium aangevuld met 10% foetaal runderserum bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer.
  4. Na 3 dagen kweken, bevestig de bio-complexen met 0,3% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Giet de paraffine met een specifieke dispenser direct op het monster. Verkrijgen plakjes met een microtoom met een dikte van 5 urn en zet direct in een glazen dia.
  5. Dompel paraffine plakjes 5 urn in een glas voor histologische analyse, die 15 - 20 ml xyleen (in de handel verkrijgbaar - een mengsel van m-xyleen (40-65%), p-xyleen (20%), o-xyleen (20% ) en ethyl benzeen (6-20%) en sporen tolueen, trimethylbenzeen, fenol, thiofeen, pyridine en waterstofsulfide) gedurende 3 min elk.
  6. Dompel de plakjes afnemende graden (100% tot 70%) van ethanol (100% ethanol gedurende 1 uur, 95% ethanol gedurende 1 uur, 80% ethanol gedurende 1 uur, 70% ethanol gedurende 1 uur) en daarna gedeïoniseerd water voor de-paraffinizing en hydrateren de secties.
  7. Vlekken op de secties met 1-2 ml van 1 g / L Ematoxylin voor 1-2 min en vervolgens spoelen met water om eventuele Ematoxylin overschot te verwijderen.
  8. Vlekken op de afdelingen 4-5 min met Eosine Y alcoholische oplossing met 1% concentratie gemengd met ethanol 70% en verdund in water.
  9. Gebruik 1-2 ml Eosine Y voor elke dia sectie en onder stromend water uit de kraan.
  10. Dompelen secties in toenemende graden van ethanol (zie stap 1,6) en tenslotte, na een passage in xyleen gedurende 1 uur, met een dekglaasje gebaseerde montage op middellange en waarnemen onder een lichtmicroscoop bij 100x vergroting (figuur 1D).
  11. </ Ol>

    2. Collection, Uitsplitsing en in vitro analyse van de weefsels

    1. Met een dermatoom, neem onafhankelijk huidweefsel, papillaire dermis-de epidermized (DED) of reticulaire dermis (lederhuid) respectievelijk 0,6 mm, 1 mm of 2 mm in dikte van de bagageruimte van 4 verschillende meerdere organen en / of multi- weefsel donoren in een range 40-55 jaar, naar aanleiding van de nationale regels inzake de oogst, verwerking en distributie van weefsels voor transplantatie (CNT 2013).
      1. Voorzichtig spoelen alle monsters in 0,9% NaCl-oplossing ze in een schotel op een orbitale schudder gedurende 5 min.
      2. Met behulp van de 5-mm biopsie punch, steekproeven die uniform zijn in diameter van het huidweefsel, Ded en Dermis en wegen alle weefselmonsters voor de opsplitsing.
      3. Invoegen acht, drie of vier gelijkmatige monsters van huidweefsel, Ded respectievelijk Dermis in het weefsel verstorende voegen 1,5 ml zoutoplossing voor de disaggregatie.
      4. uitvoeren van verschillendetijden van uitsplitsing voor weefselmonsters zoals aangegeven in tabel 1.
      5. Gebruik een correspondent aantal punch biopten afkomstig uit intacte weefselmonsters als controles.
      6. Na mechanische disaggregatie, zuigen de zoutoplossing die micro-grafts en apart plaats elk monster in een enkel putje van een 12-wells plaat. Voer dezelfde protocol voor intact controle punch biopsieën.
      7. 1 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica aan elk monster toegevoegd.
      8. Evalueer de levensvatbaarheid cel onmiddellijk. Aan elk putje met een micro-graft (respectievelijk verkregen door de gelijktijdige onderverdeling van acht, drie of vier gelijkmatige monsters van huidweefsel, Ded of Dermis) voeg 1 ml medium bevattende 0,5 mg / ml MTT (3- [4,5- dimethylthiazol-2-yl] -2,5- difenyltetrazoliumbromide) oplossing en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 / lucht. Voer dezelfde protocol voor intact controlepunch biopsieën.
      9. Na incubatie, verwijder alle medium dat MTT en toe te voegen aan elk monster 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO) gedurende 10 min.
      10. Transfer elk monster en DMSO in een cuvet en afgelezen bij optische dichtheid (OD) bij 570 nm met een spectrofotometer. Bereken cellevensvatbaarheid als de verhouding van de absorptie bij 570 nm en het gewicht in grammen (g) weefsel gebruikt voor disaggregatie. Voer dezelfde protocol voor intact controle punch biopsieën.
    2. Na mechanische disaggregatie, zuigen de zoutoplossing die micro-graft afgeleid van huidweefsel, Ded en Dermis monsters van een enkele donor.
      1. Plaats elk monster afzonderlijk in een enkel putje van een 12-well plaat of in een kolf voor cellevensvatbaarheid testen en morfologische analyse resp.
      2. Cultuur micro-grafts toevoegen van 1 ml (12-well plaat) of 5 ml (kolf) RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 / air 24 uur en 7 dagen.
      3. Evalueer de levensvatbaarheid van de cellen na 24 uur of 7 dagen (herhaal stappen 2.1.8-2.1.10).
      4. Uitvoeren morfologische analyse evalueren van de aanwezigheid van de celsuspensie met lichtmicroscopie na 24 h en 7 dagen kweken in kolf.
      5. Analyseer de monsters Dermis positiviteit voor de mesenchymale en hematopoietische cel markers, zoals CD146, CD34 en CD45 antigenen door FACS analyse 6.
      6. Onder laminaire stroming kap zaad elk micro-graft (verkregen door de gelijktijdige onderverdeling van acht, drie of vier gelijkmatige monsters van huidweefsel, respectievelijk Ded of dermis) en een correspondent kleine fragment van elk weefselmonster niet volledig uitgesplitste (> 50 micron na het uiteenvallen proces) op Columbia agar plaat die 5% schapen bloed bouillon 100 pl.
      7. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende drie dagen en microbiologische analyses uitgevoerd op Columbia agar plaat om de steriliteit te beoordelen 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In dit vooronderzoek als eerste doel het vermogen van menselijke autologe micro-transplantaten in combinatie met een biologische drager, zoals collageen, bio-complexen gebruiksklaar produceren onderzoeken. Deze bio-complexen werden geïmplanteerd in een patiënt met een been letsel veroorzaakt door een auto-ongeluk (figuur 2A) en een volledige re-epithelialisatie geassocieerd met weefselherstel na 30 dagen (Figuur 2B) waargenomen. Bovendien, de klinische follow-up vertoonden een goede structuur en zachtheid van het beschadigde gebied na 5 maanden (Figuur 2C). Gelijktijdig met klinische toepassing, werden in vitro studies ook uitgevoerd om de cellevensvatbaarheid van verschillende cutane weefsels evalueren zoals huidweefsel , Ded en Dermis voor en na de opsplitsing van dit systeem. Met name gezien de verschillende dikte van elk type weefsel, de drempelwaarde van acht,vier en drie biopten dat in één stap voor huidweefsel, dermis en DED kunnen worden verwerkt, respectievelijk opgericht. Het vastgestelde aantal biopsieën werden vervolgens opgesplitst in vier verschillende tijdstippen zoals aangegeven in tabel 1, op basis van hun biologische kenmerken om de optimale conditie van disaggregatie identificeren een goede cellevensvatbaarheid behouden.

Hoewel het weefsel verwerking zelf onvermijdelijk verminderde cellevensvatbaarheid in vergelijking met intact weefsel veroorzaakt, mechanische disaggregatie uitgevoerd met dit systeem lijkt een gemiddelde waarde van cellevensvatbaarheid van 30% behouden in alle monsters van huid, Ded en dermis geëvalueerd op verschillende tijdstippen (figuur 3A), ten opzichte van intacte weefsel (Figuur 3B) (gemiddelde van 92 OD / pro intact huidweefsel en 29 OD / g na opsplitsing, van 22 OD / g tot 7 OD / gr for intact Ded met betrekking tot de opsplitsing en uiteindelijk vanaf 16 OD / gr tot 2,7 OD / gr voor intact dermis met betrekking tot de opsplitsing). Dus, deze voorlopige resultaten tonen aan dat dit systeem kan aanzienlijke niveaus van cellevensvatbaarheid na directe disaggregatie handhaven. Het effect van disaggregatie op cellevensvatbaarheid werd onderzocht op weefselmonsters gekweekt gedurende 24 uur en 7 dagen en variabele resultaten werden waargenomen. In het bijzonder werd geen wezenlijke verandering van de levensvatbaarheid van de cellen in de huid weefselmonsters onafhankelijk waargenomen door de tijd van homogenisering en cultuur in vergelijking met starttijd (T 0) (Figuur 4A). Anderzijds, een verminderde levensvatbaarheid van Ded monsters na 24 h kweken in vergelijking met starttijd (T 0) waargenomen maar verrassend de cellevensvatbaarheid werd hersteld na 7 dagen kweken (figuur 4B). Soortgelijke resultaten werden ook waargenomen voor monsters Dermis (figuur 4C). Elk monster werd in duplo en waarden vermeld in tabel 2.

Op basis van deze resultaten gaf aan welke geschikte tijd van disaggregatie levensvatbaarheid van de cellen in drie soorten huidweefsel handhaven volgens tabel 3. Naast cellevensvatbaarheid werd de morfologie van gekweekte celsuspensie geëvalueerd, enkele cellen identificeren na 24 uur uit weefsel disaggregatie, terwijl na 7 dagen zijn er resten van vezels in zowel huidweefsel en Ded / Dermis monsters werden waargenomen (Figuur 5 AB). Verder een cel karakterisering van stromingscytometrie analyse werd uitgevoerd op een monster van dermis na homogenisering: een heterogene verzameling van cellen bestaat uit verschillende celtypes, met inbegrip van endotheliale cellen en mesenchymale stamcellen werd geïdentificeerd (Figuur 6). Bovendien is de afwezigheid van bacteriegroei vastgesteld i n alle opgesplitste monsters opportunely gezaaid op Agar gerechten, waaruit de steriliteit van experimentele procedure (Figuur 7).

Figuur 1
Figuur 1. Bio-complexen Building Tissue Disrupting System (A) en verzamelen van een klein stukje van Derma van de laesie in de omgeving van de patiënt die vervolgens Gedesaggregeerde met Tissue Disruptors. De bio-complexen werden verkregen combineren van de micro-implantaten op collageen sponzen was voor het verkrijgen van menselijke pleisters klaar om te gebruiken voor laesie reparatie (C). (D) hematoxyline & eosine (H & E) kleuring van een representatieve bio-complex gekweekt voor drie dagen in DMEM medium en waargenomen microscopie klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.

content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figuur 2
Figuur 2. Bio-complexen toepassing op Leg laesie De bio-complexen bestaande uit collageen en micro-enten van de patiënt verkregen werd aangebracht op het been laesie (A) en de wond werd geëvalueerd na 30 dagen (B) en 5 maanden (C ). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. C ell levensvatbaarheid Onmiddellijk na Uitsplitsing op verschillende tijdstippen van drie Type Cutane Tissues (A) ten opzichte van Intact Cutane Tissues (B). De huid, Ded en Dermis weefsels afgeleid van vier verschillende donoren werden opgesplitst met weefsel disruptors zoals aangeven in het desbetreffende gedeelte van de tekst. Levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door MTT-test in duplo uitgevoerd met elk weefselmonster. De grafiek is representatief voor vier experimenten in duplo uitgevoerd met elk monster. De resultaten worden uitgedrukt als een verhouding tussen de optische dichtheid (OD) en g (gram) weefsel; de standaarddeviatie werd berekend op basis van de verhouding tussen de optische dichtheid (OD) en gram (gr) van weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. C ell levensvatbaarheid Niveaus van een Gedesaggregeerde Voorbeeld van huidweefsel (A), Ded (B) en de dermis (C) voor het starten van de tijd (t 0) en na Subculture gedurende 24 uur en 7 dagen. De weefsels werden gehomogeniseerd met weefsel verstoorders als indicate in de juiste rubriek in de tekst. De opgesplitste monsters werden vervolgens gekweekt gedurende 24 uur en 7 dagen na de disaggregatie en onderhouden in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en antibiotica bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 / lucht. Levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door MTT zoals eerder beschreven. De grafiek is representatief voor een experiment in duplo uitgevoerd met elk monster van huidweefsel, dermis en DED afkomstig van één donor. De resultaten worden uitgedrukt als verhouding tussen de optische dichtheid (OD) en gram (gr) van weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. morfologische analyse van Gedesaggregeerde huidweefsel (A) en Ded / Dermis (B) na 24 uur en 7 dagen van Cult ure. Morfologische analyse werd uitgevoerd met behulp van licht microscopie na 24 uur en 7 dagen van de cultuur in de aanwezigheid van RPMI medium op de huid weefsel en Ded / dermis weefsels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6. Cell Karakterisering door flowcytometrie Analysis. Na mechanische opsplitsing, micro-transplantaten verkregen door dermis werden in cultuur gebracht en na 7 dagen werden geanalyseerd op positiviteit naar mesenchymale en hematopoietische cellen marker, met inbegrip van CD146, CD34 en CD45-antigenen. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

les / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg "/>
Figuur 7. Microbiologische analyse van uitgesplitste huidweefsel, dermis en DED monsters. Kleine fragmenten uitgesplitste weefselmonsters werden gezaaid op Columbia agar toegevoegd van 5% schapenbloed (BioMerieux Company) onder laminaire stroming kap en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende drie dagen voert de microbiologische analyse en beoordeling van de steriliteit van de procedure. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

weefselmonsters Disaggregatie TIMES (sec / min)
Huid 30 sec
1 minuut
2 min
5 minuten
Ded 1 minuut
2 min
5 minuten
10 min
huid 1 minuut
2 min
5 minuten
10 min

Tabel 1. Schematische weergave van de vier verschillende tijdstippen gebruikt disaggregatie van huid, Ded en dermis. Acht, vier en drie punch biopsieën van huid, Ded en Dermis respectievelijk uitgesplitst op vier verschillende tijdstippen, afhankelijk van hun biologische kenmerken.

huidweefsel
naar 24 hr 7 dagen
2 ' 5 ' 2 ' 5 ' 2 ' 5 '
37.1 41,07143 41,07143 65,78571 41,14286 37,42857
35.8 43,82143 36,60714 66.5 41,46429 38,67857
Ded
T 0 24 hr 7 dagen
5 ' 10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
6,649485 8.237113 5.463918 5.731959 7.835052 7,85567
6,845361 8,360825 5.257732 5.989691 8 7.938144
huid
naar 24 hr 7 dagen
10 ' 5 ' 10 ' 5 ' 10 '
1.690909 2,77193 0.293898 0.786704 2.880952 2.869048
1.736364 2.830409 0.306351 0.814404 2.940476 2.928571

Tabel 2. Bereik van uitgedrukt in OD / gr voor één biologische repliceren. De waarden van de levensvatbaarheid van de cellen uit huidweefsel, Ded en dermis geëvalueerd om starttijd en na mechanische uitsplitsing naar opgegeven tijden. De resultaten zijn representatief voor een experiment in duplo uitgevoerd en uitgedrukt als verhouding tussen de optische dichtheid (OD) en g (gram) weefsel.

specimen disaggregatie Time
huidweefsel 5 minuten
Ded 1 minuut
Derma 2 min

Tabel 3. Schematische weergave van de beste tijd van uitsplitsing naar een goede levensvatbaarheid van de cellen in Differe Maintainnt Tissue monsters. Huid, Ded en weefselmonsters Dermis tonen de optimale levensvatbaarheid van de cellen na 5, 1 en 2 min van uitsplitsing, respectievelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze preliminaire studie toonde aan dat micro-transplantaten verkregen door dit protocol kan worden gecombineerd met collageen sponzen, zoals reeds gemeld in andere klinische toepassingen, om de werkzaamheid van micro-grafts implantaten 9, 10 optimaliseren. Vooral dit onderzoek meldde de capaciteit van bio -complexen, gevormd door micro-implantaten en collageensponzen, de wondgenezing van een been letsel adjuvans na 30 dagen klinische toepassing. Verder in vitro resultaten tonen de effectiviteit van dit protocol drie verschillende cutane weefsels splitsen, behoud merkbaar cellevensvatbaarheid zowel direct na de mechanische disaggregatie en ook na 24 h en 7 dagen kweken.

De handhaving van cellevensvatbaarheid na dergelijke homogenisering maakt om slechts in één stap steriel autologe micro-transplantaten, zodat lange manipulatie. Dit bewijs is in overeenstemmingmet andere recente artikelen waarin de werkzaamheid van dit protocol in vitro werd ook getest in andere soorten weefsels, zoals periosteum, biopsie van cardiale atria en laterale rectus spier van 5 oogbol. In het bijzonder hebben we waargenomen in DED en dermis monsters een verhoogde levensvatbaarheid van de cellen na 7 dagen kweken, waarschijnlijk als gevolg van het gebruik van een medium aangevuld met 10% foetaal runderserum.

Naast het handhaven van cellevensvatbaarheid, dit systeem veilig en gemakkelijk te gebruiken en in enkele minuten kan mechanisch splitsen verschillende weefsels voorkomen van verstoring van de celstructuren met betrekking tot traditionele methoden van celisolatie, zoals enzymatische verbranding die langere uitvoering vergen. Bovendien is dit systeem kan cellen met een cut-off van 50 micron selecteren en dit aspect is zeer belangrijk gezien het succes van injecteerbare micro-transplantaten, omdat omvatvoorlopercellen kunnen differentiëren in vele celtypen en verbeteren de laesie reparatie. Dit protocol stelt ons niet alleen levensvatbare maar ook micro-autologe transplantaten te verkrijgen, aangezien de donor onderwerp is ook de acceptor van deze micro-grafts. De capaciteit van dit systeem autologe micro-transplantaten verkrijgen is speciaal gemeld in de tandheelkunde waarbij is aangetoond dat autologe transplantatie van dentale pulp stamcellen (DPSC's) in een niet-opgenomen infrabony defect bijgedragen tot parodontale herstel en regeneratie van atrofische maxilla 5,6. Het vermogen van deze micro-grafts om de wondgenezing te verbeteren werd eerder gemeld bij de behandeling van complexe wonden na chirurgische ingrepen of complicaties 4.

Een ander voordeel van het gebruik van autoloog en direct micro-grafts gebruikt is zeker het houden van steriele omstandigheden met het oog op de latere implantaat op de huid laesies.

Samenvattend, de in dit document beschreven protocol bleek het vermogen om menselijke micro-graft weefsel klaar voor gebruik in klinische interventie genezing van acute / chronische huidwonden, zoals de in deze studie verbeteren creëren. In vitro resultaten over de mogelijkheid om creëren van levensvatbare micro-transplantaten zijn ook gerapporteerd en deze parameter zeker significant het percentage van succes in het weefselherstel verhogen. Bij elkaar genomen, de gegevens bleek dat dit nieuwe systeem kan worden beschouwd als een veelbelovend instrument voor clinici die behoefte hebben aan een snelle en veilige instrument in het beheer van huidwonden.

Momenteel zijn er geen bijzondere aanpassingen of beperkingen voor het protocol in deze specifieke toepassing, aangezien de huid vertegenwoordigt een weefsel gemakkelijk te gebruiken en in andere studies we melding gemaakt van het effect van hetzelfde protocol op verschillende huidlaesies 6,7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteur Antonio Graziano is de wetenschappelijk directeur van Human Brain Wave srl, dat produceert en verkoopt het Rigenera systeem. De auteur Letizia Trovato is een medewerker van wetenschappelijke afdeling Human Brain Wave srl

Acknowledgments

De auteurs willen bedanken Dr. Federica Zanzottera om bij te dragen aan de studie uitvoeren van flowcytometrie-analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rigenera Machine Human Brain Wave 79210R
Rigeneracons Human Brain Wave 79450S
MTT Roche Diagnostic GmbH 11465007001
RPMI medium PBI International 733-2292
DMEM medium PBI International F 0415
Antibiotics Biological Industries PBI 03-038-1    
Antibodies for FACS Analysis eBiosciences code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349  for CD34-APC 
Columbia agar BioMerieux Company 43041
Condress® Abiogen Pharma collagen sponge used for bio-complexes
DMSO  Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
NaCl solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany
Xylene  Carlo Erba

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).
  2. Ellis, E. III, Sinn, D. Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).
  3. Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques. Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).
  4. Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma. AJCS. 18, (2), 59-70 (2001).
  5. Trovato, L., et al. A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues. J Cell Physiol. (2015).
  6. Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome. JCDSA. 4, (4), 268-274 (2014).
  7. Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds. J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1, (3), 3 (2014).
  8. Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report. Int J Periodontics Restorative Dent. 34, (3), s27-s33 (2014).
  9. Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up. AOMS. 1, (2), 20 (2013).
  10. Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation. J Indian Soc Periodontol. 17, (5), 644-647 (2013).
  11. Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. A new culture medium for medical bacteriology. Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics