Cuantificación de Cerebral Vascular Arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el VIH

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Nishimura, C., Polesskaya, O., Dewhurst, S., Silva, J. N. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (107), e53582, doi:10.3791/53582 (2016).

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Abstract

Introduction

Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 (VIH-1) invade el cerebro durante la fase aguda de infección por el virus, e infecta productivamente ambos microglia y macrófagos residentes del cerebro, lo que conduce a su activación - y la liberación de ambos mediadores inflamatorios derivados del huésped y soluble VIH-1 virotoxins tales como Tat y gp120 (revisado en 1,2). Como consecuencia, un estado neuroinflamatoria crónica se establece en el SNC, que se cree que contribuyen a la patogénesis del VIH-1 Trastornos neurocognitivos asociados (mano) 3-5.

La sobreexpresión crónica del VIH-1 Tat o interleucina (IL) -17A dentro del SNC de ratones se ha demostrado que resulta en microvascular rarefacción 6,7. Esto plantea la posibilidad de que la neuroinflamación crónica puede contribuir a la patogénesis de la mano a través de efectos sobre la vasculatura cerebral. Con el fin de examinar más a fondo esta cuestión, hemos desarrollado métodos para cuantificar estruc vasculares cerebralesturas.

Este documento describe un método para cuantificar el número de nodos capilares, segmentos capilares, significa la longitud del segmento, la longitud total del segmento, diámetro medio capilar, y volumen total capilar utilizando imágenes in vivo de las redes capilares a través de una ventana cortical cráneo delgado (modificado a partir descrito previamente protocolos) 8,9, así como ex vivo de imágenes de secciones de cerebro, usando microscopía de dos fotones. Este enfoque combinado proporciona una cuantificación global de los parámetros vasculares cerebrales, ya que la fina calavera ventana cortical in vivo permite la preservación del medio ambiente cerebral, mientras que ex vivo de imágenes de las redes capilares en rodajas de cerebro permite la reconstrucción de completo, en tres dimensiones redes capilares - que luego puede cuantificarse utilizando software disponible comercialmente.

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Protocol

La Universidad de la Universidad de Rochester Comité de Recursos Animal aprobó todos los procedimientos realizados en este trabajo.

Preparación 1. Pre-quirúrgica (y ratones)

  1. Prepare el área quirúrgica con todo el equipo necesario. Esterilizar todos los instrumentos utilizados durante el procedimiento de antemano el uso de 70% de etanol. Opcionalmente, utilice un esterilizador de vidrio perla o autoclave para esterilizar las herramientas.
  2. Coloque el ratón en una cámara de inducción isoflurano conectado a un vaporizador de isoflurano. Establecer niveles de isoflurano a 4% a una velocidad de 1 L / min.
    Nota: para los experimentos aquí, ratones con doxiciclina (DOX) inducible transgén VIH-1 Tat impulsado por la proteína glial fibrilar específico de astrocitos (GFAP) promotor (VIH Tat-ratones Tg) 10 se utilizaron para examinar el efecto del VIH -1 neuroinflamación en la estructura vascular cerebral inducida, como se describió previamente 7,10.
  3. Inclinar suavemente la cámara de inducción para observar el ratón y# 39; s reflejo de enderezamiento. Una vez que el reflejo de enderezamiento se ha suprimido, establecer el nivel de isoflurano al 2% y redirigir el flujo de aire de la cámara de inducción al cono de la nariz en el banco quirúrgica.
  4. Mueve rápidamente el ratón desde la cámara de inducción al agua infundida almohadilla térmica. Continúe aplicando isoflurano (1,5-2%) a través del cono de la nariz. Ajuste la anestesia según la tolerancia individual del ratón evaluado a través de la frecuencia respiratoria (RR) de supervisión.
    Nota: La depresión de RR puede perturbar los parámetros de gas fisiológicos que alteran el flujo sanguíneo cerebral y la evaluación diámetro del vaso. Intente mantener RR entre 55-65 respiraciones por minuto. La frecuencia cardíaca (HR) también se puede utilizar evaluar profundidad de la anestesia; mantener HR entre 300-450 latidos por minuto para evitar cambios fisiológicos a diámetro del vaso. Típicamente, la anestesia será adecuada entre 1.5-2.0% de isoflurano a 1 L / min para un ratón dado.
  5. Realice una pizca dedo para comprobar aún más la profundidad de la anestesia. Si el ratón no responde, commEnce los procedimientos quirúrgicos.

2. Preparación de la ventana craneal Thin-cráneo

  1. Aplicar gel de lágrimas artificiales a los ojos del ratón. Eliminar completamente el cabello desde el cuero cabelludo del ratón usando tijeras o una máquina de afeitar eléctrica.
  2. Esterilizar el cuero cabelludo mediante la aplicación de solución de povidona yodada; dejar secar. Luego, con un microscopio óptico, quite la piel del cuero cabelludo del ratón, exponiendo completamente los huesos parietales, los huesos frontales caudales, y marcado bregma.
  3. Aplicar una pequeña cantidad de una solución de cloruro férrico al 10% en el cráneo con el fin de secar las membranas para una fácil extracción. Retire las membranas secas con el # 5/45 fórceps raspando suavemente el cráneo.
  4. Aplique una capa fina de pegamento alrededor de la ventana placa cabecera. Presione suavemente la placa cabecera contra el cráneo del ratón, manteniendo el área de interés en el centro de la ventana. Aplicar una gota de cemento dental a la placa cabecera para polimerizar el pegamento.
  5. Aplique una capa finade pegamento a lo largo del borde de la ventana placa cabecera para crear un depósito en el que para mantener la solución salina. Una vez que el pegamento se haya secado, atornillar la placa superior en el arnés placa cabecera ratón.
    Nota: el arnés placa cabecera del ratón utilizado en este procedimiento es una estructura con una base de metal y dos columnas metálicas. En cada columna hay un resorte y una tuerca de mariposa. La placa superior se coloca en la parte superior de la primavera, y la tuerca de mariposa se aprieta hasta que la cabeza esté nivelado y no se mueve.
  6. Retire cualquier pegamento de la ventana de placa cabezal con una broca unido a un taladro MicroTorque fijado en 6.000 rpm. Deje de cada 10 a 15 segundos para evitar el sobrecalentamiento del cráneo del ratón que puede resultar en daños estructurales en los vasos.
    1. Usando una broca nueva, colocar el taladro de 1,5 mm MicroTorque lateralmente desde la línea media (un tercio del diámetro de la ventana placa cabecera). Comience a enrarecer el cráneo alrededor de esta ubicación a 4.000 rpm. Mueva el taladro suavemente a través del cráneo sin presión a la baja directa.
    2. Dril Ceseling cada 10 a 15 segundos para evitar el sobrecalentamiento del cráneo del ratón. Durante este tiempo, retirar el polvo acumulado cráneo usando un bote de aire comprimido.
    3. Use gotas de solución salina RT enfriar cráneo durante 5-10 seg. Retire con cuidado todo el líquido con un paño suave para continuar adelgazamiento cráneo.
  7. Para el adelgazamiento final del cráneo, colocar un pequeño volumen de solución salina en el depósito de placa superior y ligeramente barrer un microcuchilla dental sobre el área de interés hasta los vasos pequeños son claramente visibles.

3. vigilancia de parámetros fisiológicos

  1. Una vez que el cráneo está completamente adelgazado, separar el ratón del soporte y colóquelo en la espalda. Cinta suavemente ambas patas traseras para exponer claramente los muslos mediales.
  2. Quite el pelo sobre ambos muslos mediales con unas tijeras o una máquina de afeitar eléctrica. Desinfectar la zona quirúrgica cubriendo los muslos con povidona yodada.
  3. Pellizcar la piel en el muslo medial justo encima de la vena femoraly la arteria utilizando el # 5 fórceps. Tire suavemente la piel hacia arriba y usar las tijeras para cortar y quitar la piel.
    Nota: el muslo izquierdo está reservada en caso de complicaciones quirúrgicas (anomalías vasculares, los vasos rotos).
  4. Aplicar aproximadamente 3-5 gotas de 0,9% de solución salina al sitio quirúrgico. Esto permite una mayor ampliación de los vasos, así como mantener el sitio hidratada y prevenir el secado de los vasos. Separar la vena femoral de la arteria por rodeos disección en el paquete neurovascular femoral utilizando dos # 5/45 fórceps.
  5. Coloque dos, 3 piezas cm de sutura quirúrgica por debajo de la arteria femoral aproximadamente 1 cm de distancia. Gire la sutura hacia la derecha superior para crear un torniquete vascular que le ayudará a prevenir la pérdida excesiva de sangre durante el cateterismo.
  6. Hacer una pequeña incisión en la arteria femoral con las tijeras de primavera. Colocar el catéter en la arteria a través de la incisión y avance hasta que el catéter es de forma segura dentro de la arteria.
  7. Inyectar 10 l de heparina (100 UI / ml) a través del catéter para evitar la coagulación de la sangre. A continuación, cierre quirúrgicamente el muslo derecho cosiendo la piel junto con una sutura de 4-0 en un patrón interrumpido simple.
  8. Inyectar 50 l de uretano (1,2 mg / g) por vía intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho. Cinco minutos más tarde repetir con otra inyección de 50 l para el cuadrante inferior izquierdo para un total de 100 l de uretano intraperitoneal. Poco a poco reducir los niveles de isoflurano a aproximadamente 0,25%, mientras que concomitantemente volver a controlar el ratón por la profundidad de la anestesia.
    Nota: Mantenga la aguja superficial dentro de la cavidad peritoneal a lo largo de la pared abdominal posterior de modo que no perforar el intestino. Esto se puede lograr por pellizcar la mu recto abdominalscles lejos de las vísceras y luego inyectar.
  9. El uso de un tubo capilar, recoger una muestra de 40 l de sangre arterial del catéter. Una el catéter hasta el transductor de presión sanguínea equipado con una llave de paso de cuatro vías lleno de solución salina y la jeringa llena de heparina.
  10. Tape el transductor de presión de sangre al aparato quirúrgico para evitar la eliminación no intencionada la del catéter. Comience el monitoreo de la presión arterial media.
  11. Inserte el tubo capilar de la sangre llena en un puerto de entrada analizador de gases en sangre. Una vez que toda la sangre se ha extraído, retire el tubo capilar desde el puerto de entrada. Las juntas 2 y CO 2 niveles de gases en sangre van a aparecer en un papel impreso desde el analizador de gases en sangre.

4. La inyección del colorante fluorescente

  1. Pellizcar la piel en el muslo medial izquierda utilizando el # 5 pinzas. Tire suavemente la piel hacia arriba y usar las tijeras para cortar y quitar la piel. Preparar dextrano roja colorante rodamina emisor conjugado(70 kDa) (10 mg / kg disueltos en solución salina).
  2. Localizar la femoral vein.Using una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G adjunto, dibujar una solución previamente preparada de un colorante fluorescente apropiado para formación de imágenes a la línea de 130 l de la jeringa. Eliminar todas las burbujas de aire dibujando el tinte completamente en la jeringa y agitando firmemente la pared de la jeringa.
    1. Doble el 30 G aguja en un ángulo de aproximadamente 30 grados presionándolo contra una superficie dura lado bisel hacia arriba. Llene la aguja con el tinte y deseche cualquier exceso de líquido, dejando una muestra de 100 l.
  3. Se inyecta la muestra de 100 l de tinte lentamente en la vena femoral. Después de retirar la aguja, aplique firme, suave presión en el lugar de la inyección para detener cualquier sangrado. Permitir que el colorante circule durante 5 min.
    Nota: como alternativa, la vena femoral derecha se puede utilizar en lugar de la inyección tinte fluorescente para evitar una mayor pérdida de sangre a través de la creación de otro sitio quirúrgico. Además, si elanimales está sangrando sin control desde el sitio quirúrgico, esto puede ser una indicación de que el exceso de heparina fue dado a enjuagar el catéter. Si no hay coagulación dentro de 10-15 min y el ratón sigue sangrando, considere reiniciar el experimento con un nuevo ratón.
  4. Cierre el muslo izquierdo cosiendo la piel junto con una sutura de 4-0, y luego la vuelta con cuidado el ratón sobre su estómago, y lo coloca en el arnés placa cabecera ratón.

5. En Vivo De dos fotones de imágenes

  1. Mueva el aparato quirúrgico para el microscopio de dos fotones, asegurándose de mantener los niveles de anestesia continuas. Colocar una pequeña cantidad de 0,9% de solución salina en el depósito de placa cabecera y bajar el objetivo de microscopio de manera que entra en contacto con la solución salina. Localice el área de interés con el objetivo de campo claro de visión
  2. Ajuste el láser de excitación de dos fotones a una longitud de onda apropiada para el colorante fluorescente. Comience la imagen de dos fotones usando el 25x objetivo.
    Tenga en cuenta que en estos experimentos se utilizó un dextrano conjugado con un emisor de tinte rojo rodamina que estaba emocionado a una longitud de onda de 780 nm. A 607/36 de paso de banda filtro de emisión para detectar la fluorescencia a partir del colorante, y un filtro de emisión de paso de banda 480/20 se utilizó para detectar la autofluorescencia arterial
  3. Busque un capilar cama en la pantalla de la vista, y ampliar esta área se utiliza el zoom 2. Adquirir imágenes ópticas de los capilares utilizando el software de imagen de dos fotones.
  4. Después de las imágenes es completa, sacrifica el ratón por dislocación cervical seguido por decapitación.

6. Ex Vivo en dos fotones de imágenes

  1. Usando las tijeras finas extra, hacer una incisión en el cuero cabelludo de los huesos interparietales a los huesos frontales del ratón. Fije la piel a los lados del cráneo con el dedo índice y el pulgar.
  2. Coloque las tijeras finas adicionales debajo del hueso interparietal medial y cortar el cráneo a lo largo de la sutura sagital. Deje de cortar el cráneo de aproximadamente 3 mm después de marcar el bregma.
    Nota: Aplicar presión al alza al cortar el cráneo para evitar cortar el cerebro.
  3. Usando los fórceps # 5, separar el cráneo desde el cerebro y cuidadosamente eliminar cualquier meninges desde la superficie del cerebro. Meninges restantes pueden lacerar accidentalmente el cerebro; extrema se debe tener cuidado para evitar esto. Deslice suavemente los # 5 fórceps debajo del cerebro avanzando lentamente hacia adelante hasta que el cerebro está libre de cráneo.
    Nota: presión hacia abajo que se debe utilizar con el fin de evitar perforar el cerebro.
  4. Coloque el cerebro en una herramienta de cerebro de seccionamiento específico para ratones. Lavar el cerebro mediante la aplicación de gotas de líquido cefalorraquídeo artificial sobre el cerebro.
  5. Eliminar una sección coronal 2 mm de cerebro de bregma 0 a bregma -2. Coloque la sección coronal en un portaobjetos de vidrio cóncava que contiene líquido cefalorraquídeo artificial con el bregma 0 (la mayoría parte craneal de la sección) mirando hacia arriba. Cubrir suavemente el sl cerebrohielo con una hoja de cubierta de vidrio.
    Nota: Evite presionar el vidrio una vez colocado en la sección del cerebro, ya que puede deformar la arquitectura vascular.
  6. Transferir la diapositiva a la platina del microscopio y colocar una pequeña cantidad de solución salina 0,9% en la hoja de la cubierta. Bajar el objetivo de microscopio hasta que entra en contacto con la solución salina. Busque la línea media del cerebro utilizando el objetivo de campo claro.
  7. Comience la imagen de dos fotones y localice la línea media de nuevo utilizando el objetivo 25x. Lograr esto mediante la búsqueda de la fisura longitudinal en la superficie cortical de la sección coronal. Coloque el borde derecho de la pantalla de imágenes en la línea media y mover la pantalla del visor sobre lateralmente de tres fotogramas completos (aproximadamente 1,5 mm de la línea media).
    Tenga en cuenta que en estos experimentos, los parámetros de imagen eran idénticas a las mencionadas en la nota en el paso 5.2.
  8. Busque la profundidad a la que los capilares son apenas visibles en la pantalla de vista. Baje el plano de enfoque un adicional de 20m para determinar la parte superior de la z-pila.
  9. Ajuste el espesor imagen para 1 micras. Baje la pantalla de vista de 100 micras y ajustar la potencia del láser a lo largo de tal manera que menos del 1% de los píxeles son sobresaturado.
    Nota: las imágenes z-stack se compilan a partir de una serie de 100 500x500x1 consecutivo imágenes micras. Cuanto mayor sea el z-stack más precisos serán los cálculos de procesamiento posterior será. En general, intentar cobrar un z-pila de 100 micras o más grandes.
  10. Pulse el icono XY Repita seguido por el icono XY adyacente. Una vez que el z-pila está completa, pulse el icono de la Serie Hecho y guarde el archivo.

7. Tratamiento de datos

  1. Abra una imagen capilar en vivo en el software ImageJ. Establezca manualmente el píxel de relación a distancia basada en los valores obtenidos a partir del software de dos fotones.
    1. Seleccione la recta * * icono en el menú de herramientas. Dibuja una línea que se extiende desde una pared capilar a la opositio de la pared capilar, y registrar la longitud proporcionada por ImageJ.
      Tenga en cuenta que puede ser necesario para hacer un zoom en la imagen con el fin de visualizar claramente los bordes de las paredes de los capilares.
    2. Repita el paso 7.1.1 en diferentes lugares a lo largo del capilar, así como para múltiples capilares en la imagen.
  2. Abra el archivo z-stack en el software de análisis como Amira. Seleccione el icono de Filamento Editor de la barra de herramientas de sub-aplicación
    1. Ajuste el espesor espectador a aproximadamente 20. Mover al espectador a la parte superior o inferior de la z-stack.
    2. Seleccione el icono de rastreo y mueva el cursor sobre la imagen cargada. Coloque los nodos en los capilares en los lugares descritos en la Figura 2C; segmentos aparecerán automáticamente entre nodos adyacentes. Seguir la pista a lo largo de la totalidad de los capilares z-pila.
      Nota: será necesario colocar nodos en entre los puntos finales y los puntos de ramificación con el fin de rastrear los capilares thrOughout el z-stack.
    3. Para eliminar estos nodos, haga clic en el icono Intermedio Quitar.
      Nota: Esto puede crear segmentos de bucle erróneas que se deben quitar manualmente seleccionando el bucle usando el icono Seleccionar único y, a continuación, seleccionar el icono Eliminar Seleccionados. Si bucles siguen apareciendo en la misma zona durante el rastreo, es probable que los nodos se colocaron en diferentes capilares.
    4. Una vez que el trazado se completa, seleccione el icono Gráfico información para abrir una hoja de cálculo que contiene los parámetros vasculares extraídos automáticamente. El número de nodos y segmentos están disponibles en la pantalla de vista principal.

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Representative Results

La ventana cortical-cráneo delgada permite imágenes in vivo de dos fotones de capilares corticales (Figura 1). Un área adecuada para imagen muestra numerosos capilares, distintas (Figura 1A). En el mismo campo de visión, no hay ninguna pared celular arterial autofluorescencia, y pueden existir otras señales fluorescentes, tales como fluorescencia inducida por colágeno, segunda generación de armónicos 11 (Figura 1B).

Una vez que la preparación de la rebanada de cerebro es completa, un área de formación de imágenes de aproximadamente 1,5 mm de la línea media se encuentra (Figura 2A). A 100 micras z-pila produce una imagen tridimensional utilizado para el análisis en el software analítico Amira (Figura 2B). La red capilar es entonces trazado a mano mediante la colocación de los nodos al principio y al final de un capilar, o en cualquier lugar donde uno capilar branchos en otro (Figura 2C). Esto produce una imagen totalmente skeletonized partir de la cual se extraen automáticamente parámetros morfológicos (Figura 2D). El número de nodos capilares, segmentos, significa la longitud del segmento, la longitud total del segmento, y volumen total capilar puede ser extraído por medio de dos fotones ex vivo de formación de imágenes de rodajas de cerebro de ratón (Figura 2).

La Figura 3 muestra los resultados representativos obtenidos utilizando el método presentado en este documento. En este experimento, se utilizó un modelo de ratón transgénico de la neuroinflamación VIH 10. La producción del VIH virotoxin Tat fue inducida en ratones por Tat + comida doxiciclina-infundido durante 12 semanas. El grupo control consistió en camada tat- alimentados con la misma comida. No hubo diferencia estadísticamente significativa entre Tat + y ratones Tat en cualquiera de los parámetros medidos capilares. Por lo tanto, la exposición de 12 semanas de cerebro tisdemandar al VIH-1 Tat es insuficiente para causar la rarefacción de la microvasculatura cerebral. Por el contrario, nuestros datos previamente publicados muestran que más prolongado (20 semanas) crónica expresión SNC de los resultados de Tat en la rarefacción de la vasculatura cerebral 7. Por lo tanto, los datos que se muestran aquí (Figura 3) proporciona valiosa información nueva con respecto a la cinética de la remodelación vascular inducida por Tat en el SNC de ratones.

Figura 1
Figura 1. Adquisición de diámetro capilar cortical. (A) Después de una preparación ventana cortical fina-cráneo y la inyección intravenosa colorante fluorescente, microscopía de dos fotones se utilizó para la imagen vasculatura cerebral. En nuestros experimentos, hemos utilizado un dextrano conjugado con un emisor de tinte rojo rodamina que estaba emocionado a 780 nm, y la fluorescencia se visualizó a través de un filtro de emisión de paso de banda 607/36. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Generación de redes capilares skeletonized. Los ratones (A) se inyecta por vía intravenosa con un colorante fluorescente y se sacrificó. Una sección coronal de 2 mm cerebro fue tomada entre bregma 0 y -2 bregma, y ​​la imagen se realizó en el 0 bregma aproximadamente 1,5 mm de la línea media. LA se muestra la imagen representativa de la localización cortical elegido para la imagen (cuadro negro) de un ratón C57BL / 6. Esta región, la somcorteza atosensory, fue elegido porque ya hemos demostrado que la desregulación de la sangre cerebral puede ocurrir en este sitio en Tat + ratones 12. Representativo tres imágenes z-stack dimensionales de redes capilares (B). (C) Diagrama del método utilizado para trazar manualmente capilares durante la cuantificación buque. (D) Imagen representativa imagen z-stack esqueleto de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. La cuantificación de la arquitectura vascular cerebral en ratones frente a Tat ratones expuestos al candidato VIH virotoxin fo Tatr 12 semanas. Los ratones con una doxiciclina (DOX) inducible transgén VIH-1 Tat impulsado por la proteína fibrilar glial (GFAP), el promotor específico de astrocitos (VIH Tat-ratones Tg) se utilizaron para examinar el efecto de VIH-1 neuroinflamación inducida en estructura vascular cerebral, como se describe 7. Estos ratones (Tat +, n = 3) fueron expuestos a una enfermedad crónica (12 semanas) régimen de Tat inducción (es decir., 12 semanas de DOX). Tat ratones (n = 4) se utilizaron como controles emparejados por edad (estos ratones se corresponden con los compañeros de camada no transgénicos de los ratones + Tat, y por lo tanto no expresan el VIH-1 Tat). Al igual que los ratones Tat +, los ratones Tat también recibieron 12 semanas de exposición DOX. En los ratones expuestos a Tat durante 12 semanas (Tat +), frente a los que no expuestas a Tat (Tat), no hubo diferencia estadísticamente significativa en el número de nodos (A), el número de segmentos (B), significa la longitud del segmento (C), o la longitud total de capilares (D), el diámetro del capilar (porlos ratones Tat +, se analizaron 14 capilares en 6 zonas de formación de imágenes; para los ratones Tat, se analizaron 7 capilares en 4 áreas de imagen) (E), o volumen total capilar (F). Dado que los datos no se distribuyen normalmente (según lo determinado por la prueba de Shapiro-Wilk), se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon exacta para calcular la significación estadística (determinado en este caso como P <0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El método aquí descrito se puede aplicar para analizar estructuras microvasculares del cerebro en una amplia gama de modelos experimentales / ajustes. Para el éxito de este método, tres pasos críticos deben ser dominadas. En primer lugar, la ventana-cráneo delgada no debe dañar el cráneo o el cerebro subyacente. Es fácil de perforar el cráneo durante el adelgazamiento, o causar inducida por calor de fuga vascular. Esto puede interferir con la imagen como el colorante fluorescente se escapará en el plano de enfoque y oscurecer los capilares. Si el cráneo rompe con frecuencia durante la preparación de calavera delgada, lo más probable es causada por una excesiva presión a la baja. Sosteniendo el taladro MicroTorque lo más cerca posible a la rebaba permite un mayor control táctil que disminuirá la presión a la baja en el cráneo.

En segundo lugar, la cateterización arterial debe ocurrir tan pronto como sea posible una vez que la arteria se ha cortado. Si no se inserta el catéter de forma rápida puede causar la pérdida excesiva de sangre que compPromesa de la integridad fisiológica del ratón. Dificultad de insertar el catéter es generalmente debido a el tamaño relativamente grande del catéter en comparación con la arteria femoral. Puede ser necesario para estirar el catéter con el fin de reducir su diámetro. Además, las puntas de los fórceps # 5 se pueden utilizar para agarrar y agrandar la abertura realizada en la arteria para facilitar en la colocación del catéter.

En tercer lugar, la duración de los procedimientos quirúrgicos in vivo debe reducirse al mínimo de manera que la anestesia de uretano se puede administrar tan pronto como sea posible. La anestesia con isoflurano puede causar vasodilatación de los vasos sanguíneos cerebrales 13, sesgando así los datos de diámetro capilar.

Hay que reconocer que el software analítico Amira puede extraer automáticamente los radios de los vasos trazadas manualmente; Sin embargo, cuando se utiliza esta función para analizar imágenes z-stack de cerebros ex vivo, el valor es incorrecto. Esto es porque, after retirar el cerebro, los capilares cerebrales ya no están a presión, y puede llegar a ser morfológicamente distorsionada. La medición del diámetro capilar in vivo evita este problema porque los capilares están presurizados en condiciones normales, fisiológicas.

También debe tenerse en cuenta que este método no está exento de limitaciones. En primer lugar, se requiere una formación importante para dominar el vivo preparación imágenes in. Un investigador debe aprender a realizar de manera eficiente dos técnicas técnicamente difíciles (cráneo delgada ventana cortical y cateterismo arterial); un error en cualquiera de estas técnicas puede comprometer el experimento e invalidar los datos. En segundo lugar, el análisis de los ex vivo z-pilas es que requiere mucho tiempo. La esqueletización una imagen z-pila de puede tardar hasta 2,5 horas. Además, es aconsejable que este análisis ser completado por un investigador experimentado para asegurar la consistencia del proceso de esqueletización (que implica tr manual cuidadosaorrida de los vasos sanguíneos).

Una vez que se dominan todos los aspectos de este protocolo, los datos obtenidos proporcionan un profundo más y cuantificación fisiológicamente precisa de los parámetros vasculares en comparación con otros métodos utilizados tradicionalmente que muestran la densidad capilar como capilares por unidad de volumen, o capilares por campo de visión. La formación de imágenes in vivo permite técnica para el estudio de otros parámetros incluyendo, pero no limitado a, la velocidad de glóbulos rojos, la dilatación de las arteriolas, y rojo flujo de glóbulos 7,12, que también puede ser capaz de ser examinado en estudios longitudinales. Además, puede ser fácilmente adaptado y modificado para estudiar temas de investigación relacionados con la estructura microvascular cerebro. Estos estudios podrían incluir la cuantificación de los cambios patogénicos en la morfología capilar en otras enfermedades neurocognitivas, o medir los cambios relacionados con la edad en la densidad capilar. Por lo tanto, el método presentado en este documento es una herramienta versátil y de gran alcance para la cuantitatanálisis ive de la arquitectura vascular cerebral.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica Microscope Leica Inc. MZ8
High Intensity Illuminator Dolan-Jenner 180
Heating Pad Stryker  TP3E
T/PUMP Gaymar Industries, Inc. TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer Datex Ohmeda 447
Artificial Tear Gel Butler AHS 7312
Povidone-Iodine solution  Aplicare 52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Dumot #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
Ferric Chloride Solution Ricca Chemical Company 3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel Henkel 45404
Dental Cement Stoelting 51459
Microtoruqe II Handpiece Kit Pearson Dental R14-0002
005 Burr for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
Norland Blade (Dental Microblade) Salvin Dental 6900
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Group 2B Carcinogen
Braided Suture Ethicon 735G
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
 Arterial Catheter SAI Infusion Technologies MAC-01 The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. 
Blood Pressure Moniter World Precision Intruments SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable World Precision Intruments BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer  Siemens  248
40 μl Capillary Tube VWR 15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) Invitrogen D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope Olypmus FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser Spectra-Physics
ImageJ Software National Institutes of Health (NIH) Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software Visage Imaging 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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