HIV誘導神経炎症のマウスモデルでは二光子顕微鏡を用いた脳血管のアーキテクチャの定量化

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Nishimura, C., Polesskaya, O., Dewhurst, S., Silva, J. N. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (107), e53582, doi:10.3791/53582 (2016).

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Abstract

Introduction

ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)ウイルス感染の急性期の間に脳に侵入し、かつ生産両方ミクログリア及び脳の常在マクロファージ、それらの活性化につながる感染 - 及び両方宿主由来の炎症性メディエーターおよび可溶性HIV-1の放出をそのような(1,2に見直さ)Tatおよびgp120のようvirotoxins。その結果、慢性神経炎症状態は、HIV-1関連神経認知障害(手)3-5の病因に寄与していると考えられるCNS、に設立されてしまいます。

HIV-1のTatまたはマウスのCNS ​​内のインターロイキン(IL)-17Aの慢性的過剰発現は、微小血管希薄6,7をもたらすことが示されています。これには、慢性神経炎症が脳血管系への影響を介して手の病因に貢献するかもしれないという可能性を提起します。さらに、この問題を調べるために、我々は、脳血管STRUCを定量化する方法を開発しましたトゥーレス。

この論文では、セグメント長、総セグメントの長さを意味する毛細管の直径、及び薄い頭骨皮質窓を通して毛細管ネットワークのインビボイメージング用いて全毛細管容積平均、毛細管ノード、キャピラリーセグメントの数を定量化するための方法を記載して(前述の修飾されましたプロトコル)8,9、ならびに二光子顕微鏡を用いて脳切片 ex vivoイメージング。脳スライス内の毛細血管網 ex vivoイメージングは、三次元、完全な再構築を可能にしながら、in vivoでの薄頭蓋骨皮質ウィンドウは、脳環境の保全を可能にするので、この組み合わせアプローチは、脳血管のパラメータの全体的な定量を提供します毛細血管ネットワーク - 次に、市販のソフトウェアを用いて定量することができます。

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Protocol

動物資源上ロチェスター大学の大学の委員会は、本論文で実行されたすべての手順を承認しました。

1.手術前の準備(およびマウス)

  1. 必要なすべての機器と手術領域を準備します。事前に70%エタノールを使用して、手順の間に使用されるすべてのツールを滅菌します。必要に応じて、ツールを殺菌するためにガラスビーズ滅菌器やオートクレーブを使用します。
  2. イソフルラン気化器に接続されたイソフルラン誘導チャンバー内にマウスを置きます。 1リットル/分の速度で4%イソフルランレベルを設定します。
    注意:アストロサイト固有のグリア線維性タンパク質(GFAP)プロモーター(HIVのTat-Tgマウス)で駆動ドキシサイクリン(DOX)誘導性HIV-1 Tatの導入遺伝子とここで報告された実験では、マウスで10 HIVの影響を調べるために使用されました以前に7,10に記載されているように -1、脳血管構造の神経炎症を誘導しました。
  3. 静かにマウスを観察するために、誘導室にチップ' sの立ち直り反射。立ち直り反射が抑制された後、2%にイソフルランレベルを設定し、外科的なベンチでノーズコーンに誘導室からの空気流の方向を変えます。
  4. すぐに水注入された加熱パッドに誘導室からマウスを移動します。ノーズコーンを介してイソフルラン(1.5から2パーセント)を適用し続けます。呼吸数(RR)モニタリングによって評価個々のマウスの許容範囲に応じて麻酔を調整します。
    注:RRのうつ病は脳の血流および血管径の評価を変更するガスの生理学的パラメータを乱すことができます。毎分55〜65呼吸の間RRを維持しようとしました。心拍数(HR)は、麻酔の深さを評価に使用することができます。血管径の生理学的変化を防止するために、毎分300〜450拍の間で人事を保ちます。一般的に、麻酔を与えられたマウスでは1リットル/分で1.5から2.0パーセントのイソフルランの間で十分です。
  5. さらに、麻酔の深さを確認するためにつま先のピンチを実行します。マウスは、COMMが応答しない場合外科手術レンス。

薄頭蓋骨頭蓋窓の調製

  1. マウスの目に人工涙ゲルを適用します。完全にハサミや電気かみそりを使用して、マウスの頭皮から髪を削除します。
  2. ポビドンヨード溶液を適用することによって頭皮の殺菌。乾燥させます。その後、光学顕微鏡下で、完全にマーキング頭頂骨、尾正面の骨、およびブレグマを露出させ、マウスの頭皮から皮膚を除去。
  3. 簡単に除去するための膜を乾燥させるために頭蓋骨に10%塩化第二鉄溶液の少量を適用します。静かに頭蓋骨をこすることによって#45分の5鉗子で乾燥した膜を除去します。
  4. ヘッドプレートウィンドウの周りに接着剤の薄層を適用します。静かにウィンドウの中央に関心領域を保ち、マウスの頭蓋骨に対してヘッドプレートを押してください。接着剤を重合するヘッドプレートに歯科用セメントの低下を適用します。
  5. 薄く塗りますヘッドプレートウィンドウの端に沿って接着剤の生理食塩水を保持するリザーバを作成することができます。接着剤が乾燥した後、マウスのヘッドプレートハーネスにヘッドプレートをネジ止めします。
    注:この手順で使用したマウスのヘッドプレートハーネスは、金属ベースと二つの金属柱を持つ構造体です。各列の1春と1蝶ナットがあります。ヘッドプレートは、バネの上に配置され、ヘッドが水平であり、移動しなくなるまで蝶ナットが締め付けられます。
  6. 6,000 rpmで設定microtorqueドリルに取り付けられたドリルビットを使用してヘッドプレートウィンドウから任意の接着剤を除去します。血管への構造的な損傷を与えることができ、マウスの頭蓋の過熱を防止するために、すべての10〜15秒を停止します。
    1. 新しいドリルビットを使用して、正中線(ヘッドプレートウィンドウの直径の三分の一)から横方向にmicrotorqueドリル1.5ミリメートルを配置します。 4,000 rpmで、この場所の周りに薄い頭蓋骨に開始します。直接的な下向きの圧力で頭蓋骨をそっとドリルを移動します。
    2. drilを中止マウスの頭蓋の過熱を防ぐために、玲ごとに10〜15秒。この時間の間に、圧縮空気の缶を使用して、蓄積された頭蓋骨のほこりを取り除きます。
    3. 5-10秒間頭蓋骨を冷却するためにRT生理食塩水の滴を使用してください。静かに頭蓋骨間伐を継続するために、軟組織とすべての液体を除去します。
  7. 頭蓋骨の最終薄化のために、ヘッドプレートリザーバ内に生理食塩水の小さなボリュームを置き、軽く小さな血管がはっきりと見えるようになるまで関心のある領域にわたって歯科マイクロブレードを掃引。

生理的パラメータの3モニタリング

  1. 頭蓋骨が完全に薄くされた後、ホルダーからマウスをデタッチし、その背中の上に置きます。ゆっくりはっきりと内側の太ももを露出するために、両方の後ろ足を下にテープで固定します。
  2. ハサミや電気シェーバーで両方の内側の太ももの上に髪を削除します。ポビドンヨードで太ももを覆うことにより、手術部位を消毒します。
  3. 大腿静脈上記内側右腿の皮膚をつまんで#5ピンセットを使用して動脈。そっと上向きに皮膚を引っ張って皮膚をカットし、削除するためにハサミを使用しています。
    注:左大腿は、外科的合併症(血管奇形、破裂した血管)のイベントに予約されています。
  4. 手術部位に0.9%生理食塩水の約3〜5滴を適用します。これは、血管のより大きな倍率だけでなく、血管のしっとりサイトを保ち、乾燥防止することができます。ぶっきらぼう2#45分の5ピンセットを用いて大腿神経血管束に解剖することにより、動脈から大腿静脈を分離します。
  5. 約1cm離れて大腿動脈の下手術用縫合糸の2、3センチメートルピースを置きます。カテーテル挿入時に過度の血液の損失を防ぐのに役立ちます血管止血帯を作成するために、上部の縫合糸を時計回りに回します。
  6. 春のはさみを使用して大腿動脈に小さな切開を行います。カテーテルが動脈内に確実になるまで切開し、事前を通じて動脈にカテーテルを配置します。
  7. 血液凝固を防ぐために、カテーテルを介してヘパリンを10μl(100 IU / ml)を注入します。次に、外科的に単純な中断パターンで4-0縫合糸と一緒に皮膚を縫合することにより、右腿を閉じます。
  8. 腹腔内に右下腹部にウレタンを50μl(1.2ミリグラム/ g)を注入します。五分後に腹腔内ウレタン100μlの合計左下腹部に別の50μlの注入を繰り返します。同時に、麻酔の深さのために、マウスを再確認しながら、ゆっくりと約0.25%にイソフルランレベルを減少させます。
    注:それは腸を穿孔しないように後部腹壁に沿って腹腔内表面的な針を保管してください。これは、腹部直筋ムーをつまんで達成することができます離れて内臓から、その後注入scles。
  9. 毛細管を使用して、カテーテルから動脈血の40μlのサンプルを収集します。生理食塩水で満たされた、四方コックとヘパリンを充填した注射器を装着し、血圧トランスデューサにカテーテルを取り付けます。
  10. カテーテルの意図しない取り外しを防止するための外科用装置に血圧トランスデューサをテープ。平均動脈圧の監視を開始します。
  11. 血液ガス分析装置の入口ポートへの血液充填したキャピラリーチューブを挿入します。すべての血液が抽出されると、入口から毛細管を削除します。 O 2、CO 2、血液ガスレベルは、血液ガス分析装置から印刷された紙の上に表示されます。

蛍光色素の4注入

  1. #5ピンセットを用いて、内側左太ももの皮膚をつまんで。そっと上向きに皮膚を引っ張って皮膚をカットし、削除するためにハサミを使用しています。デキストラン共役赤色発光ローダミン色素を準備(70キロダルトン)(生理食塩水に溶解した10mg / kgの)。
  2. 付属の30 G針で1mlシリンジをvein.Using大腿骨を見つけ、シリンジの130μlのラインへのイメージングのための適切な蛍光色素の先に調製した溶液を描画します。注射器に完全に染料を描画し、しっかりとシリンジ壁をフリックして、すべての気泡を除去します。
    1. ベンド硬質表面ベベル面を上に押し付けることで約30度の角度で30 G針。染料で針を記入し、余分な液体を捨て、100μlのサンプルを残します。
  3. ゆっくりと大腿静脈に色素の100μlのサンプルを注入します。針を除去した後、任意の出血を止めるために注射部位に安定し、静かに圧力をかけます。色素が5分間循環させます。
    注意:代替的に、右大腿静脈に別の手術部位の創出を通じてさらなる血液損失を防止するために、蛍光色素の注入のために代わりに使用することができます。加えて、もし動物は、これはあまりにも多くのヘパリンは、カテーテルをフラッシュするために与えられたことを示している可能性があり、手術部位から制御不能出血しています。そこには凝固が10〜15分以内でないとマウスがまだ出血している場合は、新しいマウスを用いた実験を再開することを検討してください。
  4. その胃の上にマウスを反転し、マウスのヘッドプレートハーネスにそれを置き、慎重に、その後、4-0縫合糸と一緒に皮膚を縫合することにより、左太ももを閉じます。

生体内二光子イメージング5.

  1. 連続麻酔レベルを維持するために確認して、二光子顕微鏡に手術装置を移動します。ヘッドプレートのリザーバに0.9%生理食塩水の少量を置き、生理食塩水と接触するように、顕微鏡対物レンズを下げます。明視野対物レンズを用いて、関心領域の位置を確認します
  2. 蛍光色素のために適切な波長の二光子レーザー励起を設定します。 25X Oを用いた2光子イメージングを開始しますbjective。
    これらの実験で、我々は波長780nmで励起した赤色発光ローダミン色素に結合させたデキストランを使用することに注意してください。色素からの蛍光を検出するための発光フィルタをバンドパス、および20分の480バンドパス放射フィルタは、動脈自己蛍光を検出するために使用した36分の607
  3. ビュー画面上の毛細血管床を見つけて、光学ズームを2光子イメージングソフトウェアを使用して、毛細血管の2獲得画像を使用して、このエリアを拡大。
  4. イメージングが完了した後、断頭続いて頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。

6. エクスビボ二光子イメージング

  1. 極細ハサミを使用して、マウスの正面骨に壁間の骨から頭皮に切開を行います。ポインタ指と親指で頭蓋骨の側面に皮膚を保護します。
  2. 内側頭頂間骨の下極細ハサミを置き、矢状縫合に沿って頭蓋骨をカット。ブレグマをマーキングした後、約3mmの頭蓋骨を切断停止します。
    注:脳を切断しないようにする頭蓋骨を切断する際に上向きの圧力を適用します。
  3. #5鉗子を使用して、脳から頭蓋骨を分離し、慎重に脳の表面から髄膜を除去します。残りの髄膜は、誤って脳を切ることができます。細心の注意は、これを避けるために注意すべきです。脳が頭蓋骨から外れるまで静かに前方にゆっくりと進行する脳の下の#5鉗子をスライドさせます。
    注意:下向きの圧力が脳を刺さないようにするために使用されるべきであること。
  4. マウスのための特定の脳切片ツールで脳を置きます。脳の上に人工脳脊髄液の液滴を適用することにより、脳を洗ってください。
  5. ブレグマにブレグマ0から脳の2ミリメートル冠状断面を取り外し-2。上を向い0ブレグマと人工脳脊髄液を含む凹状のスライドガラス上に冠状断面(断面の最も頭側の部分)を配置します。静かに脳SLをカバーガラスカバースリップと氷。
    注:これは、血管アーキテクチャを変形させることのように一度脳部に配置されたガラスを押す避けてください。
  6. 顕微鏡ステージにスライドを移し、カバースリップ上の0.9%生理食塩水を少量入れます。それは生理食塩水に接触するまで、顕微鏡の対物レンズを下げます。明視野対物レンズを用いて脳の正中線の位置を確認します。
  7. 二光子イメージングを開始し、再び25倍対物レンズを用いて正中線を探します。冠状断面の皮質表面に縦亀裂を探して、これを達成します。正中線の撮影画面の右端を置き、横方向に3完全なフレーム(正中線から約1.5 mm)をビューア画面を上に移動。
    これらの実験では、撮像パラメータは、ステップ5.2でノートに記載されたものと同一であったことに注意してください。
  8. 毛細血管がビュー画面上でかろうじて見えるれる深さの位置を確認します。焦点さらに20の平面を下げますμmでは、zスタックの先頭を決定します。
  9. 1μmの画像の厚さを設定します。 100ミクロンのビュー画面を下げて、各画素の1%未満が過飽和となるように全体にレーザーパワーを調整します。
    注意:zスタック画像は100の連続した​​500x500x1ミクロン一連の画像からコンパイルされます。より正確な後処理の計算がされるzスタック大きいです。一般的には、100μm以上のzスタックを収集しようとします。
  10. 隣接するX-Yのアイコンが続くXYリピートアイコンを押します。 zスタックが完了すると、 シリーズ完了アイコンを押して、ファイルを保存します。

7.データ処理

  1. ImageJソフトウェアにおける in vivo毛細血管画像を開きます。手動で二光子ソフトウェアから得られた値に基づいて距離比のピクセルを設定します。
    1. [ツール]メニューから*ストレート*アイコンを選択します。親しい同僚に1毛細血管壁から伸びる線を引きサイトの毛細血管壁、とのImageJで提供さ長さを記録します。
      それは明らかに毛細血管壁のエッジを可視化するために、画像にズームインする必要があるかもしれないことに注意してください。
    2. 繰り返しキャピラリーに沿った異なる位置でのステップ7.1.1と同様に、画像内の複数のキャピラリ。
  2. そのようなアミラなどの分析ソフトウェアにzスタックファイルを開きます。サブアプリケーションツールバーからフィラメントエディタのアイコンを選択
    1. 約20に、視聴者の厚さを設定zスタックの上部または下部のいずれかにビューアを移動します。
    2. トレースアイコンを選択し、ロードされた画像の上にカーソルを移動します。 図2Cに記載された場所での毛細血管上のノードを配置します。セグメントは自動的に隣接するノード間で表示されます。全体zスタック全体に毛細血管をトレースします。
      注:これは毛細血管を追跡するために、エンドポイントと分岐点との間のノードを配置する必要があるTHRzスタックoughout。
    3. これらのノードを削除するには、 中間のアイコンを削除]をクリックします
      注:これは、 選択1つのアイコンを使用してループを選択することにより、手動で削除する必要があり、誤ったループセグメントを作成し、[削除選択アイコンを選択することができます。ループがトレース中に同じ領域に表示し続ける場合は、ノードが別の毛細血管に配置した可能性があります。
    4. トレースが完了すると、自動的に抽出された血管のパラメータを含むスプレッドシートを開くために、グラフ情報]アイコンを選択します。ノードとセグメントの数は、メインビュー画面で利用可能です。

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Representative Results

薄頭蓋骨皮質ウィンドウは、皮質毛細血管 in vivo二光子イメージング( 図1)を可能にします。画像に適した領域は、多数の、明確な毛細血管( 図1A)を示しています 。同じ視野において、いかなる動脈細胞壁の自己蛍光が存在しない、第二高調波11( 図1B)によって誘導されるコラーゲンの蛍光などの他の蛍光信号があってもよいです。

脳切片の準備が完了すると、約1.5ミリメートル正中線からが配置されている撮影領域( 図2A)。100μmのzスタックは、アミラ解析ソフト( 図2B)での分析のために使用される三次元画像を生成します。毛細血管網は、手動で開始し、毛細血管の終わり、または任意の場所1キャピラリーbにノードを配置することによって追跡されます他に牧場( 図2C)。これは、形態学的パラメータが自動的に抽出される、完全に白骨画像( 図2D)を生成します。毛細管ノード、セグメントの数は、セグメント長、総セグメント長、およびマウス脳切片の二光子ex vivoでイメージングを使用して抽出することができる総毛細管容積( 図2)を意味します。

図3に、本 ​​論文で提示された方法を用いて得られた代表的な結果を示しています。この実験では、HIVの神経炎症のトランスジェニックマウスモデルは、10を使用しました。タットvirotoxin HIVの産生が12週間のドキシサイクリン注入によって食品のTat +マウスにおいて誘導しました。対照群は、同じ餌を与えTAT-同腹子から成りました。測定されたキャピラリーパラメータのいずれかでタット+とTAT-マウスとの間に統計学的有意差は認められませんでした。このように、脳の12週間の暴露は、TISHIV-1のTatに訴える脳微小血管系の希薄化を引き起こすには不十分です。これとは対照的に、私たちの以前に発行されたデータは、脳血管系7の希薄でのTat結果の慢性CNS式(20週)以上に延長することを示しています。このように、( 図3)ここに示したデータは、マウスのCNS ​​内タット誘発性血管リモデリングの動態に関して貴重な新しい情報を提供します。

図1
皮質毛細管直径の図1の取得(A)シン頭蓋骨皮質ウィンドウ製剤および静脈内蛍光色素の注入に続いては、二光子顕微鏡映像脳血管系を使用しました。我々の実験では、780 nmで励起し、赤色発光ローダミン色素にコンジュゲートしたデキストランを使用し、蛍光を発光するバンドパスフィルタ36分の607を介して可視化しました。 11を介して表示されるように他の蛍光シグナルを誘発する可能性がある。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
スケルトン毛細血管網の図2世代。(A)マウスに静脈内に蛍光色素を注射し、犠牲にしました。脳2mmの冠状切片はブレグマ0とブレグマ-2の間に採取し、イメージングは​​正中線から0ブレグマ約1.5mmで実施しました。 A C57BL / 6マウスからの撮像(ブラックボックス)のために選択された皮質の場所の代表画像が表示されます。この領域、ソム我々は以前に脳の血の調節不全は、タット+マウス12で、このサイトで発生する可能性があることを示しているため、atosensory皮質は、選ばれた。毛細血管網の(B)表象3次元zスタック画像は手動で追跡するために使用される方法の(C)は図血管の定量化の間に毛細血管。(D)スケルトンzスタック画像の代表画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
タットFO virotoxin候補HIVに曝露したマウス対TAT-マウスの脳血管構造の図3.定量R 12週間。アストロサイト固有のグリア線維性タンパク質(GFAP)プロモーター(HIVのTat-Tgマウス)で駆動ドキシサイクリン(DOX)誘導性HIV-1 Tatの導入遺伝子を有するマウスを上のHIV-1誘発性神経炎症の影響を調べるために使用されました7に記載されるように、脳血管の構造。これらのマウス(TAT +、N = 3)のTat誘導の慢性(12週間)のレジメンに曝露した(DOX すなわち 、12週間)。 TAT-マウス(n = 4)は、(これらのマウスはタット+マウスの非トランスジェニック同腹仔に対応し、従ってHIV-1のTatを発現しない)、年齢をマッチさせた対照として使用しました。タット+マウスと同様に、TAT-マウスもDOX曝露の12週を受けました。 12週間(TAT +)のためのTatに暴露したマウスでは、タット(TAT-)にさらされていないものに対して、ノード(A)の数の統計的に有意な差はなかった、セグメント数(B)は 、セグメント長を意味します(C)、または総キャピラリー長さ(D)、キャピラリー径(用タット+マウス、我々は6イメージングの分野で14毛細血管を分析しました。 TAT-マウスのために、我々は7~4撮像領域における毛細血管)(E)、または総毛細管容積(F)を分析しました。 (シャピロ・ウィルク検定によって決定される)データが正規分布していなかったので、正確なウィルコクソンの順位和検定が(P <0.05として、この場合に決定される)統計的有意性を計算するために使用された。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図は 、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここに記載された方法は、実験モデル/設定の広範囲の脳微小血管構造を分析するために適用することができます。この方法の成功のために、3つの重要なステップを習得する必要があります。まず、薄頭蓋骨窓は、頭蓋骨または基礎脳に損傷を与えてはなりません。それは間伐時に頭蓋骨に穴を開け、または熱誘導性の血管漏出を引き起こすことは容易です。蛍光色素は、焦点面に漏出し、毛細血管を不明瞭になりますので、これは画像に干渉することがあります。頭蓋骨が頻繁に薄い頭蓋骨の準備中に壊れた場合は、最も可能性の高い大きすぎる下向きの圧力によって引き起こされます。バリにできるだけ近いmicrotorqueドリルを保持することは頭蓋骨に下向きの圧力を低下させる大きな触覚制御を可能にします。

第二に、動脈カテーテル法は、可能な限り迅速に動脈が切断された後に発生する必要があります。すぐにカテーテルを挿入しないと、コンプます過度の血液損失を引き起こす可能性がありますマウスの生理的な整合性をromise。カテーテルを挿入する難しさは、大腿動脈に比べて、通常、カテーテルの比較的大きなサイズに起因しています。それは、その直径を減少させるためにカテーテルを延伸する必要があるかもしれません。さらに、#5鉗子の先端がカテーテルの配置に容易にするために、動脈内に作られた開口部をつかみ、拡大するために使用することができます。

ウレタン麻酔をできるだけ早く投与することができるように、第三の、 インビボでの外科的処置の持続時間は最小化されるべきです。イソフルラン麻酔は、このように、キャピラリー径データをゆがめる、脳血管13の血管拡張を引き起こす可能性があります。

これは、アミラ分析ソフトウェアが自動的に手動でトレース血管の半径を抽出できることを認識すべきです。 ex vivoで脳からのzスタック画像を分析するためにこの機能を使用する場合が、その値は不正確です。これは、AFであります脳の除去ターは、脳の毛細血管はもはや加圧されず、形態学的に歪むことがあります。毛細血管は、通常、生理学的条件下で加圧されるため、 インビボでのキャピラリー径測定は、この問題を回避します。

また、この方法には限界がないわけではないことに留意しなければなりません。まず、重要な訓練はin vivoイメージングの準備を習得する必要があります。研究者は、効率的に2技術的に困難な技術(薄い頭蓋骨皮質ウィンドウおよび動脈カテーテル法)を実行することを学ぶ必要があります。いずれかの手法の誤差は実験を侵害し、データを無効化することができます。第二に、ex vivoでのzスタックの分析では、時間のかかるです。 1 zスタック画像の細線は2​​.5時間かかります。また、スケルトン・プロセスの一貫性を確保するために、この分析は、経験豊富な研究者によって完成されていることが賢明である(慎重マニュアルTRが関与します血管のacing)。

一度このプロトコルのすべての側面は、得られたデータは、視野当たりの単位体積当たりの毛細血管や毛細血管などの毛細血管密度を示し、他の伝統的に使用する方法と比較してより深いと血管パラメータの生理学的に正確な定量を提供し、習得されています。 インビボイメージング技術は、以下を含む他のパラメータの調査を可能にするだけでなく、長期的な研究で検討することが可能であり得る、赤血球速度、細動脈の拡張、および赤血球フラックス7,12、これらに限定されません。また、容易に適合され、脳の微小血管構造に関する研究課題を研究するために改変することができます。このような研究は、他の神経認知疾患における毛細血管形態の病原性の変化を定量する、または毛細血管密度の加齢変化を測定含めることができます。そこで、本稿で提示した方法は、quantitatのための汎用性と強力なツールです脳血管アーキテクチャのアイブ分析。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica Microscope Leica Inc. MZ8
High Intensity Illuminator Dolan-Jenner 180
Heating Pad Stryker  TP3E
T/PUMP Gaymar Industries, Inc. TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer Datex Ohmeda 447
Artificial Tear Gel Butler AHS 7312
Povidone-Iodine solution  Aplicare 52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Dumot #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
Ferric Chloride Solution Ricca Chemical Company 3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel Henkel 45404
Dental Cement Stoelting 51459
Microtoruqe II Handpiece Kit Pearson Dental R14-0002
005 Burr for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
Norland Blade (Dental Microblade) Salvin Dental 6900
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Group 2B Carcinogen
Braided Suture Ethicon 735G
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
 Arterial Catheter SAI Infusion Technologies MAC-01 The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. 
Blood Pressure Moniter World Precision Intruments SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable World Precision Intruments BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer  Siemens  248
40 μl Capillary Tube VWR 15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) Invitrogen D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope Olypmus FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser Spectra-Physics
ImageJ Software National Institutes of Health (NIH) Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software Visage Imaging 

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References

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