כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nishimura, C., Polesskaya, O., Dewhurst, S., Silva, J. N. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (107), e53582, doi:10.3791/53582 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

וירוס כשל חיסוני אנושי 1 (HIV-1) פולש למוח בשלב האקוטי של זיהום בנגיף, ופרודוקטיבית מדביק שני מיקרוגלים ומקרופאגים תושב המוח, שמוביל להפעלתם - ואת שחרורם של שני מתווכים דלקתיים המופק מהמארח וHIV-1 המסיס virotoxins כגון טאט וgp120 (שנסקר ב1,2). כתוצאה מכך, מדינת neuroinflammatory כרונית הופכת הוקמה במערכת העצבים המרכזית, שחשב לתרום לפתוגנזה של HIV-1 הפרעות Associated נוירוקוגניטיבי (יד) 3-5.

ביטוי יתר כרוני של HIV-1 תאת או אינטרלוקין -17A (IL) בתוך מערכת העצבים המרכזית של עכברים הוכח לגרום לואקום כלי דם 6,7. זה מעלה את האפשרות שneuroinflammation הכרוני עשוי לתרום לפתוגנזה של יד בהשפעות על מערכת כלי הדם במוח. כדי לבחון שאלה זו נוספת, פיתחנו שיטות לכמת struc כלי דם המוחיטורס.

מאמר זה מתאר שיטה לכימות מספר צמתים נימים, מגזרי נימים, אומר אורך קטע, סך אורך קטע, אומר קוטר נימים, ונימים כוללת באמצעות in vivo ההדמיה של רשתות נימים דרך חלון קליפת המוח דק גולגולת נפח (שונה ממתואר בעבר פרוטוקולים) 8,9, כמו גם הדמיה vivo לשעבר של חלקים במוח, באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. גישה משולבת זו מספקת לכימות הוליסטית של פרמטרים כלי דם מוחי, מאז חלון קליפת המוח דק-גולגולת in vivo מאפשר לשימור הסביבה במוח, בעוד ההדמיה vivo לשעבר של רשתות נימים בפרוסות מוח מאפשרת שחזור מלא, תלת ממדים רשתות נימים - אשר לאחר מכן ניתן לכמת באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אוניברסיטת ועדת האוניברסיטה של ​​רוצ'סטר בבעלי חי משאבים אישרה את כל הפרוצדורות שבוצעו בנייר זה.

1. הכנה טרום-ניתוחית (ועכברים)

  1. הכן את אזור הניתוח עם כל הציוד הנדרש. לעקר את כל הכלים המשמשים במהלך ההליך מראש באמצעות אתנול 70%. לחלופין, להשתמש מעקר חרוזי זכוכית או החיטוי לעקר את הכלים.
  2. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה isoflurane מחובר למכשיר אדי isoflurane. הגדר את רמות isoflurane עד 4% בשיעור של 1 ליטר / דקה.
    הערה: לניסויים שדווחו כאן, עכברים עם דוקסיציקלין transgene HIV-1 תאת מושרה (DOX) מונע על ידי חלבון גליה fibrillary astrocyte ספציפי אמרגן (עכברי HIV טאט-TG) (GFAP) 10 שמשו כדי לבחון את ההשפעה של איידס -1 מושרה neuroinflammation במבנה כלי דם מוחי, כפי שתואר בעבר 7,10.
  3. בעדינות להטות את תא האינדוקציה להתבונן העכבר ורפלקס ליישר של; # 39. ברגע שרפלקס ליישר דוכא, להגדיר את רמת isoflurane עד 2% ולהפנות את זרימת האוויר מתא האינדוקציה לחרטום בספסל כירורגית.
  4. במהירות להזיז את העכבר מתא האינדוקציה לכרית חימום המים רווי. תמשיך לחול isoflurane (1.5-2%) באמצעות חרטומו. התאם הרדמה פי סובלנות עכבר בודדת הוערכה באמצעות ניטור קצב נשימה (RR).
    הערה: הדיכאון של RR יכול להפריע פרמטרים גז פיסיולוגיים שינוי זרימת דם במוח והערכת קוטר כלי. תנסה לשמור RR בין 55-65 נשימות לדקה. גם קצב לב (HR) יכול לשמש להעריך עומק ההרדמה; לשמור על משאבי אנוש בין 300-450 פעימות לדקה כדי למנוע שינויים פיסיולוגיים לקוטר כלי. בדרך כלל, הרדמה תהיה נאותה בין isoflurane 1.5-2.0% בL 1 / דקה לעכבר נתון.
  5. בצע קמצוץ הבוהן כדי לבדוק את עומק הרדמה נוסף. אם העכבר לא מגיב, commence הניתוחים.

2. הכנת דקה גולגולת גולגולת החלון

  1. החל ג'ל דמעה מלאכותי לעיניים של העכבר. להסיר לחלוטין את השיער מהקרקפת של העכבר באמצעות מספריים או סכין גילוח חשמלי.
  2. לעקר את הקרקפת על ידי יישום פתרון povidone- יוד; לאפשר לו להתייבש. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ אור, להסיר את העור מהקרקפת של העכבר, וחושף את העצמות הקודקודית, עצמות חזיתיות הזנב, וגבחת סימון לחלוטין.
  3. החל כמות קטנה של 10% פתרון כלוריד Ferric לגולגולת כדי לייבש את הקרום להסרת קלה. הסר את הקרומים המיובשים עם # 5/45 מלקחיים בעדינות על ידי גירוד הגולגולת.
  4. למרוח שכבה דקה של דבק סביב חלון headplate. לחץ בעדינות על headplate נגד הגולגולת של העכבר, שמירה על השטח של עניין במרכז החלון. החל ירידה של מלט שיניים לheadplate לפלמר הדבק.
  5. למרוח שכבה דקהשל דבק לאורך הקצה של חלון headplate ליצור מאגר שבלהחזיק מלוח. לאחר הדבק התייבש, בורג headplate לרתם headplate העכבר.
    הערה: רתמת headplate העכבר המשמש בהליך זה הוא מבנה עם בסיס מתכת ושתי עמודות מתכת. בכל עמודה יש ​​אביב אחד ואגוז כנף אחת. Headplate ממוקם בחלק העליון של האביב, ואגוז האגף מתהדק עד הראש הוא רמה ולא זז.
  6. הסר את כל דבק מחלון headplate באמצעות מקדח מצורף לתרגיל Microtorque נקבע על 6,000 סל"ד. עצור כל שניות 10-15 כדי למנוע התחממות יתר של גולגולת עכבר שיכול לגרום לניזק מבני לכלי.
    1. באמצעות מקדח חדש, למקם מ"מ תרגיל 1.5 Microtorque רוחבית מקו האמצע (שליש מהקוטר של חלון headplate). מתחיל דק הגולגולת סביב מיקום זה ב 4000 סל"ד. הזז את התרגיל בעדינות על פני הגולגולת ללא לחץ כלפי מטה ישיר.
    2. dril הפסקתלינג כל שניות 10-15 כדי למנוע התחממות יתר גולגולת העכבר. במהלך תקופה זו, להסיר את האבק שהצטבר בגולגולת באמצעות מיכל אוויר דחוס.
    3. השתמש טיפות של תמיסת מלח RT להתקרר גולגולת למשך 5-10 שניות. בעדינות להסיר את כל הנוזל עם רקמות רכות להמשיך דליל גולגולת.
  7. לדילול הסופי של הגולגולת, למקם את נפח קטן של מלח במאגר headplate וקל לטאטא microblade שיניים על פני השטח של ריבית עד כלי דם קטנים נראים בבירור.

3. ניטור פרמטרים פיסיולוגיים

  1. ברגע שהגולגולת היא דלילה לחלוטין, לנתק את העכבר מהבעל ולמקם אותו על הגב שלה. בעדינות קלטת את שני רגליו האחוריות כדי לחשוף את הירכיים המדיאלי ברור.
  2. להסיר את השיער על שני ירכיים המדיאלי עם מספריים או מכונת גילוח חשמלי. לחטא את האתר כירורגית על ידי כיסוי הירכיים עם povidone- יוד.
  3. לצבוט את העור על ירך ימין המדיאלי מעל וריד הירךועורק באמצעות # 5 מלקחיים. משוך בעדינות את העור כלפי מעלה ולהשתמש במספריים לחתוך ולהסיר את העור.
    הערה: ירך השמאל שמור במקרה של סיבוכים ניתוחיים (מומים לב וכלי דם, כלי קרע).
  4. החל כ 3-5 טיפות של תמיסת מלח 0.9% לאתר כירורגית. זה מאפשר להגדלה גדולה יותר של כלים, כמו גם שמירה על אתר לחות ומניעת ייבוש של הכלים. הפרד את וריד הירך מעורק על ידי בוטות לנתח לתוך צרור עצבים וכלי דם הירך באמצעות שני # 5/45 מלקחיים.
  5. מניחים שתי, 3 חתיכות סנטימטר של תפר כירורגים מתחת לעורק הירך בנפרד כ 1 סנטימטר. לסובב את כיוון השעון תפר העליון כדי ליצור חוסם עורק וכלי דם שיעזור למנוע איבוד דם מוגזם במהלך צנתור.
  6. לעשות חתך קטן בעורק הירך באמצעות המספריים האביב. מניחים את הצנתר בעורק דרך החתך ומראש עד הצנתר הוא מאובטח בתוך העורק.
  7. הזרק 10 μl של הפרין (100 IU / ml) באמצעות קטטר כדי למנוע קרישת דם. לאחר מכן, בניתוח לסגור את ירך ימין על ידי תפירת העור יחד עם תפר 4-0 בתבנית קטע פשוט.
  8. הזרק 50 μl של urethane (1.2 מ"ג / g) intraperitoneally לרבע הימני תחתון. חמש דקות לאחר מכן לחזור עם עוד זריקת 50 μl לרבע השמאלי התחתון עבור הסכום כולל של של urethane intraperitoneal 100 μl. לאט לאט להפחית את רמות isoflurane לכ 0.25% ואילו rechecking במקביל עכבר לעומק ההרדמה.
    הערה: שמור את המחט שטחית בחלל הצפק לאורך קיר הבטן האחורי, כך שזה לא לנקב את המעי. זה יכול להיות מושלם על ידי צובט את mu rectus הבטןscles מהקרביים ולאחר מכן הזרקה.
  9. באמצעות צינור נימים, לאסוף דגימת 40 μl של דם עורקים מקטטר. צרף את הצנתר למצויד בשסתום ארבע-דרך מלוחה מלאות ומזרק מלא הפרין מתמר לחץ דם.
  10. הדבק את מתמר לחץ דם למנגנון כירורגית כדי למנוע ההסרה מכוונת של קטטר. בגין ניטור של לחץ דם ממוצע.
  11. הכנס את צינור נימי דם מלא ליציאת כניסת מנתח גז דם. ברגע שכל הדם כבר חולץ, להסיר את צינור נימים מנמל הכניסה. רמות גז 2 דם O 2 ו- CO יופיעו על נייר המודפס ממנתח גז דם.

4. הזרקה של הצבע פלואורסצנטי

  1. לצבוט את העור על ירך השמאל המדיאלי באמצעות # 5 מלקחיים. משוך בעדינות את העור כלפי מעלה ולהשתמש במספריים לחתוך ולהסיר את העור. הכן צבע dextran מצומדות אדום פולט rhodamine(70 KDA) (10 מ"ג / קילוגרם המומס בתמיסת מלח).
  2. אתר את הירך vein.Using מזרק 1 מיליליטר עם מחט G 30 המצורפות, לצייר פתרון הכין בעבר של צבע ניאון מתאים להדמיה לקו 130 μl של המזרק. הסר את כל בועות האוויר על ידי ציור את הצבע לחלוטין לתוך המזרק ותקיפות מצליפים את קיר המזרק.
    1. כופף את מחט G 30 בכ 30 מעלות זווית על ידי לחיצה עליו מפני צד פוע את משטח קשה. מלא את המחט עם הצבע וזורקים את נוזלי עודפים, עוזב מדגם 100 μl.
  3. להזריק מדגם 100 μl של צבע לאט לתוך וריד הירך. לאחר הסרת המחט, להפעיל לחץ קבוע, בעדינות לאתר של הזרקה לעצור כל דימום. לאפשר לצבוע לזרום במשך 5 דקות.
    הערה: לחלופין, וריד הירך ימין ניתן להשתמש במקום להזרקת צבע הניאון כדי למנוע אובדן דם נוסף באמצעות יצירת אחרת באתר ניתוח. בנוסף, אםבעלי החיים הוא דימום בלתי נשלט מהאתר כירורגית, זה עשוי להיות סימן לכך שיותר מדי הפרין ניתן לרוקן את הקטטר. אם אין קרישה בתוך 10-15 דקות והעכבר עדיין מדמם, לשקול מחדש את הניסוי עם עכבר חדש.
  4. סגור את ירך שמאל על ידי תפירת העור יחד עם תפר 4-0, אז להעיף בזהירות את העכבר על הבטן שלה, ולמקם אותו לתוך רתמת headplate העכבר.

5. בVivo שני פוטוני ההדמיה

  1. הזז את המנגנון כירורגית למיקרוסקופ שני הפוטונים, והקפד לשמור על רמות הרדמה רציפות. מניחים כמות קטנה של תמיסת מלח 0.9% למאגר headplate ולהפחית את מטרת מיקרוסקופ, כך שהוא בא במגע עם מי מלח. אתר את האזור של עניין באמצעות אובייקטיבי צפייה-brightfield
  2. הגדר את עירור לייזר שני פוטונים לאורכי גל מתאימים לצבע הניאון. בגין שני פוטונים הדמיה באמצעות o 25xbjective.
    שים לב כי בניסויים אלה השתמשנו dextran מצומדת לצבע rhodamine פולטות אדום שהיה נרגש באורך גל של 780 ננומטר. 607/36 bandpass מסנן פליטה כדי לזהות את הקרינה מהצבע, וbandpass 480/20 מסנן פליטה היה משמש לאיתור autofluorescence עורקים
  3. אתר נימים למיטה על מסך התצוגה, ולהגדיל אזור זה באמצעות זום 2. תמונות רוכשים אופטיות של הנימים באמצעות תוכנת ההדמיה שני פוטונים.
  4. לאחר ההדמיה תושלם, להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ואחריו עריפת ראש.

הדמיה 6. Ex Vivo שני פוטונים

  1. שימוש במספריים עדינים נוספים, עושה חתך בקרקפת מהעצמות interparietal לעצמות הקדמיות של העכבר. אבטח את העור לצדדים של הגולגולת עם האצבע ואגודל המצביע.
  2. מניחים את המספריים עדינים נוספים מתחת לעצם interparietal המדיאלי ולחתוך את הגולגולת לאורך תפר sagittal. עצור חיתוך הגולגולת כ 3 מ"מ לאחר גבחת סימון.
    הערה: החל לחץ כלפי מעלה בעת חיתוך הגולגולת כדי למנוע חיתוך המוח.
  3. באמצעות 5 המלקחיים #, להפריד את הגולגולת מהמוח ובזהירות להסיר כל קרומי המוח מפני שטח של המוח. קרומי המוח שנותר בטעות יכול לקרוע את המוח; יש לנקוט זהירות רבה כדי למנוע את זה. חלק בעדינות # 5 מלקחיים תחת מוח קידום קדימה באיטיות עד המוח הוא חופשי מגולגולת.
    הערה: שלחץ כלפי מטה צריך להיות בשימוש כדי למנוע ניקוב המוח.
  4. מניחים את המוח בכלי מוח חתך ספציפי לעכברים. שטוף את המוח על ידי יישום טיפות של נוזל השדרתי מלאכותי על המוח.
  5. הסר סעיף העטרה 2 מ"מ של המוח מגבחת 0 עד גבחת -2. מניחים את סעיף העטרה על גבי זכוכית קעורה המכילה נוזל השדרתי מלאכותי עם גבחת 0 (רוב הגולגולת של הסעיף) פונה כלפי מעלה. בעדינות לכסות את sl המוחקרח עם להחליק את מכסה זכוכית.
    הערה: הימנע לחיצה על הזכוכית להציב פעם אחת על סעיף המוח כמו זה עלול לעוות את ארכיטקטורת כלי הדם.
  6. העבר את השקופית לבמה מיקרוסקופ ומניח כמות קטנה של תמיסת מלח 0.9% על להחליק את המכסה. מנמיכים את המטרה מיקרוסקופ עד שבא במגע עם מי מלח. אתר את קו האמצע של המוח באמצעות אובייקטיבי brightfield.
  7. תתחיל הדמיה שני פוטונים ולאתר את קו האמצע שוב באמצעות אובייקטיבי 25x. להשיג את זה על ידי מחפש סדק אורכי על פני השטח של קליפת המוח של סעיף העטרה. הנח את הקצה הימני של מסך ההדמיה על קו האמצע ולהעביר את המסך הצופה פני רוחבי שלוש מסגרות שלמות (כ -1.5 מ"מ מקו האמצע).
    שים לב כי בניסויים אלה, הפרמטרים ההדמיה היו זהים לאלה שהוזכרו בהערה בשלב 5.2.
  8. אתר את העומק שבו נימים הן בקושי נראים על מסך התצוגה. מנמיכים את המטוס של מוקד 20 נוספיםמיקרומטר כדי לקבוע את החלק העליון של Z- המחסנית.
  9. הגדר את עובי התמונה ל1 מיקרומטר. מנמיכים את מסך התצוגה של 100 מיקרומטר ולהתאים כוח הלייזר לאורך כך שפחות מ -1% של הפיקסלים הם oversaturated.
    הערה: Z- מחסנית התמונות מופקים מסדרה של תמונות מיקרומטר 100 500x500x1 רצוף. Z- מחסנית החישובים שלאחר העיבוד מדויקים יותר יהיו גדול יותר. בדרך כלל, מנסה לאסוף Z- מחסנית של 100 מיקרומטר או גדולים יותר.
  10. לחץ על הסמל חזור על XY ואחריו סמל XY הסמוך. ברגע שZ- המחסנית שלמה, לחץ על סמל סדרת Done ולשמור את הקובץ.

7. עיבוד נתונים

  1. פתח בvivo תמונת נימים בתוכנת ImageJ. הגדרה ידנית של פיקסל ליחס מרחק מבוסס על ערכים שהתקבלו מהתוכנה שני פוטונים.
    1. בחר את הסמל * ישר * מתפריט הכלים. צייר קו המשתרע מקיר נימים אחד לOPPOקיר נימי אתר, ולהקליט את האורך הניתן על ידי ImageJ.
      שים לב שזה עשוי להיות נחוץ כדי להגדיל את התמונה כדי להמחיש את הקצוות של קירות הנימים ברורות.
    2. חזור על שלב 7.1.1 במקומות שונים לאורך הנימים, כמו גם לנימים מרובות בתמונה.
  2. פתח את קובץ Z- המחסנית לתוך התוכנה אנליטיים כגון עמירה. בחר את סמל נימת העורך מסרגל הכלים תת-היישום
    1. הגדר את עובי הצופה כ 20. העבירו את הצופה לחלק העליון או התחתון של Z- המחסנית.
    2. בחר את סמל Trace ולהזיז את הסמן מעל התמונה הטעונה. בלוטות מקום על הנימים במקומות מתוארים באיור 2 ג; מגזרים יופיעו באופן אוטומטי בין צמתים סמוכים. עקוב אחר נימים לאורך Z- המחסנית שלמה.
      הערה: יהיה צורך להציב צמתים בין נקודות קצה ונקודות סניף כדי לאתר את נימי throughout Z- המחסנית.
    3. כדי להסיר צמתים אלה, לחץ על סמל הסרת ביניים.
      הערה: זה יכול ליצור מגזרים שגויים לולאה שיש להסיר באופן ידני על ידי בחירת הלולאה באמצעות הסמל יחיד בחר, ולאחר מכן בחירה בסמל 'הסר נבחרת. אם לולאות ממשיכות להופיע באותו האזור במהלך מעקב, סביר להניח כי בלוטות הונחו על נימים שונות.
    4. ברגע שהמעקב הוא שלם, בחר את סמל גרף מידע כדי לפתוח גיליון אלקטרוני המכיל את הפרמטרים של כלי דם המופקים באופן אוטומטי. מספר צמתים והקטעים זמינים על מסך התצוגה הראשי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חלון קליפת המוח הדק-הגולגולת מאפשר בשני פוטונים הדמיה vivo של נימים בקליפת המוח (איור 1). אזור מתאים לתמונה מראה נימים רבות, שונות (איור 1 א). באותו שדה הראייה, אין קיר תא autofluorescence עורקים, וייתכן שיש אותות אחרים ניאון, כגון הקרינה קולגן, הנגרמים על ידי דור השני הרמוני 11 (איור 1).

לאחר ההכנה של פרוסת המוח היא מלאה, אזור הדמיה כ 1.5mm מקו האמצע נמצא (איור 2 א). 100 מיקרומטר Z- מחסנית מייצרת תמונה תלת-ממדית המשמשת לניתוח בתוכנה אנליטיים עמירה (איור 2). רשת הנימים לאחר מכן איתרה באופן ידני על ידי הצבת צמתים בתחילת וסוף הנימים, או בכל מיקום שבו נימים אחד בחוות לעוד (איור 2 ג). זה מייצר תמונת skeletonized באופן מלא ממנו הפרמטרים מורפולוגיים מופקים באופן אוטומטי (איור 2 ד). מספר צמתים נימים, מגזרים, אומר אורך קטע, סך אורך קטע, ונימים כוללת ניתן לחלץ באמצעות הדמיה שני פוטונים vivo לשעבר של פרוסות מוח עכבר נפח (איור 2).

איור 3 מציג תוצאות נציג שהושגו תוך שימוש בשיטה שהוצגה במאמר זה. בניסוי זה, מודל עכבר מהונדס של neuroinflammation HIV שימש 10. הפקה של HIV virotoxin טאט הייתה מושרה בטאט + עכברים על ידי מזון חדורי דוקסיציקלין למשך 12 שבועות. קבוצת הביקורת כללה המלטת טטנל האכיל את אותו אוכל. לא היה הבדל משמעותי סטטיסטי בין תאת + והעכברים טטנל בכל אחד מהפרמטרים שנמדדו הנימים. לפיכך, החשיפה "12 שבועות של מוח tisלתבוע לHIV-1 תאת אינו מספיק כדי לגרום לואקום של נימי הדם זעיר במוח. לעומת זאת, הנתונים שפורסמו בעבר שלנו מראים כי יותר ממושכים (20 שבועות) ביטוי במערכת העצבים המרכזית כרוני של תוצאות תאת בואקום של כלי דם במוח 7. כך, הנתונים המוצגים כאן (איור 3) מספק מידע חדש בעל ערך בכל הקשור לקינטיקה של שיפוץ של כלי דם הנגרם על-טאט בתוך מערכת העצבים המרכזית של עכברים.

איור 1
איור 1. רכישת קוטר נימים בקליפת המוח. () בעקבות הכנה דקה-גולגולת בקליפת המוח חלון והזרקת צבע פלואורסצנטי תוך ורידי, שני הפוטונים במיקרוסקופ שימש לכלי דם במוח תמונה. בניסויים שלנו, השתמשנו dextran מצומדת לצבע rhodamine פולטות אדום שהיה נרגש ב780 ננומטר, וקרינה הייתה דמיינה באמצעות 607/36 bandpass מסנן פליטה. 11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
דור 2. איור של רשתות נימי skeletonized. עכברים () הוזרקו לוריד עם פלורסנט לצבוע והקריבו. סעיף העטרה 2 מ"מ של המוח נלקח בין גבחת 0 וגבחת -2, וההדמיה בוצעה ב0 גבחת כ -1.5 מ"מ מקו האמצע. א תמונה מייצגת של המיקום בקליפת המוח שנבחר להדמיה (קופסא שחורה) מC57BL / 6 עכבר מוצגת. אזור זה, סוםatosensory קליפה, נבחרה משום שהראינו חוסר ויסות של דם במוח יכול להתרחש באתר זה בטאט + עכברי 12 בעבר. (ב) שלוש תמונות Z- מחסנית ממדיות ייצוגית של רשתות נימים. (ג) תרשים של השיטה המשמש כדי לעקוב אחר אופן ידני נימים בכימות כלי. תמונת נציג של תמונת Z- מחסנית skeletonized (ד '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. כימות ארכיטקטורת כלי דם מוחי בעכברי טטנל לעומת עכברים שנחשפו למועמד HIV virotoxin FO טאטr 12 שבועות. עכברים עם דוקסיציקלין transgene HIV-1 תאת מושרה (DOX) מונע על ידי האמרגן astrocyte ספציפי חלבון גליה fibrillary (GFAP) (עכברי HIV טאט-TG) שמשו כדי לבחון את ההשפעה של HIV-1 neuroinflammation המושרה ב מבנה כלי דם מוחי, כפי שתואר 7. עכברים אלו (תאת +, n = 3) נחשפו למשטר כרוני (12 בשבוע) של האינדוקציה תאת (כלומר., 12 שבועות של DOX). עכברי טטנל (n = 4) שמשו כקבוצת ביקורת באותו גיל (עכברים אלה מתאימות להמלטה אינה מהונדס של העכברים + טאט, ולכן אינו מבטאים HIV-1 טאט). כמו עכברי תאת +, עכברי טטנל גם קיבלו 12 שבועות של חשיפת DOX. בעכברים שנחשפו לתאת במשך 12 שבועות (תאת +), לעומת אלה שלא נחשפו לטאט (טטנל), לא היה הבדל משמעותי מבחינה סטטיסטית במספר צמתים (), מספר המגזרים (ב '), אומר אורך קטע (ג), או אורך כולל נימים (ד '), בקוטר נימים (לעכברי תאת +, נתחנו 14 נימים באזורי 6 הדמיה; לעכברי טטנל, נתחנו 7 נימים באזורי הדמיה 4) (E), או סך נימי נפח (F). מאז נתונים לא מתפלגים נורמלי (כפי שנקבע על ידי בדיקת שפירו-וילק), בדיקת סכום דרגה המדויקת Wilcoxon שימשה לחישוב מובהקות סטטיסטיות (שנקבעו במקרה זה כP <0.05). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת לנתח מבני כלי דם במוח במגוון רחב של דגמים / הגדרות ניסיוניות. להצלחה של שיטה זו, שלושה שלבים קריטיים חייבים להיות משתלטים. ראשית, החלון הדק-הגולגולת אסור לפגוע בגולגולת או במוח בסיסי. זה קל לנקב את הגולגולת בדילול, או לגרום לדליפה של כלי דם חום מושרה. זה יכול להפריע הדמיה כצבע הניאון ידלוף למטוס של מוקד ולטשטש את הנימים. אם הגולגולת לעתים קרובות שוברת במהלך תקופת ההכנה דקה-גולגולת, הוא סביר ביותר הנגרם על ידי לחץ כלפי מטה גדול מדי. מחזיק תרגיל Microtorque הקרוב ככל האפשר לבר מאפשר שליטה רבה יותר מישוש שיקטין את הלחץ כלפי מטה על הגולגולת.

שנית, צנתור עורקים צריך להתרחש במהירות אפשרית פעם אחת העורק נחתך. כישלון להכניס את הצנתר במהירות יכול לגרום לאיבוד דם מוגזם שcompromise השלמות הפיזיולוגית של העכבר. קושי החדרת הצנתר הוא בדרך כלל עקב הגודל הגדול יחסית של הצנתר בהשוואה לעורק הירך. זה עשוי להיות נחוץ כדי למתוח את הצנתר על מנת לצמצם את קוטרו. בנוסף, הטיפים של 5 מלקחיים # יכולים לשמש כדי לתפוס ולהגדיל את הפתיחה עשתה בעורק כדי להקל במיקום של קטטר.

שלישית, משך in vivo הניתוחים צריך להיות ממוזער כך שהרדמת urethane יכולה להינתן בהקדם האפשרי. ההרדמה isoflurane יכולה לגרום להתרחבות של כלי דם במוח 13, ובכך הטתה את נתוני קוטר נימים.

יש להכיר בזה שהתוכנה אנליטיים עמירה באופן אוטומטי יכולה לחלץ את רדיוס של כלי לייחס באופן ידני; עם זאת, בעת השימוש בתכונה זו כדי לנתח Z- מחסנית תמונות ממוח vivo לשעבר, הערך אינו מדויק. סיבה לכך הוא, AFter הסרת המוח, הנימים במוח כבר לא בלחץ, ועלולה להפוך מורפולוגית מעוותת. In vivo מדידת קוטר הנימים עוקפת את הבעיה הזו כי נימי לחץ בתנאים רגילים, פיסיולוגיים.

כמו כן יש לציין כי שיטה זו אינה נטולת מגבלות. ראשית, נדרשת הכשרה משמעותית לשלוט בvivo הכנת ההדמיה. חוקר חייב ללמוד לבצע ביעילות את שתי טכניקות מאתגרות מבחינה טכנית (חלון קליפת המוח דק גולגולת וצנתור עורקים); שגיאה באו טכניקה יכולה להתפשר הניסוי ולפסול את הנתונים. שנית, ניתוח של vivo לשעבר Z- ערימות הוא זמן אינטנסיבי. Skeletonization של תמונת Z- מחסנית אחת יכול לקחת עד 2.5 שעות. יתר על כן, רצוי שניתוח זה יושלם על ידי חוקר מנוסה כדי להבטיח עקביות של תהליך skeletonization (הכולל מדריך לTR זהירacing של כלי דם).

ברגע שכל ההיבטים של פרוטוקול זה שולטים, נתונים המתקבלים מספקים יותר מעמיקים ובכימות מדויק מבחינה פיזיולוגית של פרמטרים של כלי דם בהשוואה לשיטות מסורתיים השתמשו אחרות המציגות צפיפות נימי נימים כליחידת נפח, או נימים לשדה הראייה. In vivo טכניקת ההדמיה מאפשרת לחקר פרמטרים אחרים, לרבות, אך לא רק, אדומה מהירות תא דם, התרחבות עורקיק, ושטף של תאי דם אדום 7,12, אשר עשוי גם להיות מסוגל להיבחן במחקרים ארוכי טווח. יתר על כן, יכול בקלות להיות מותאם זה ושונה כדי ללמוד על שאלות מחקר הקשורים למבנה כלי דם במוח. מחקרים כאלה יכולים לכלול quantitating שינויים פתוגניים במורפולוגיה נימים במחלות נוירו-קוגניטיביים אחרות, או מדידה הקשורות לגיל שינויים בצפיפות נימים. לכן, השיטה שהוצגה במאמר זה הוא כלי רב-תכליתי ורב עוצמה לquantitatניתוח אייב של ארכיטקטורת כלי דם מוחית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica Microscope Leica Inc. MZ8
High Intensity Illuminator Dolan-Jenner 180
Heating Pad Stryker  TP3E
T/PUMP Gaymar Industries, Inc. TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer Datex Ohmeda 447
Artificial Tear Gel Butler AHS 7312
Povidone-Iodine solution  Aplicare 52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Dumot #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
Ferric Chloride Solution Ricca Chemical Company 3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel Henkel 45404
Dental Cement Stoelting 51459
Microtoruqe II Handpiece Kit Pearson Dental R14-0002
005 Burr for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
Norland Blade (Dental Microblade) Salvin Dental 6900
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Group 2B Carcinogen
Braided Suture Ethicon 735G
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
 Arterial Catheter SAI Infusion Technologies MAC-01 The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. 
Blood Pressure Moniter World Precision Intruments SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable World Precision Intruments BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer  Siemens  248
40 μl Capillary Tube VWR 15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) Invitrogen D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope Olypmus FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser Spectra-Physics
ImageJ Software National Institutes of Health (NIH) Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software Visage Imaging 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64, (1), 133-145 (2009).
  2. Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. HIV-1 associated dementia: symptoms and causes. Retrovirology. 3, 28 (2006).
  3. Antinori, A., et al. Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders. Neurology. 69, (18), 1789-1799 (2007).
  4. Clifford, D. B., Ances, B. M. HIV-associated neurocognitive disorder. The Lancet. Infectious diseases. 13, (11), 976-986 (2013).
  5. Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities. Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5, (3), 294-309 (2010).
  6. Zimmermann, J., et al. CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia. PloS one. 8, (2), e57307 (2013).
  7. Silva, J. N., et al. Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity. Microcirculation. 21, (7), 664-676 (2014).
  8. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).
  9. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, (26), 15741-15746 (1998).
  10. Bruce-Keller, A. J., et al. Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice. Glia. 56, (13), 1414-1427 (2008).
  11. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (17), 11014-11019 (2002).
  12. Silva, J., et al. Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5. Journal of neuroinflammation. 9, 253 (2012).
  13. Farber, N. E., et al. Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices. Anesthesiology. 87, (5), 1191-1198 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics