एचआईवी प्रेरित neuroinflammation के एक माउस मॉडल में दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग मस्तिष्क संवहनी वास्तुकला की मात्रा

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Neuroscience

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Nishimura, C., Polesskaya, O., Dewhurst, S., Silva, J. N. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (107), e53582, doi:10.3791/53582 (2016).

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Abstract

Introduction

ह्यूमन इम्यूनो वायरस 1 (एचआईवी -1) वायरस के संक्रमण की तीव्र चरण के दौरान मस्तिष्क पर हमला है, और उत्पादकता अपने सक्रियण के लिए अग्रणी, microglia और मस्तिष्क निवासी मैक्रोफेज दोनों को संक्रमित करता है - और दोनों मेजबान व्युत्पन्न भड़काऊ मध्यस्थों और घुलनशील एचआईवी -1 की रिहाई ऐसे गूंथना और (1,2 में समीक्षा) gp120 के रूप में virotoxins। एक परिणाम के रूप में, एक पुरानी neuroinflammatory राज्य एचआईवी -1 एसोसिएटेड Neurocognitive विकार (हाथ) 3-5 के रोगजनन में योगदान करने के लिए सोचा है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में स्थापित हो जाता है।

एचआईवी -1 गूंथना या चूहों के सीएनएस के भीतर इंटरल्यूकिन (IL) में -17A की जीर्ण overexpression microvascular विरलीकरण 6.7 में परिणाम के लिए दिखाया गया है। यह पुरानी neuroinflammation प्रमस्तिष्क वाहिका पर प्रभाव के माध्यम से हाथ के रोगजनन में योगदान कर सकते हैं कि संभावना उठाती है। आगे इस सवाल की जांच करने के लिए, हम मस्तिष्क संवहनी struc यों करने के तरीकों को विकसित किया हैTures।

इस पत्र, खंड लंबाई, कुल खंड लंबाई मतलब केशिका व्यास, और एक पतली खोपड़ी cortical खिड़की के माध्यम से केशिका नेटवर्क के vivo इमेजिंग में उपयोग करते हुए कुल केशिका मात्रा मतलब है, केशिका नोड्स, केशिका खंडों की संख्या बढ़ाता के लिए एक विधि का वर्णन (पहले वर्णित से संशोधित प्रोटोकॉल) 8,9, साथ ही दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग मस्तिष्क वर्गों के पूर्व vivo इमेजिंग,। इन विवो पतली खोपड़ी cortical खिड़की मस्तिष्क पर्यावरण के संरक्षण के लिए अनुमति देता है के बाद से मस्तिष्क के स्लाइस में केशिका नेटवर्क के पूर्व vivo इमेजिंग के पुनर्निर्माण के लिए सक्षम बनाता है, जबकि इस संयुक्त दृष्टिकोण, मस्तिष्क संवहनी मापदंडों के लिए एक समग्र quantitation के लिए प्रदान करता है तीन आयामी, पूरा केशिका नेटवर्क - तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

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Protocol

पशु संसाधन पर रोचेस्टर विश्वविद्यालय समिति के विश्वविद्यालय इस पत्र में प्रदर्शन सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी।

1. पूर्व शल्य चिकित्सा की तैयारी (और चूहे)

  1. सभी आवश्यक उपकरणों के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करें। पहले से 70% इथेनॉल का उपयोग प्रक्रिया के दौरान सारे उपकरण जीवाणुरहित। वैकल्पिक रूप से, एक ग्लास मनका अजीवाणु का उपयोग करें या उपकरण बाँझ आटोक्लेव।
  2. एक isoflurane vaporizer से जुड़ा एक isoflurane प्रेरण कक्ष में माउस रखें। 1 एल / मिनट की दर से 4% isoflurane के स्तर को निर्धारित करें।
    नोट: अस्थिकणिका विशेष glial fibrillary प्रोटीन (GFAP) प्रमोटर (एचआईवी जैसे-टीजी चूहों) द्वारा संचालित एक डॉक्सीसाइक्लिन (DOX) inducible एचआईवी -1 गूंथना ट्रांस्जीन के साथ यहां बताया प्रयोगों, चूहों के लिए 10 एचआईवी के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया पहले से 7,10 के रूप में वर्णित -1, मस्तिष्क संवहनी संरचना पर neuroinflammation प्रेरित किया।
  3. धीरे और माउस का निरीक्षण करने के लिए प्रेरण कक्ष टिप# 39; s ठीक पलटा। ठीक पलटा दबा दिया गया है, 2% isoflurane स्तर सेट और शल्य बेंच पर नाक शंकु के लिए प्रेरण कक्ष से airflow भेज दें।
  4. जल्दी से पानी संचार हीटिंग पैड करने के लिए प्रेरण कक्ष से माउस ले जाएँ। नाक शंकु के माध्यम से isoflurane (1.5-2%) लागू करने के लिए आगे बढ़ें। सांस की दर (आरआर) की निगरानी के माध्यम से मूल्यांकन व्यक्ति माउस सहिष्णुता के अनुसार संज्ञाहरण समायोजित करें।
    नोट: आरआर के अवसाद मस्तिष्क में रक्त प्रवाह और पोत व्यास मूल्यांकन में फेरबदल शारीरिक गैस मापदंडों के उपद्रव कर सकते हैं। प्रति मिनट 55-65 साँस के बीच आरआर रखने के लिए प्रयास। दिल की दर (मानव संसाधन) भी संज्ञाहरण की गहराई का आकलन किया जा सकता है; पोत व्यास को शारीरिक परिवर्तन को रोकने के लिए प्रति मिनट 300-450 धड़कन के बीच मानव संसाधन रहते हैं। आमतौर पर, संज्ञाहरण एक दिया माउस के लिए 1 एल / मिनट पर 1.5-2.0 isoflurane% के बीच पर्याप्त होगा।
  5. आगे संज्ञाहरण की गहराई से जांच करने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन करते हैं। माउस, कॉम जवाब नहीं हैसर्जिकल प्रक्रियाओं के खिलाडि़यों।

पतली खोपड़ी कपाल खिड़की की 2. तैयारी

  1. माउस की आँखों के लिए कृत्रिम आंसू जेल लागू करें। पूरी तरह से कैंची या एक बिजली के रेजर का उपयोग माउस की खोपड़ी से बालों को हटा दें।
  2. Povidone आयोडीन समाधान को लागू करने से खोपड़ी जीवाणुरहित; शुष्क करने की अनुमति। फिर, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत पूरी तरह से पार्श्विका हड्डियों अंकन, दुम ललाट हड्डियों, और शीर्षस्थान उजागर माउस की खोपड़ी से त्वचा को हटा दें।
  3. आसान हटाने के लिए झिल्ली को सुखाने के लिए आदेश में खोपड़ी के लिए एक 10% फेरिक क्लोराइड समाधान की एक छोटी मात्रा में लागू करें। धीरे खोपड़ी scraping द्वारा # 5/45 संदंश के साथ सूखे झिल्ली निकालें।
  4. Headplate खिड़की के आसपास गोंद की एक पतली परत लागू करें। धीरे खिड़की के केंद्र में रुचि के क्षेत्र में रखते हुए, माउस की खोपड़ी के खिलाफ headplate दबाएँ। गोंद भाजन को headplate को दंत सीमेंट की एक बूंद को लागू करें।
  5. एक पतली परत लागूheadplate खिड़की के किनारे के साथ गोंद का खारा धारण करने के लिए, जिसमें एक जलाशय बनाने के लिए। गोंद सूख गया है एक बार, माउस headplate दोहन में headplate पेंच।
    नोट: इस प्रक्रिया में इस्तेमाल माउस headplate दोहन के लिए एक धातु का आधार है और दो धातु कॉलम के साथ एक संरचना है। प्रत्येक स्तंभ पर एक वसंत और एक पंख अखरोट नहीं है। headplate वसंत के शीर्ष पर रखा गया है, और सिर के स्तर का है और कदम नहीं करता जब तक पंख अखरोट कस दिया जाता है।
  6. 6000 आरपीएम पर सेट एक Microtorque ड्रिल से जुड़ी एक ड्रिल बिट का उपयोग headplate खिड़की से किसी भी गोंद निकालें। वाहिकाओं के लिए संरचनात्मक क्षति हो सकती है कि माउस कपाल के overheating रोकने के लिए हर 10-15 सेकंड बंद करो।
    1. एक नए ड्रिल बिट का उपयोग, midline (headplate खिड़की के व्यास का एक तिहाई) से laterally Microtorque ड्रिल 1.5 मिमी जगह है। 4,000 आरपीएम पर पतली करने के लिए इस स्थान के आसपास खोपड़ी शुरू करो। कोई सीधा नीचे दबाव के साथ खोपड़ी भर में धीरे ड्रिल ले जाएँ।
    2. संघर्ष drilलिंग हर 10-15 सेकंड माउस कपाल overheating रोकने के लिए। इस समय के दौरान, एक संपीड़ित हवा कनस्तर का उपयोग कर संचित खोपड़ी धूल को हटा दें।
    3. 5-10 सेकंड के लिए कपाल शांत करने के लिए आर टी खारा की बूंदों का प्रयोग करें। धीरे खोपड़ी thinning जारी रखने के लिए एक नरम ऊतक के साथ सभी तरल पदार्थ को हटा दें।
  7. खोपड़ी के अंतिम thinning के लिए, headplate जलाशय में खारा की एक छोटी मात्रा जगह है और हल्के से छोटे जहाजों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं जब तक ब्याज के क्षेत्र में एक दंत माइक्रोब्लेड झाडू।

शारीरिक मापदंड 3. निगरानी

  1. खोपड़ी पूरी तरह से पतला होने के बाद, धारक से माउस अलग और अपनी पीठ पर जगह है। धीरे स्पष्ट रूप से औसत दर्जे का जांघों को बेनकाब करने के लिए दोनों पिछले पैरों के नीचे टेप।
  2. कैंची या एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ दोनों औसत दर्जे का जांघों पर बाल निकालें। Povidone आयोडीन के साथ जांघों को कवर द्वारा शल्य साइट कीटाणुरहित।
  3. ऊरु नस ऊपर औसत दर्जे का दाहिनी जांघ पर त्वचा चुटकीऔर धमनी # 5 संदंश का उपयोग। धीरे ऊपर की ओर त्वचा खींच और कटौती और त्वचा को दूर करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    नोट: बाईं जांघ शल्य जटिलताओं (नाड़ी विसंगतियों, उठी वाहिकाओं) की स्थिति में आरक्षित है।
  4. शल्य साइट को 0.9% खारा के लगभग 3-5 बूँदें लागू करें। इस वाहिकाओं के लिए अधिक से अधिक बढ़ाई, साथ ही जहाजों के moisturized साइट रखने और रोकने सुखाने के लिए अनुमति देता है। दो टूक दो # 5/45 संदंश का उपयोग ऊरु neurovascular बंडल में विदारक द्वारा धमनी से ऊरु नस अलग करें।
  5. लगभग 1 सेमी के अलावा और्विक धमनी के नीचे शल्य सीवन के दो, 3 सेमी टुकड़े रखें। कैथीटेराइजेशन के दौरान अत्यधिक खून की कमी को रोकने के लिए मदद मिलेगी कि एक नाड़ी बंधन बनाने के लिए ऊपरी सिवनी दक्षिणावर्त ट्विस्ट।
  6. वसंत कैंची का उपयोग और्विक धमनी में एक छोटा सा चीरा। कैथेटर धमनी के भीतर सुरक्षित है जब तक चीरा और अग्रिम के माध्यम से धमनी में कैथेटर रखें।
  7. रक्त के थक्के रोकने के लिए कैथेटर के माध्यम से हेपरिन के 10 μl (100 आइयू / एमएल) इंजेक्षन। फिर, शल्य चिकित्सा एक साधारण बाधित पैटर्न में 4-0 सीवन के साथ एक साथ त्वचा सिलाई द्वारा दाहिनी जांघ को बंद करें।
  8. Intraperitoneally सही कम चतुर्थ भाग में urethane के 50 μl (1.2 मिलीग्राम / छ) इंजेक्षन। पांच मिनट बाद intraperitoneal urethane के 100 μl की कुल के लिए छोड़ दिया कम चतुर्थ भाग के लिए एक और 50 μl इंजेक्शन के साथ दोहराएँ। समन्वित रूप से संज्ञाहरण की गहराई के लिए माउस पुन: निरीक्षण करते हुए धीरे-धीरे लगभग 0.25% isoflurane के स्तर को कम।
    नोट: यह आंत्र छेदना नहीं करता है, ताकि पीछे पेट की दीवार के साथ पेरिटोनियल गुहा के भीतर सतही सुई रखें। यह पेट की रेक्टस म्यू pinching द्वारा पूरा किया जा सकतादूर आंत से और फिर इंजेक्शन लगाने scles।
  9. एक केशिका ट्यूब का उपयोग करना, कैथेटर से रक्त धमनियों की एक 40 μl नमूना इकट्ठा। एक नमकीन से भरे चार तरह पानी निकलने की टोंटी और हेपरिन-भरा सिरिंज के साथ लगे रक्तचाप ट्रांसड्यूसर को कैथेटर संलग्न।
  10. कैथेटर के अनपेक्षित हटाने को रोकने के लिए शल्य चिकित्सा तंत्र के लिए रक्तचाप ट्रांसड्यूसर टेप। मतलब धमनी दबाव की निगरानी शुरू करो।
  11. एक रक्त गैस विश्लेषक प्रवेश बंदरगाह में रक्त भरा केशिका ट्यूब डालें। सभी रक्त निकाला गया है एक बार, प्रवेश बंदरगाह से केशिका ट्यूब निकालें। 2 हे और सीओ 2 रक्त गैस के स्तर रक्त गैस विश्लेषक से छपी एक कागज पर दिखाई देगा।

फ्लोरोसेंट रंजक 4. इंजेक्शन

  1. # 5 संदंश का उपयोग औसत दर्जे का बाईं जांघ पर त्वचा चुटकी। धीरे ऊपर की ओर त्वचा खींच और कटौती और त्वचा को दूर करने के लिए कैंची का उपयोग करें। Dextran संयुग्मित लाल उत्सर्जन rhodamine डाई तैयार(70 केडीए) (खारा में भंग 10 मिलीग्राम / किग्रा)।
  2. ऊरु जुड़ी एक 30 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज vein.Using जानें, सिरिंज के 130 μl लाइन के लिए इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक फ्लोरोसेंट डाई की एक पहले से तैयार समाधान निकालना। सिरिंज में पूरी तरह से रंग ड्राइंग और मजबूती से सिरिंज दीवार flicking द्वारा सभी हवाई बुलबुले निकालें।
    1. बेंड एक कठिन सतह उठाव पक्ष के खिलाफ यह दबाकर एक लगभग 30 डिग्री के कोण पर 30 जी सुई। डाई के साथ सुई भरें और एक 100 μl नमूना छोड़ रहा है, किसी भी अतिरिक्त तरल त्यागें।
  3. धीरे-धीरे ऊरु नस में डाई के 100 μl नमूना इंजेक्षन। सुई को हटाने के बाद, किसी भी रक्तस्राव रोकने के लिए इंजेक्शन की साइट के लिए स्थिर, धीरे दबाव लागू होते हैं। डाई 5 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, सही ऊरु नस एक और शल्य साइट के निर्माण के माध्यम से आगे खून की कमी को रोकने के लिए फ्लोरोसेंट रंजक इंजेक्शन के लिए बजाय प्रयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, यदिपशु शल्य साइट से अनियंत्रित खून बह रहा है, यह बहुत ज्यादा हेपरिन कैथेटर फ्लश करने के लिए दिया गया था कि एक संकेत हो सकता है। वहाँ 10-15 मिनट के भीतर कोई थक्के है और माउस अभी भी खून बह रहा है, तो एक नया माउस के साथ प्रयोग को पुन: प्रारंभ करने पर विचार।
  4. तो ध्यान से अपने पेट पर माउस फ्लिप, 4-0 सीवन के साथ एक साथ त्वचा सिलाई द्वारा बाईं जांघ बंद करें, और माउस headplate दोहन में जगह।

विवो दो photon इमेजिंग में 5.

  1. निरंतर संज्ञाहरण के स्तर को बनाए रखने के लिए सुनिश्चित कर रही है, दो photon माइक्रोस्कोप के लिए शल्य चिकित्सा के उपकरण ले जाएँ। Headplate जलाशय में 0.9% खारा की एक छोटी मात्रा प्लेस और यह नमक के साथ संपर्क में आता है तो यह है कि माइक्रोस्कोप उद्देश्य कम है। Brightfield देखने उद्देश्य का उपयोग हित के क्षेत्र का पता लगाने
  2. फ्लोरोसेंट डाई के लिए उपयुक्त एक तरंग दैर्ध्य के लिए दो photon लेजर उत्तेजना सेट करें। 25x ओ का उपयोग करते हुए दो photon इमेजिंग शुरूbjective।
    इन प्रयोगों में हम 780 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजित हो गया था कि एक लाल उत्सर्जन rhodamine डाई संयुग्मित एक dextran के लिए प्रयोग किया जाता है कि ध्यान दें। उत्सर्जन फिल्टर bandpass 607/36 एक डाई से प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए, और उत्सर्जन फिल्टर bandpass 480/20 एक धमनी autofluorescence पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था
  3. देखने के लिए स्क्रीन पर बिस्तर एक केशिका जानें, और दो photon इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर केशिकाओं की ऑप्टिकल जूम 2. मोल छवियों का उपयोग कर इस क्षेत्र को बढ़ाना।
  4. इमेजिंग पूर्ण होने के बाद कत्ल के द्वारा पीछा ग्रीवा अव्यवस्था से माउस बलिदान।

6. पूर्व Vivo दो photon इमेजिंग

  1. अतिरिक्त ठीक कैंची का प्रयोग, माउस के ललाट हड्डियों को interparietal हड्डियों से खोपड़ी में एक चीरा बनाने। सूचक उंगली और अंगूठे के साथ खोपड़ी के पक्षों के लिए त्वचा सुरक्षित।
  2. औसत दर्जे का interparietal हड्डी के नीचे अतिरिक्त ठीक कैंची की जगह और बाण के समान सीवन के साथ खोपड़ी में कटौती। पर्वबिन्दु अंकन के बाद लगभग 3 मिमी खोपड़ी काटने बंद करो।
    नोट: मस्तिष्क काटने को रोकने के लिए खोपड़ी काटने जब ऊपर की ओर दबाव लागू करें।
  3. # 5 संदंश का प्रयोग, मस्तिष्क से खोपड़ी अलग और ध्यान से मस्तिष्क की सतह से किसी भी तानिका हटा दें। शेष तानिका गलती से मस्तिष्क फाड़ना कर सकते हैं; अत्यधिक ध्यान इस से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। मस्तिष्क खोपड़ी से मुक्त है जब तक धीरे धीरे आगे आगे बढ़ने के मस्तिष्क के तहत # 5 संदंश स्लाइड।
    नोट: नीचे दबाव मस्तिष्क puncturing से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  4. चूहों के लिए विशिष्ट एक मस्तिष्क सेक्शनिंग उपकरण में मस्तिष्क रखें। दिमाग पर कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव की बूंदों को लागू करने से मस्तिष्क को धो लें।
  5. पर्वबिन्दु को पर्वबिन्दु 0 से मस्तिष्क की एक 2 मिमी राज्याभिषेक अनुभाग हटाये -2। ऊपर की ओर का सामना करना पड़ 0 शीर्षस्थान के साथ कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव युक्त एक अवतल गिलास स्लाइड पर राज्याभिषेक अनुभाग (अनुभाग के सबसे कपाल हिस्सा) रखें। धीरे मस्तिष्क SL कवरएक गिलास को कवर पर्ची के साथ बर्फ।
    नोट: इस संवहनी वास्तुकला ख़राब हो सकती है के रूप में एक बार मस्तिष्क खंड पर रखा कांच दबाने से बचें।
  6. माइक्रोस्कोप चरण के लिए स्लाइड स्थानांतरण और कवर पर्ची पर 0.9% खारा की एक छोटी मात्रा जगह है। यह नमक के साथ संपर्क में आता है, जब तक खुर्दबीन उद्देश्य कम करें। Brightfield उद्देश्य का उपयोग मस्तिष्क के midline लगाएँ।
  7. दो photon इमेजिंग शुरू और फिर 25x उद्देश्य का उपयोग midline का पता लगाने। राज्याभिषेक अनुभाग के cortical सतह पर अनुदैर्ध्य विदर के लिए देख कर यह पूरा। Midline पर इमेजिंग स्क्रीन के ठीक किनारे की जगह और पार्श्व तीन पूर्ण फ्रेम (midline से लगभग 1.5 मिमी) दर्शक स्क्रीन पर ले जाते हैं।
    इन प्रयोगों में, इमेजिंग पैरामीटर कदम 5.2 में नोट में उल्लेख किया है उन लोगों के लिए समान थे कि ध्यान दें।
  8. केशिकाओं दृश्य स्क्रीन पर मुश्किल से दिखाई दे रहे हैं, जिस पर गहराई का पता लगा। फोकस एक अतिरिक्त 20 के विमान लोअरमाइक्रोन z ढेर के शीर्ष निर्धारित करने के लिए।
  9. 1 माइक्रोन के लिए छवि मोटाई निर्धारित करें। 100 माइक्रोन के लिए देखने के लिए स्क्रीन के निचले हिस्से और पिक्सल के 1% से कम oversaturated हैं कि इस तरह के दौरान लेजर शक्ति को समायोजित।
    नोट: जेड ढेर छवियों 100 लगातार 500x500x1 माइक्रोन छवियों की एक श्रृंखला से संकलित कर रहे हैं। अधिक सटीक पोस्ट प्रोसेसिंग गणना होगी z ढेर बड़ा है। आम तौर पर, 100 माइक्रोन या बड़ा की एक z ढेर इकट्ठा करने के लिए प्रयास करते हैं।
  10. आसन्न XY आइकन के द्वारा पीछा XY दोहराएँ आइकन प्रेस। Z ढेर पूरा हो जाए, श्रृंखला किया आइकन प्रेस और फ़ाइल सहेजें।

7. डाटा प्रोसेसिंग

  1. ImageJ सॉफ्टवेयर में एक में विवो केशिका छवि खोलें। मैन्युअल रूप से दो-फोटान सॉफ्टवेयर से प्राप्त मूल्यों पर आधारित दूरी के अनुपात में पिक्सेल निर्धारित किया है।
    1. उपकरण मेनू से * सीधे * आइकन का चयन करें। विपक्ष को एक केशिका दीवार से देने के लिए एक लाइन ड्रासाइट केशिका दीवार, और ImageJ द्वारा प्रदान की लंबाई रिकॉर्ड है।
      यह स्पष्ट रूप से केशिका दीवारों के किनारों कल्पना करने के क्रम में छवि में ज़ूम करने के लिए आवश्यक हो सकता है कि ध्यान दें।
    2. केशिका के साथ विभिन्न स्थानों पर दोहराएँ कदम 7.1.1, साथ ही साथ के लिए छवि में कई केशिकाओं।
  2. ऐसे अमीरा के रूप में विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर में z ढेर फ़ाइल खोलें। उप आवेदन उपकरण पट्टी से रेशा संपादक आइकन का चयन करें
    1. ऊपर या जेड के ढेर के नीचे या तो करने के लिए लगभग 20 हटो के लिए दर्शक दर्शक मोटाई निर्धारित करें।
    2. ट्रेस आइकन का चयन करें और भरी हुई छवि पर कर्सर ले जाते हैं। चित्रा -2 में वर्णित स्थानों पर केशिकाओं पर प्लेस नोड्स; खंडों स्वचालित रूप से आसन्न नोड्स के बीच में दिखाई देगा। पूरे z ढेर भर केशिकाओं का पता लगा।
      नोट: यह thr केशिकाओं पता लगाने के क्रम में अंत अंक और शाखा अंक के बीच में नोड्स के लिए जगह जरूरी होगाz ढेर oughout।
    3. इन नोड्स को दूर करने के लिए, इंटरमीडिएट निकालें आइकन पर क्लिक करें।
      नोट: इस को हटा करें आइकन का चयन तब चयन एकल चिह्न का उपयोग पाश का चयन, और करके स्वयं भी हटा दिया जाना चाहिए कि गलत looped सेगमेंट बना सकते हैं। छोरों ट्रेसिंग के दौरान एक ही क्षेत्र में प्रदर्शित करने के लिए जारी रखते हैं, यह नोड्स अलग केशिकाओं पर रखा गया है कि संभावना है।
    4. ट्रेसिंग पूरा होने के बाद स्वचालित रूप से निकाले नाड़ी के मापदंडों से युक्त एक स्प्रेडशीट खोलने के लिए ग्राफ़ जानकारी आइकन का चयन करें। नोड्स और क्षेत्रों की संख्या मुख्य दृश्य स्क्रीन पर उपलब्ध हैं।

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Representative Results

पतली खोपड़ी cortical खिड़की कॉर्टिकल केशिकाओं के vivo दो photon इमेजिंग (चित्रा 1) के लिए अनुमति देता है। छवि के लिए एक उपयुक्त क्षेत्र में कई अलग केशिकाओं (चित्रा 1 ए) से पता चलता है। देखने का एक ही क्षेत्र में, कोई धमनी कोशिका दीवार autofluorescence नहीं है, और दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी 11 (चित्रा 1 बी) द्वारा प्रेरित इस तरह के कोलेजन प्रतिदीप्ति के रूप में अन्य फ्लोरोसेंट संकेत है, हो सकता है।

मस्तिष्क टुकड़ा की तैयारी पूरी हो जाने के बाद, लगभग 1.5 मिमी midline से स्थित है एक इमेजिंग क्षेत्र (2A चित्रा)। ए 100 माइक्रोन z ढेर अमीरा विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर (चित्रा 2 बी) में विश्लेषण के लिए इस्तेमाल एक तीन आयामी छवि पैदा करता है। केशिका नेटवर्क तो स्वयं शुरुआत और एक केशिका के अंत में, या किसी भी स्थान है, जहां एक केशिका B में नोड्स रखकर पता लगाया हैएक और (चित्रा -2) में फार्मों। यह रूपात्मक मानकों स्वचालित रूप से निकाले जाते हैं, जिसमें से एक पूरी तरह से skeletonized छवि (चित्रा 2 डी) पैदा करता है। केशिका नोड्स, खंडों की संख्या, खंड लंबाई, कुल खंड लंबाई, और माउस मस्तिष्क स्लाइस की दो photon पूर्व vivo इमेजिंग का उपयोग कर निकाला जा सकता है, कुल केशिका मात्रा (चित्रा 2) से मतलब है।

चित्रा 3 इस पत्र में प्रस्तुत विधि का उपयोग कर प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है। इस प्रयोग में, एचआईवी neuroinflammation की एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल 10 का इस्तेमाल किया गया था। गूंथना virotoxin एचआईवी का उत्पादन 12 हफ्तों के लिए डॉक्सीसाइक्लिन संचार भोजन से गूंथना + चूहों में प्रेरित किया गया था। नियंत्रण समूह एक ही खाना खिलाया Tat- littermates शामिल थे। मापा केशिका के मापदंडों में से किसी में गूंथना + और Tat- चूहों के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। इस प्रकार, मस्तिष्क के 12 सप्ताह 'जोखिम आज़ादीएचआईवी -1 गूंथना करने के लिए मुकदमा मस्तिष्क microvasculature की विरलीकरण पैदा करने के लिए अपर्याप्त है। इसके विपरीत, हमारे पहले प्रकाशित डेटा अधिक मस्तिष्क वाहिका 7 की विरलीकरण में गूंथना परिणामों की पुरानी सीएनएस अभिव्यक्ति लंबे समय तक (20 सप्ताह) बताते हैं कि। इस प्रकार, यहाँ दिखाया गया डेटा (चित्रा 3) चूहों के सीएनएस के भीतर गूंथना प्रेरित संवहनी remodeling के कैनेटीक्स के संबंध में मूल्यवान नई जानकारी प्रदान करता है।

आकृति 1
कॉर्टिकल केशिका व्यास की चित्रा 1. अधिग्रहण। (ए) एक पतली खोपड़ी cortical खिड़की तैयारी और नसों में फ्लोरोसेंट रंजक इंजेक्शन के बाद, दो photon माइक्रोस्कोपी छवि मस्तिष्क वाहिका के लिए इस्तेमाल किया गया था। हमारे प्रयोगों में, हम 780 एनएम पर उत्साहित किया गया था कि एक लाल उत्सर्जन rhodamine डाई संयुग्मित एक dextran के लिए प्रयोग किया जाता है, और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर bandpass 607/36 एक के माध्यम से कल्पना की गई थी। 11 के माध्यम से प्रकट करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Skeletonized केशिका नेटवर्क की चित्रा 2 जनरेशन। (ए) चूहे नसों के द्वारा एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ इंजेक्शन और बलिदान किया गया। मस्तिष्क के एक 2 मिमी राज्याभिषेक अनुभाग पर्वबिन्दु 0 और शीर्षस्थान -2 के बीच ले जाया गया था, और इमेजिंग midline से 0 पर्वबिन्दु लगभग 1.5 मिमी पर प्रदर्शन किया गया था। ए एक C57BL 6 / माउस से इमेजिंग (ब्लैक बॉक्स) के लिए चुना कॉर्टिकल स्थान के प्रतिनिधि छवि में दिखाया गया है। इस क्षेत्र में, सोमहम पहले से गूंथना + चूहों 12 में इस साइट पर हो सकता है मस्तिष्क में रक्त की कि अनियंत्रण से पता चला है क्योंकि atosensory कॉर्टेक्स, चुना गया था। (बी) केशिका नेटवर्क के प्रतिनिधित्ववादी तीन आयामी जेड ढेर छवियों। (सी) आरेख विधि के मैन्युअल का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया पोत मात्रा का ठहराव के दौरान केशिकाओं। (डी) skeletonized z ढेर छवि के प्रतिनिधि छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
गूंथना के लिए virotoxin उम्मीदवार एचआईवी के संपर्क में चूहों बनाम Tat- चूहों में मस्तिष्क संवहनी वास्तुकला का चित्रा 3. मात्राआर 12 हफ्तों। अस्थिकणिका विशेष glial fibrillary प्रोटीन (GFAP) प्रमोटर (एचआईवी जैसे-टीजी चूहों) द्वारा संचालित एक डॉक्सीसाइक्लिन (DOX) inducible एचआईवी -1 गूंथना ट्रांस्जीन के साथ चूहों पर एचआईवी -1 प्रेरित neuroinflammation के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया मस्तिष्क संवहनी संरचना, के रूप में 7 का वर्णन किया। इन चूहों (गूंथना + एन = 3) जैसे प्रेरण की एक पुरानी (12 सप्ताह) आहार के लिए खुल गए थे (DOX की अर्थात्।, 12 सप्ताह)। Tat- चूहों (एन = 4) (इन चूहों एचआईवी -1 गूंथना व्यक्त नहीं करते इसलिए गूंथना + चूहों के गैर ट्रांसजेनिक littermates के अनुरूप है, और) उम्र से मिलान नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। गूंथना + चूहों की तरह, Tat- चूहे भी DOX जोखिम के 12 सप्ताह प्राप्त किया। उन जैसे (Tat-) के संपर्क में नहीं बनाम 12 सप्ताह (गूंथना +) के लिए गूंथना के संपर्क में चूहों में, नोड्स (ए) की संख्या में कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर है, खंडों की संख्या (बी), खंड लंबाई मतलब नहीं था (सी), या कुल केशिका लंबाई (डी), केशिका व्यास (के लिएगूंथना + चूहों, हम 6 इमेजिंग क्षेत्रों में 14 केशिकाओं का विश्लेषण किया; Tat- चूहों के लिए), हम 4 इमेजिंग क्षेत्रों में 7 केशिकाओं) (ई) का विश्लेषण किया, या कुल केशिका मात्रा (एफ। डेटा सामान्य रूप से (शापिरो-विल्क परीक्षण द्वारा निर्धारित रूप में) वितरित नहीं किए गए थे, सटीक Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण (पी <0.05 के रूप में इस मामले में निर्धारित) सांख्यिकीय महत्व। गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ वर्णित विधि प्रयोगात्मक मॉडल / सेटिंग्स की एक विस्तृत श्रृंखला में मस्तिष्क microvascular संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है। इस विधि की सफलता के लिए, तीन महत्वपूर्ण कदम में महारत हासिल किया जाना चाहिए। सबसे पहले, पतली खोपड़ी खिड़की खोपड़ी या अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान नहीं होना चाहिए। यह thinning दौरान खोपड़ी पंचर, या गर्मी प्रेरित संवहनी रिसाव पैदा करने के लिए आसान है। फ्लोरोसेंट रंजक ध्यान के विमान में रिसाव और केशिकाओं अस्पष्ट होगा, क्योंकि यह इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। खोपड़ी अक्सर पतली खोपड़ी तैयारी के दौरान टूट जाता है, तो यह सबसे अधिक संभावना भी एक महान नीचे दबाव के कारण होता है। गड़गड़ाहट करने के लिए संभव के रूप में बंद Microtorque ड्रिल होल्डिंग खोपड़ी पर गिरावट का दबाव कम हो जाएगा कि अधिक से अधिक स्पर्श नियंत्रण के लिए अनुमति देता है।

दूसरा, धमनी कैथीटेराइजेशन के रूप में जल्दी संभव के रूप में धमनी काट दिया गया है एक बार हो जाना चाहिए। जल्दी से कैथेटर डालने करने में विफलता कंप्यूटर अनुप्रयोग होगा कि अत्यधिक खून की कमी पैदा कर सकता हैमाउस के शारीरिक अखंडता romise। कैथेटर डालने कठिनाई के कारण और्विक धमनी की तुलना में कैथेटर के अपेक्षाकृत बड़े आकार के लिए आमतौर पर है। यह अपने व्यास को कम करने के क्रम में कैथेटर फैलाने के लिए आवश्यक हो सकता है। इसके अतिरिक्त, # 5 संदंश के सुझावों कैथेटर की नियुक्ति में कम करने के लिए धमनी में किए गए उद्घाटन हड़पने के लिए और विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Urethane संज्ञाहरण जितनी जल्दी हो सके प्रशासित किया जा सकता है, ताकि तीसरा, इन विवो शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की अवधि को कम से कम किया जाना चाहिए। isoflurane संज्ञाहरण इस प्रकार केशिका व्यास डेटा skewing, मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं 13 के वाहिकाप्रसरण पैदा कर सकता है।

यह अमीरा विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से मैन्युअल पता लगाया वाहिकाओं की त्रिज्या निकाल सकते हैं कि स्वीकार किया जाना चाहिए; पूर्व vivo दिमाग से Z ढेर छवियों का विश्लेषण करने के लिए इस सुविधा का उपयोग करते समय हालांकि, मूल्य गलत है। यह वायुसेना, क्योंकि हैमस्तिष्क को हटाने आतंकवाद, मस्तिष्क केशिकाओं अब कोई दबाव हैं, और आकृति विज्ञान विकृत हो सकता है। केशिकाओं सामान्य, शारीरिक शर्तों के तहत दबाव रहे हैं, क्योंकि इन विवो केशिका व्यास माप इस समस्या में गतिरोध उत्पन्न।

यह भी इस विधि सीमाओं के बिना नहीं है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, महत्वपूर्ण प्रशिक्षण में vivo इमेजिंग तैयारी में महारत हासिल करने के लिए आवश्यक है। एक शोधकर्ता कुशलता से दो तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण तकनीक (पतली खोपड़ी cortical खिड़की और धमनी कैथीटेराइजेशन) प्रदर्शन करने के लिए सीखना चाहिए; या तो तकनीक में एक त्रुटि प्रयोग समझौता और डेटा को अमान्य कर सकते हैं। दूसरा, पूर्व vivo Z ढेर के विश्लेषण के समय लेने वाला है। एक z ढेर छवि के skeletonization 2.5 घंटे तक का समय लग सकता है। इस विश्लेषण सावधान मैनुअल टीआर शामिल है जो skeletonization प्रक्रिया की निरंतरता (सुनिश्चित करने के लिए एक अनुभवी शोधकर्ता द्वारा पूरा किया जाना है कि इसके अलावा, यह सलाह दी जाती हैरक्त वाहिकाओं के acing)।

एक बार जब इस प्रोटोकॉल के सभी पहलुओं को प्राप्त आंकड़ों को देखने के क्षेत्र में प्रति इकाई मात्रा प्रति केशिकाओं, या केशिकाओं के रूप में केशिका घनत्व चलता है कि अन्य परंपरागत रूप से इस्तेमाल किया तरीकों की तुलना में एक अधिक गहराई और नाड़ी मापदंडों के physiologically सटीक quantitation प्रदान करते हैं, में महारत हासिल कर रहे हैं। vivo इमेजिंग तकनीक सहित अन्य मानकों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी अनुदैर्ध्य अध्ययन में जांच की जा करने में सक्षम हो सकता है, जो लाल रक्त कोशिका वेग, धमनिका फैलाव, और लाल रक्त कोशिका प्रवाह 7,12, तक ही सीमित नहीं। इसके अलावा, यह आसानी से अनुकूलित और मस्तिष्क microvascular संरचना से संबंधित अनुसंधान के सवालों का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस तरह के अध्ययन अन्य neurocognitive रोगों में केशिका आकृति विज्ञान में रोगजनक परिवर्तन quantitating, या केशिका घनत्व में उम्र से संबंधित बदलाव को मापने शामिल हो सकते हैं। इसलिए, इस पत्र में प्रस्तुत विधि quantitat के लिए एक बहुमुखी और शक्तिशाली उपकरण हैमस्तिष्क संवहनी वास्तुकला का Ive विश्लेषण।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica Microscope Leica Inc. MZ8
High Intensity Illuminator Dolan-Jenner 180
Heating Pad Stryker  TP3E
T/PUMP Gaymar Industries, Inc. TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer Datex Ohmeda 447
Artificial Tear Gel Butler AHS 7312
Povidone-Iodine solution  Aplicare 52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Dumot #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
Ferric Chloride Solution Ricca Chemical Company 3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel Henkel 45404
Dental Cement Stoelting 51459
Microtoruqe II Handpiece Kit Pearson Dental R14-0002
005 Burr for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
Norland Blade (Dental Microblade) Salvin Dental 6900
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Group 2B Carcinogen
Braided Suture Ethicon 735G
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
 Arterial Catheter SAI Infusion Technologies MAC-01 The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. 
Blood Pressure Moniter World Precision Intruments SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable World Precision Intruments BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer  Siemens  248
40 μl Capillary Tube VWR 15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) Invitrogen D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope Olypmus FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser Spectra-Physics
ImageJ Software National Institutes of Health (NIH) Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software Visage Imaging 

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References

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