माइक्रोवेव विकिरण का उपयोग संभावित एजेंसी चिकित्सा विज्ञान के रूप में एक रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड पुस्तकालय के विकास

1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine
Chemistry

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Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).

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Abstract

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) लगभग सभी जैविक प्रक्रियाओं में अच्छी तरह से शामिल हैं और कई मानव रोगों से जुड़ी हैं। इसलिए, बुनियादी अनुसंधान के क्षेत्र में और दवा उद्योग में पीपीआई को लक्षित करने के लिए एक प्रमुख प्रयास है। प्रोटीन, प्रोटीन इंटरफेस फ्लैट, आमतौर पर बड़े हैं, और अक्सर ऐसी साइटों को लक्षित है कि छोटे अणुओं की खोज उलझी जेब की कमी है। एंटीबॉडी का उपयोग वैकल्पिक लक्ष्य-निर्धारण दृष्टिकोण गरीब मौखिक जैव उपलब्धता, कम सेल पारगम्यता, और उत्पादन अक्षमता के कारण सीमाएं हैं।

पल्स पोलियो टीकाकरण इंटरफेस को लक्षित करने के पेप्टाइड्स का प्रयोग कई फायदे हैं। पेप्टाइड्स उच्च गठनात्मक लचीलेपन में वृद्धि हुई, चयनात्मकता है, और आम तौर पर सस्ती कर रहे हैं। हालांकि, पेप्टाइड्स गरीब स्थिरता और अक्षमता को पार कोशिका झिल्ली सहित अपनी सीमाएं हैं। ऐसी सीमाओं को पार करने के लिए, पेप्टाइड चक्रगति किया जा सकता है। चक्रगति पेप्टाइड चयनात्मकता सुधार करने के लिए प्रदर्शन किया गया हैचयापचय स्थिरता, और जैव उपलब्धता। हालांकि, एक चक्रीय पेप्टाइड की बायोएक्टिव रचना की भविष्यवाणी तुच्छ नहीं है। इस चुनौती पर काबू पाने के लिए, एक आकर्षक दृष्टिकोण यह सब रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड्स ही प्राथमिक अनुक्रम है, लेकिन इस तरह की अंगूठी के आकार और स्थिति के रूप में उनकी रचना को प्रभावित करने वाले मापदंडों में मतभेद है जिसमें स्क्रीन करने के लिए एक केंद्रित पुस्तकालय स्क्रीन करने के लिए।

हम विशिष्ट परजीवी पीपीआई को निशाना रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड्स के एक पुस्तकालय synthesizing के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। एक तर्कसंगत डिजाइन दृष्टिकोण का प्रयोग, हम सक्रिय सी-काइनेज (कमी) के लिए पाड़ प्रोटीन एल eishmania रिसेप्टर से निकाली गई पेप्टाइड्स विकसित की है। हम नहीं बल्कि स्तनधारी मेजबान homolog में, परजीवी में संरक्षित कर रहे हैं कि अभाव में दृश्यों, परजीवी 'व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण हैं कि प्रोटीन के लिए बातचीत साइटों का प्रतिनिधित्व कर सकते धारणा है कि। चक्रीय पेप्टाइड्स प्रतिक्रिया समय को कम करने और बढ़ाने के लिए माइक्रोवेव विकिरण का उपयोग कर संश्लेषित किया गयादक्षता। अलग अंगूठी के आकार के साथ रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड्स के एक पुस्तकालय का विकास सबसे जैविक सक्रिय रचना के लिए एक व्यवस्थित स्क्रीन की सुविधा। इस विधि चक्रीय पेप्टाइड्स के संश्लेषण के लिए एक, सामान्य तेज, और सुगम बनाता है।

Introduction

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) इंट्रासेल्युलर संकेत पारगमन से कोशिका मृत्यु के लिए 1, सबसे जैविक प्रक्रियाओं में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं। इसलिए, पीपीआई को निशाना बुनियादी अनुसंधान और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए मौलिक महत्व का है। पीपीआई विशिष्ट और स्थिर एंटीबॉडी द्वारा विनियमित है, लेकिन एंटीबॉडी के निर्माण और गरीब जैव उपलब्धता है करने के लिए महंगा है और मुश्किल होते जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पीपीआई छोटे अणुओं द्वारा निशाना बनाया जा सकता है। छोटे अणुओं एंटीबॉडी की तुलना के संश्लेषण के लिए आसान है और सस्ती कर रहे हैं; हालांकि, वे अपेक्षाकृत कम लचीले होते हैं और बड़े प्रोटीन, प्रोटीन इंटरफेस 2,3 करने के लिए की तुलना में छोटे cavities के लिए बेहतर फिट बैठते हैं। विभिन्न अध्ययनों सरल और सस्ता एंटीबॉडी की तुलना में और छोटे अणुओं की तुलना में अधिक लचीला कर रहे हैं, जो पेप्टाइड्स, प्रोटीन इंटरफेस बाँध और पीपीआई 4,5 नियंत्रित कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया है। वैश्विक चिकित्सीय पेप्टाइड बाजार 2013 में पंद्रह अरब डॉलर के आसपास आंकी गई और 10.5% एन्नुआ बढ़ रहा हैlly 6। इसके अलावा, 50 से अधिक विपणन पेप्टाइड्स, नैदानिक ​​परीक्षण के विभिन्न चरणों में करीब 270 पेप्टाइड्स, और उन्नत प्रीक्लीनिकल चरणों 7 में लगभग 400 पेप्टाइड्स देखते हैं। कई पेप्टाइड्स दवाओं के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है, पेप्टाइड्स अभी भी गरीब जैव उपलब्धता और स्थिरता, क्रासिंग कोशिका झिल्ली में अक्षमता, और गठनात्मक लचीलापन 8,9 सहित उनके बड़े पैमाने पर आवेदन की सीमा है कि कई चुनौतियां खड़ी। इन कमियों बढ़ना करने के लिए एक विकल्प ऐसे स्थानीय (डी अमीनो एसिड और एन alkylation) और ग्लोबल (चक्रगति) की कमी 8,10-12 के रूप में विभिन्न संशोधनों के लागू करने के लिए है। इन संशोधनों के भी स्वाभाविक रूप से पाए जाते हैं। उदाहरण के लिए, cyclosporin ए, एक प्रतिरक्षादमनकारी चक्रीय प्राकृतिक पेप्टाइड, एक भी डी-अमीनो एसिड होता है और एन alkylation संशोधनों 13,14 से होकर गुजरती है।

प्राकृतिक एमिनो एसिड का संशोधन अक्सर पेप्टाइड को प्रभावित करता है, इस तरह के डी और एन alkylation के रूप में स्थानीय बाधाओं, प्रेरित करने के लिए9 की जैविक गतिविधि। हालांकि, ब्याज के अनुक्रम में ही रहते सकते हैं, जिसमें चक्रगति, जैविक गतिविधि को बनाए रखने के लिए और अधिक होने की संभावना है। चक्रगति विभिन्न रचना के बीच संतुलन को कम करने से पेप्टाइड गठनात्मक अंतरिक्ष प्रतिबंधित करने के लिए एक बेहद आकर्षक तरीका है। यह आमतौर पर केवल एक ही समारोह में मध्यस्थता कि सक्रिय रचना करने के लिए पेप्टाइड सीमित द्वारा जैविक गतिविधि और चयनात्मकता बढ़ जाती है। चक्रगति भी कम अपमानजनक एंजाइमों द्वारा मान्यता प्राप्त है कि एक रचना में पेप्टाइड रखकर पेप्टाइड स्थिरता में सुधार। दरअसल, चक्रीय पेप्टाइड्स उनके रैखिक मुकाबले 15-17 की तुलना में चयापचय स्थिरता, जैव उपलब्धता, और चयनात्मकता सुधार हुआ है दिखाया गया।

हालांकि, चक्रगति कुछ मामलों में प्रतिबंध एक बायोएक्टिव रचना को प्राप्त करने से पेप्टाइड्स रोक सकता है के बाद से एक दोधारी तलवार हो सकता है। इस बाधा को दूर करने के लिए, एक केंद्रित पुस्तकालय जिसमें सभी पेप्टाइड्स ही प्राथमिक sequenc हैई और फलस्वरूप निरंतर pharmacophores संश्लेषित किया जा सकता है। पुस्तकालय में पेप्टाइड्स क्रम में बाद में सबसे बायोएक्टिव रचना 9,18 लिए स्क्रीन के लिए, इस तरह की अंगूठी के आकार और स्थिति के रूप में उनकी संरचना को प्रभावित करने वाले मापदंडों में मतभेद है।

पेप्टाइड्स समाधान में और अब अधिक प्रचलित पेप्टाइड संश्लेषण दृष्टिकोण है और आगे चर्चा की जाएगी जो एक ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण (SPPS) दृष्टिकोण, दोनों के द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है। SPPS रासायनिक परिवर्तनों सिंथेटिक यौगिकों 19 की एक विस्तृत श्रृंखला तैयार करने के लिए एक लिंकर के माध्यम से एक ठोस समर्थन पर प्रदर्शन कर रहे हैं जिसके द्वारा एक प्रक्रिया है। SPPS एन टर्मिनस के लिए, एक ठोस समर्थन से जुड़ा हुआ है जो सी टर्मिनस से एक stepwise तरीके से एमिनो एसिड की लगातार युग्मन द्वारा कोडांतरण पेप्टाइड्स सक्षम बनाता है। एन-α अमीनो एसिड पक्ष चेन सेंट प्रति एक एमिनो एसिड के अलावा यह सुनिश्चित करने के लिए पेप्टाइड बढ़ाव के दौरान इस्तेमाल प्रतिक्रिया की स्थिति में स्थिर रहे हैं कि समूहों की रक्षा के साथ नकाबपोश किया जाना चाहिएईपी। अंतिम चरण में, पेप्टाइड राल से जारी है और समूहों की रक्षा के पक्ष श्रृंखला समन्वित रूप से हटा रहे हैं। पेप्टाइड संश्लेषित किया जा रहा है, वहीं सभी घुलनशील अभिकर्मकों निस्पंदन द्वारा पेप्टाइड ठोस समर्थन मैट्रिक्स से हटा दिया है और प्रत्येक युग्मन चरण के अंत में दूर धोया जा सकता है। एक ऐसी प्रणाली के साथ, उच्च एकाग्रता में अभिकर्मकों की एक बड़ी अतिरिक्त पूरा करने के लिए युग्मन प्रतिक्रियाओं ड्राइव कर सकते हैं और सभी संश्लेषण कदम सामग्री 20 में से किसी के हस्तांतरण के बिना ही इस पोत में प्रदर्शन किया जा सकता है।

SPPS इस तरह की प्रतिक्रिया 21 की निगरानी अधूरा प्रतिक्रियाओं, ओर प्रतिक्रियाओं, अशुद्ध अभिकर्मकों, साथ ही कठिनाइयों के उत्पादन के रूप में कुछ सीमाएं हैं हालांकि, SPPS का लाभ यह पेप्टाइड संश्लेषण के लिए "सोने के मानक 'बना दिया है। ये लाभ में जिसके परिणामस्वरूप गैर प्राकृतिक एमिनो एसिड, स्वचालन, आसान शुद्धि को शामिल करने का विकल्प, कम से कम शारीरिक हानि, और अतिरिक्त अभिकर्मकों का उपयोग करते हैं, में शामिलउच्च पैदावार। SPPS मुश्किल दृश्यों 21,22, फ्लोरोसेंट संशोधनों 23, और पेप्टाइड पुस्तकालयों 24,25 के संश्लेषण में अत्यंत उपयोगी हो दिखाया गया है। SPPS भी इस तरह के oligonucleotides 26,27, oligosaccharides 28,29, और पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड 30,31 के रूप में अन्य पाली श्रृंखला विधानसभाओं के लिए बहुत उपयोगी है। दिलचस्प बात यह है कि कुछ मामलों में, SPPS पारंपरिक रूप से समाधान 32,33 में बना रहे हैं कि छोटे अणुओं synthesizing के लिए फायदेमंद होना दिखाया गया था। SPPS उद्योग 36-38 में अनुसंधान और शिक्षण 34,35 के लिए छोटे पैमाने के रूप में अच्छी तरह के रूप में बड़े पैमाने में दोनों का इस्तेमाल किया जाता है।

मुख्य रूप से पेप्टाइड्स के संश्लेषण के लिए SPPS पद्धति में उपयोग किया जाता है कि दो संश्लेषण रणनीतियों butyloxycarbonyl (बीओसी) और 9 fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) कर रहे हैं। SPPS के लिए शुरू की मूल रणनीति आर से पेप्टाइड समूहों की रक्षा के पक्ष श्रृंखला हटाने और फोड़ना मजबूत एसिड की स्थिति की आवश्यकता है जो बीओसी, थाEsin। Fmoc आधारित पेप्टाइड संश्लेषण, हालांकि, मध्यम आधार शर्तों का इस्तेमाल करता है और एसिड अस्थिर Boc प्रोटोकॉल 39 को एक मामूली विकल्प है। Fmoc रणनीति एसिड की शर्तों के तहत राल से पेप्टाइड cleaving जबकि संश्लेषण के अंतिम चरण में निकाल दिया जाता है कि ओर्थोगोनल टी butyl (TBU) पक्ष श्रृंखला संरक्षण का इस्तेमाल करता है।

ठोस समर्थन पर पेप्टाइड संश्लेषण के लिए सामान्य सिद्धांत चित्र 1 में प्रस्तुत किया है। एन α टर्मिनस पर एक अस्थायी रक्षा के समूह द्वारा नकाबपोश प्रारंभिक अमीनो एसिड, सी टर्मिनस से राल पर भरी हुई है। (चित्रा 1, चरण 1) यदि आवश्यक हो तो पक्ष श्रृंखला मुखौटा करने के लिए एक अर्द्ध स्थायी रक्षा के समूह में भी प्रयोग किया जाता है। लक्ष्य पेप्टाइड संश्लेषण एन α-अस्थायी रक्षा के समूह की deprotection का दोहराव चक्र अगले संरक्षित एमिनो एसिड की (चित्रा 1, चरण 2) और युग्मन (चित्रा 1 से एन टर्मिनस के लिए सी टर्मिनस से इकट्ठा किया जाता है ओंग>, चरण 3)। पिछले अमीनो एसिड (चित्रा 1, चरण 4) लोड करने के बाद, पेप्टाइड राल समर्थन से चिपके रहते है और अर्द्ध स्थायी रक्षा के समूह (चित्रा 1, चरण 5) को हटा रहे हैं।

आकृति 1
ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण की चित्रा 1. सामान्य योजना। एन α-संरक्षित एमिनो एसिड राल (चरण 1) के लिए एक लिंकर के माध्यम से carboxyl समूह का उपयोग कर लंगर डाले है। वांछित पेप्टाइड एन α (चरण 2) और अमीनो एसिड युग्मन (चरण 3) से अस्थायी रक्षा के समूह (टीपीजी) की deprotection का दोहराव चक्र से एन टर्मिनस के लिए सी टर्मिनस से एक रैखिक फैशन में इकट्ठा किया है। संश्लेषण (चरण 4) को पूरा करने के बाद, अर्द्ध स्थायी रक्षा के समूह (एसपीजी) पेप्टाइड दरार (चरण 5) के दौरान deprotected कर रहे हैं।= "_blank" मिल> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यह चक्रगति (2A चित्रा) के लिए केवल एक ही विकल्प, (बी) चक्रगति प्रदान करता है के बाद से यह एक सुविधाजनक तरीका है, लेकिन सीमित - (ए) के सिर से पूंछ चक्रगति: पूरा पेप्टाइड श्रृंखला की विधानसभा के बाद, चक्रगति कई विकल्प द्वारा प्राप्त किया जा सकता बायोएक्टिव कार्य समूहों में होते हैं कि ब्याज के अनुक्रम से अमीनो एसिड का उपयोग कर - हालांकि, इन अमीनो एसिड के उपयोग के बिना परेशान अमीनो एसिड (या अन्य इमारत ब्लॉकों) जोड़कर जैविक गतिविधि (चित्रा 2 बी), और (सी) चक्रगति प्रभावित कर सकते हैं बायोएक्टिव अनुक्रम। यह ब्याज के अनुक्रम (चित्रा -2) में संशोधन के बिना ध्यान केंद्रित पुस्तकालयों के उत्पादन की अनुमति देता है के रूप में इन अणुओं का परिचय व्यापक है।

चित्र 2
एफigure 2. वैकल्पिक पेप्टाइड चक्रगति रणनीतियों सी टर्मिनस और एन टर्मिनस के बीच एक पेप्टाइड बंधन के माध्यम से पूंछ चक्रगति के लिए (ए) सिर,। कार्य समूहों के बीच (बी) चक्रगति ऐसे / glutamic एसिड (2), या पक्ष श्रृंखला एन करने के लिए या सी टर्मिनस (3 aspartic को सिस्टीन अवशेषों (1), या लाइसिन की ओर चेन के बीच एक एमाइड बांड के बीच एक डाइसल्फाइड बॉन्ड के रूप में -4); (R0) पहले और (R7) बायोएक्टिव अनुक्रम के बाद, उदाहरण के लिए, अतिरिक्त अमीनो एसिड या एमिनो एसिड डेरिवेटिव या छोटे अणुओं को जोड़कर (सी) चक्रगति। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

माइक्रोवेव की सहायता इस प्रकार कार्बनिक रसायन में तेजी, संश्लेषण प्रतिक्रियाओं गर्म करने के लिए माइक्रोवेव विकिरण का उपयोग करता 40,41 परिवर्तनों। माइक्रोवेव रसायन शास्त्र अवशोषित करने के लिए विलायक अभिकर्मक की क्षमता / पर आधारित हैमाइक्रोवेव ऊर्जा और इसे बदलने के 42 गर्म करने के लिए। प्रौद्योगिकी व्यापक हो गया इससे पहले, प्रमुख कमियां controllability और संश्लेषण प्रोटोकॉल के reproducibility और पर्याप्त तापमान और दबाव नियंत्रण 43,44 के लिए उपलब्ध सिस्टम की कमी सहित काबू पाने जा सकता था। माइक्रोवेव की सहायता पेप्टाइड संश्लेषण की पहली रिपोर्ट युग्मन दक्षता और शुद्धता 45 की महत्वपूर्ण सुधार के साथ कई लघु पेप्टाइड्स के संश्लेषण के लिए एक रसोई माइक्रोवेव (7-10 अमीनो एसिड) का उपयोग किया गया था। इसके अलावा, माइक्रोवेव ऊर्जा, चेन एकत्रीकरण में कमी की ओर प्रतिक्रियाओं को कम करने, racemization सीमा है, और सभी के लिए मुश्किल और लंबे दृश्यों 46-53 के लिए महत्वपूर्ण हैं जो युग्मन दरों में सुधार करने के लिए दिखाया गया था।

वर्तमान में एक ठोस समर्थन पर पेप्टाइड्स या संबंधित यौगिकों के संश्लेषण के लिए माइक्रोवेव विकिरण का उपयोग कार्बनिक विलायक 54 की बजाय पानी में (ए) संश्लेषण सहित व्यापक है; (बी) पेप्टाइड्स के संश्लेषण के साथऐसे जिसका संश्लेषण के कारण sterically रुकावट अमीनो एसिड डेरिवेटिव की कम युग्मन दक्षता के लिए आम तौर पर मुश्किल है glycopeptides 55-58 या phosphopeptides 59-61, के रूप में आम बाद translational संशोधनों; (सी) जिसका पक्ष श्रृंखला से जुड़ा है एक नाइट्रोजन परमाणु 62, या peptoids, साथ एक एमिनो एसिड अवशेषों की सी (α) के प्रतिस्थापन द्वारा गठित किया जा सकता है, जो इस तरह के azapeptides के रूप में रीढ़ की हड्डी में संशोधन के साथ पेप्टाइड्स, के संश्लेषण बल्कि Cα परमाणु 63,64 से एमाइड नाइट्रोजन; (डी) चक्रीय पेप्टाइड्स 65-71 के संश्लेषण; मिश्रित पुस्तकालयों 51,72 की और (ई) संश्लेषण। कई मामलों में, लेखकों उच्च दक्षता की सूचना दी और पारंपरिक प्रोटोकॉल की तुलना में माइक्रोवेव विकिरण का उपयोग कर संश्लेषण समय कम कर दिया।

एक तर्कसंगत डिजाइन 73-75 का उपयोग करना, हम के लिए पाड़ एल eishmania के रिसेप्टर से प्राप्त किए गए है कि विरोधी परजीवी पेप्टाइड्स विकसितआर सी-काइनेज (कमी) सक्रिय। अभाव Leishmania संक्रमण 76 के प्रारंभिक चरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। कमी की वजह से निचले स्तर व्यक्त परजीवियों कमी आवश्यक परजीवी संकेत प्रक्रियाओं और प्रोटीन संश्लेषण 78 में शामिल है के रूप में भी प्रतिरक्षा समझौता चूहों 77 परजीवी बनने का असफल। इसलिए, कमी एक प्रमुख पाड़ प्रोटीन 79 और एक मूल्यवान दवा लक्ष्य है। लेकिन नहीं मेजबान स्तनधारी homolog रैक में, परजीवी में संरक्षित कर रहे हैं कि अभाव में दृश्यों पर केंद्रित है, हम एक 8 अमीनो एसिड पेप्टाइड संस्कृति में Leishmania सपा। व्यवहार्यता में कमी आई कि (RNGQCQRK) की पहचान की।

यहाँ, हम ऊपर वर्णित कमी प्रोटीन अनुक्रम से निकाली गई रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड्स के संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। पेप्टाइड्स Fmoc / TBU प्रोटोकॉल के साथ SPPS कार्यप्रणाली से माइक्रोवेव हीटिंग का उपयोग कर एक ठोस समर्थन पर संश्लेषित किया गया। पेप्टाइड्स एक एमाइड बांड के रूप में के माध्यम से एक बुनना 47-57 (YGRKKRRQRRR) वाहक पेप्टाइड संयुग्मित थेSPPS का हिस्सा है। कोशिकाओं में कार्गो की एक किस्म के जैसे आधारित परिवहन पर 15 साल के लिए किया गया है और subcellular अंगों में माल की डिलीवरी 80 पुष्टि की गई है। चार अलग अलग linkers, succinic और glutaric एनहाइड्राइड के साथ ही वसीय और pimelic एसिड, 2-5 कार्बन की कार्बोक्जिलिक एसिड linkers उत्पन्न करने के लिए चक्रगति प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। चक्रगति माइक्रोवेव ऊर्जा का उपयोग किया गया था, और अंतिम दरार और पक्ष श्रृंखला deprotection कदम माइक्रोवेव ऊर्जा के बिना मैन्युअल रूप से किया गया था। एक स्वचालित माइक्रोवेव सिंथेसाइज़र का उपयोग करते हैं, उत्पाद पवित्रता बेहतर उत्पाद उपज में वृद्धि हुई है, और संश्लेषण की अवधि कम कर दिया। यह सामान्य प्रोटोकॉल विट्रो और इन विवो में महत्वपूर्ण आणविक तंत्र को समझने और आगे मानव रोगों के लिए संभावित दवाओं को विकसित करने के लिए पेप्टाइड्स का उपयोग कि अन्य अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. उपकरण और अभिकर्मकों तैयारी

  1. तैयारी उपकरण
    1. उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग कर एक धूआं हुड के अंदर सभी चरणों का प्रदर्शन।
    2. रासायनिक (एक गिलास मिलाना के साथ 30 मिलीलीटर,) एक Teflon प्रतिक्रिया पोत में माइक्रोवेव बिजली वितरण को नियंत्रित करने के लिए एक फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच के साथ सुसज्जित डिस्कवर का एक अतिरिक्त मॉड्यूल के साथ एक माइक्रोवेव पेप्टाइड सिंथेसाइज़र का उपयोग ठोस समर्थन पर या एक डिस्पोजेबल polypropylene में पेप्टाइड्स synthesize कारतूस (एक मोटे मिलाना के साथ 12 मिलीलीटर)।
    3. उचित मिश्रण के लिए, प्रतिक्रिया पोत के लिए नाइट्रोजन की आपूर्ति कनेक्ट, या वैकल्पिक रूप से polypropylene कारतूस के दोनों सिरों मुहर, और एक रोटरी प्रकार के बरतन पर जगह है।
    4. प्रतिक्रिया मिश्रण या washes के निकास के लिए, एक बेकार जाल के माध्यम से घर वैक्यूम करने के लिए कनेक्ट।
    5. प्रतिक्रिया पोत में फाइबर ऑप्टिक जांच प्लेस।
  2. अभिकर्मकों तैयारी
    1. रिंक Amide पूर्वाह्न राल 100-200 जाल वजन द्वारा राल तैयार (0.204 मिलीग्राम)ठीक से प्रफुल्लित करने के लिए 2-4 घंटे के लिए हिला, नीचे राल धोने, और निकास के लिए प्रतिक्रिया पोत / polypropylene कारतूस के लिए एन 1 मिश्रण, एन -dimethylformamide (DMF) / क्लोराइड (डीसीएम): 1 के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. DMF में इसी Fmoc अमीनो एसिड भंग द्वारा एसिड समाधान -amino 0.2 एम 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) तैयार करें और अमीनो एसिड (तालिका 1) भंग कर रहे हैं जब तक मिश्रण भंवर।
    3. (Benzotriazol-1-YL) - - एन, एन, एन ',' एन -tetramethyluronium Hexafluorophosphate (HBTU) 100 मिलीलीटर DMF में और ठोस जब तक मिश्रण vortexing भंग कर रहा है (टेबल 18.96 छ हे भंग द्वारा 0.45 एम उत्प्रेरक समाधान मिश्रण तैयार करें 1)।
    4. 65.2 मिलीलीटर 1-मिथाइल-2-pyrrolidinone (एनएमपी) (तालिका 1) के साथ 34.8 मिलीलीटर एन, एन -diisopropylethylamine (DIEA) के संयोजन से 2 एम उत्प्रेरक आधार समाधान मिश्रण तैयार करें।
    5. 3.37 छ 1-hydroxybenzotriazole हाइड्रेट भंग द्वारा 0.1 एम deprotection समाधान मिश्रण तैयार करें (HOBt)एक 20% v / वी DMF में piperidine के समाधान और ठोस जब तक मिश्रण vortexing के 250 मिलीलीटर में (1 टेबल) को भंग कर दिया है।

2. एमिनो एसिड युग्मन Fmoc-संरक्षित

  1. एमिनो एसिड युग्मन
    1. प्रतिक्रिया पोत / polypropylene कारतूस को अमीनो एसिड (2.5 मिलीलीटर) / उत्प्रेरक (1 मिलीलीटर) / उत्प्रेरक आधार (0.5 मिलीलीटर) जोड़ें और प्रतिक्रिया 300 सेकंड (25 डब्ल्यू, 75 डिग्री सेल्सियस, तालिका 2) के लिए आगे बढ़ना। समाधान नाली।
    2. DMF के साथ राल धो लें। 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) DMF जोड़ें और समाधान नाली। पांच बार दोहराएं।
  2. Fmoc deprotection
    1. 0.1 एम HOBt को प्रतिक्रिया पोत / polypropylene कारतूस के साथ DMF में 20% piperidine के 7 मिलीलीटर जोड़ें और 30 सेकंड (45 डब्ल्यू, 75 डिग्री सेल्सियस, तालिका 2) के लिए सेते हैं।
    2. प्रतिक्रिया मिश्रण नाली।
    3. करने के लिए प्रतिक्रिया पोत / polypropylene कारतूस 0.1 एम HOBt साथ DMF में 20% piperidine के 7 मिलीलीटर जोड़ें और 180 सेकंड के लिए सेते (45 डब्ल्यू75 डिग्री सेल्सियस, 2 टेबल)।
    4. प्रतिक्रिया मिश्रण नाली।
    5. DMF के साथ राल धो लें। 120 सेकंड (7 मिलीलीटर 0 डब्ल्यू, आर टी) के लिए राल के लिए DMF जोड़ें और समाधान नाली। पांच बार दोहराएं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, यहाँ की प्रक्रिया को थामने के लिए और एक बाद की तारीख में फिर से शुरू।
  3. एमिनो एसिड युग्मन कदम के बाद, (- 20 डिग्री सेल्सियस पर एक लंबी अवधि की दुकान के लिए राल) 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम कई दिनों के लिए डीसीएम और दुकान के साथ राल धो लें।
    1. एक polypropylene कारतूस करने के लिए प्रतिक्रिया पोत से राल ले जाएँ।
    2. डीसीएम के साथ राल धो लें। 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) डीसीएम जोड़ें और समाधान नाली। तीन बार दोहराएँ।
    3. एक शीर्ष टोपी और पानी निकलने की टोंटी के साथ कसकर polypropylene कारतूस सील।
    4. एक नया संश्लेषण शुरू करने से पहले, DMF में 3-4 घंटा (7 एमएल) के लिए राल प्रफुल्लित।
  4. संश्लेषण निगरानी
    1. जल्दी की प्रगति निर्धारित करने के लिए कैसर (ninhydrin) परीक्षण या Chloranil परीक्षण का उपयोग करेंसंश्लेषण। वैकल्पिक रूप से, संश्लेषित पेप्टाइड की पवित्रता और बड़े पैमाने पर निर्धारित करने के लिए एक छोटे पैमाने पर दरार प्रतिक्रिया करते हैं। धारा 9 देखें।
      नोट: आगे समस्या निवारण के लिए 3 टेबल देखें।
  5. लक्षित पेप्टाइड के संश्लेषण के लिए वांछित के रूप में दोहराएँ 2.1 और 2.2 कदम: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. एनहाइड्राइड / एसिड युग्मन

  1. एनहाइड्राइड युग्मन
    1. एन एम पी के साथ राल धो लें। 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) एन एम पी जोड़ें और समाधान नाली। तीन बार दोहराएँ।
    2. , एन एम पी (5 एमएल) में इसी एनहाइड्राइड के 10 समकक्ष भंग 1 बराबर 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) और समाधान के लिए 10 समकक्ष DIEA (तालिका 1) जोड़ें।
    3. (25 / DIEA राल को एनहाइड्राइड / DMAP के 10 मिश्रण और 300 सेकंड के लिए सेते हैं: 1: एक 10 जोड़ेडब्ल्यू, 75 डिग्री सेल्सियस, 2 टेबल)। समाधान नाली।
    4. एन एम पी के साथ राल धो लें। 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) एन एम पी जोड़ें और समाधान नाली। तीन बार दोहराएँ।
  2. एसिड युग्मन
    1. DMF के साथ राल धो लें। 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) DMF जोड़ें और समाधान नाली। तीन बार दोहराएँ।
    2. DMF में इसी dicarboxylic एसिड के 10 समकक्ष (5 एमएल) भंग। 1 बराबर DMAP और 10 समकक्ष एन, समाधान के लिए 'एन -Diisopropylcarbodiimide (डीआईसी) (तालिका 1) जोड़ें।
    3. 30 मिनट के लिए मिश्रण से मिश्रण पूर्व सक्रिय करें।
    4. राल के लिए मिश्रण जोड़ें और 300 सेकंड (25 डब्ल्यू, 75 डिग्री सेल्सियस, तालिका 2) के लिए सेते हैं और समाधान नाली।
    5. DMF के साथ राल धो लें। 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) और नाली समाधान DMF जोड़ें। दोहराएँ चरण में तीन बार।

4. एन methyltrityl (MTT) समूह Deprotect की रक्षाआयन

नोट: लाइसिन पक्ष श्रृंखला एन methyltrityl (MTT) 81, एसिड अस्थिर परिस्थितियों के 82,83 के तहत चुनिंदा deprotected जा सकता है कि एक रक्षा समूह के साथ संरक्षित किया गया। Deprotect Mtt माइक्रोवेव ऊर्जा के बिना एक प्रकार के बरतन पर मैन्युअल समूह की रक्षा।

  1. टोपी प्लग और पानी निकलने की टोंटी से लैस एक polypropylene कारतूस राल स्थानांतरण।
  2. डीसीएम के साथ राल धो लें। 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) डीसीएम जोड़ें और समाधान नाली। तीन बार दोहराएँ।
  3. राल की एक ग्राम प्रति polypropylene कारतूस के लिए 1% trifluoroacetic एसिड (टीएफए), 5% Triisopropylsilane (टीआईएस), और 94% डीसीएम का एक मिश्रण का 15-25 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: टीएफए एक मजबूत एसिड होता है और संक्षारक और त्वचा, आंखों, और फेफड़े के ऊतकों के लिए बेहद परेशान है।
    1. हर समय हुड में TFA के केंद्रित समाधान रखें।
    2. एक अच्छी तरह हवादार हुड में उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (आंखों की सुरक्षा, एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने) और काम का प्रयोग करें। तुरंत बदलें दस्तानेवे TFA और तुरंत साफ-अप किसी भी फैल के साथ संपर्क में आते हैं। त्वचा या आंखों एसिड के साथ संपर्क में आते हैं, तो पानी के साथ तुरंत प्रभावित क्षेत्र फ्लश और अतिरिक्त 15 मिनट के लिए धो लें।
  4. एक प्रकार के बरतन पर polypropylene कारतूस की जगह और आरटी पर 5 मिनट के लिए हिला।
  5. वैक्यूम लगाने से polypropylene कारतूस से समाधान निकाल लें।
  6. दोहराएँ 4.3-4.5, तीन बार दोहराएँ।
  7. डीसीएम के साथ राल धो लें। 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) डीसीएम जोड़ें और समाधान नाली। पांच बार दोहराएं।

रैखिक पेप्टाइड 5. चक्रगति

  1. डीसीएम के साथ राल धो लें। 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) डीसीएम जोड़ें और समाधान नाली। पांच बार दोहराएं।
  2. एक 50 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में, 5 समकक्ष benzotriazole-1-LY-ऑक्सी Tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate Dibromomethane में (PyBOP) (डी बी, 5 एमएल) और समाधान के लिए 10 समकक्ष DIEA जोड़ने (तालिका 1) भंग।
  3. तालिका 2) के लिए सेते हैं। समाधान नाली।
  4. डीसीएम के साथ राल धो लें। 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) डीसीएम जोड़ें और समाधान नाली। तीन बार दोहराएँ।

पक्ष श्रृंखला समूह 6. दरार और deprotection

  1. डीसीएम और Diethyl ईथर के साथ राल धो लें।
    1. 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) डीसीएम जोड़ें और समाधान नाली। दो बार दोहराएँ।
    2. 120 सेकंड के लिए राल के लिए (7 मिलीलीटर, 0 डब्ल्यू, आरटी) Diethyl ईथर जोड़ें और समाधान नाली। दो बार दोहराएँ।
  2. पोटेशियम हीड्राकसीड (KOH, 1-10 ग्राम) पर कम से कम 3 घंटे के लिए आरटी पर निर्वात desiccator में राल सूखी।
  3. सूखे राल वजन और एक polypropylene कारतूस को हस्तांतरण।
  4. एक पूर्व ठंडा trifluoroacetic एसिड (टीएफए) दरार कॉकटेल के 10 मिलीलीटर जोड़ें (जैसे, 90% टीएफए, 2.5% पानी, 2.5% तीस और 5% फिनोल) राल के हर एक ग्राम के लिए।
  5. 3 घंटे के लिए हिलाआरटी पर।
  6. एक 50 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में राल छान कर टीएफए दरार समाधान लीजिए। छानने का काम के लिए, 12 मिलीलीटर polypropylene कारतूस में है कि मिलाना का उपयोग करें।
  7. ट्यूब ठंड Diethyl ईथर (35 एमएल) जोड़ें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1207 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  9. आकाश परत छानना।
  10. दोहराएँ चरण 6.7-6.9, पांच बार।

7. बैकबोन चक्रीय पेप्टाइड सुखाने

  1. एक ही ट्यूब में उपजी पेप्टाइड रखें और 30 मिनट के लिए एक हुड में सूखी।
  2. पानी और acetonitrile (एसीएन) का एक मिश्रण: एक 1 में पेप्टाइड भंग।
  3. तरल नाइट्रोजन में अंतिम उत्पाद समाधान रुक।
  4. अंतिम उत्पाद Lyophilize।

8. बैकबोन चक्रीय पेप्टाइड निस्र्पक

  1. पानी (400 μl) में उत्पाद का एक छोटा सा नमूना (1 मिलीग्राम) भंग।
  2. एक रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल chromatograp को भंग पेप्टाइड (10-200 μl) इंजेक्षनलुका (आरपी-एचपीएलसी) प्रणाली पेप्टाइड पवित्रता 34 परीक्षण करने के लिए।
  3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर आयनीकरण (एमएस-MALDI) 84 का उपयोग कर पेप्टाइड की बड़े पैमाने पर की जाँच करें।
    1. Acetonitrile की 1 (वी / वी) मिश्रण: एक 1: 1 μl (100 माइक्रोन) पेप्टाइड मिक्स पानी मैट्रिक्स के 1 μl (5 मिलीग्राम / एमएल, α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड) के साथ एक 1: 1 (वी acetonitrile की / वी) मिश्रण: टीएफए (0.1%) के साथ पानी।
    2. स्पॉट एमएस MALDI प्लेट पर 1 μl।
    3. नमूना सूखी और मास स्पेक्ट्रोमीटर में जगह है।
  4. पेप्टाइड वजन और प्रतिशत उपज की गणना।
  5. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

9. संश्लेषण निगरानी

  1. कैसर (ninhydrin) की परीक्षा 85
    1. अभिकर्मक समाधान तैयार करें।
      1. आसुत जल का 25 मिलीलीटर में पोटेशियम साइनाइड (KCN) का 16.5 मिलीग्राम भंग करके समाधान एक तैयार करें। पिरिडीन के 49 मिलीलीटर के साथ ऊपर समाधान के 1 मिलीलीटर पतला।
      2. समाधान बी तैयारइथेनॉल के 20 मिलीलीटर में ninhydrin की 1 ग्राम भंग करके।
      3. 20 मिलीलीटर इथेनॉल में 40 ग्राम फिनोल भंग द्वारा समाधान सी तैयार करें।
    2. एमिनो एसिड युग्मन के पूरा होने या रक्षा के समूह की deprotection जाँच करने के लिए कैसर परीक्षण का उपयोग करें।
      1. एक टेस्ट ट्यूब को राल से कुछ मोती स्थानांतरण।
      2. तीन बूँदें प्रत्येक समाधान की (~ 100 μl) (ए, बी और सी) और मिश्रण जोड़ें।
      3. 5 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर टेस्ट ट्यूब हीट।
        नोट: नीले रंग का मोती (सकारात्मक परिणाम) अधूरा युग्मन प्रतिक्रिया या Fmoc की रक्षा समूह के deprotection संकेत मिलता है।
  2. Chloranil परीक्षण 86
    1. प्रत्येक परीक्षा के लिए नए सिरे से निम्नलिखित अभिकर्मकों तैयार करें।
      1. DMF में 2% Chloranil का एक समाधान तैयार, समाधान ए
      2. DMF में 2% एसीटैल्डिहाइड का एक समाधान तैयार, समाधान बी
    2. एमिनो एसिड युग्मन या टी के पूरा होने की जांच करने के Chloranil परीक्षण प्रदर्शनवह रक्षा के समूह की deprotection।
      1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में समाधान बी के 100 μl के साथ समाधान ए के 100 μl मिलाएं।
      2. में मोती ड्रॉप और धीरे 5 मिनट के लिए हिला।
        नोट: डार्क ब्राउन रंग का मोती (सकारात्मक परिणाम) Fmoc की रक्षा समूह या एक अधूरी युग्मन प्रतिक्रिया की deprotection संकेत मिलता है।
  3. छोटे पैमाने दरार प्रतिक्रिया
    1. टोपी प्लग और पानी निकलने की टोंटी से लैस एक 3 मिलीलीटर polypropylene कारतूस के लिए राल की एक छोटी राशि निकालें।
    2. एक 95% TFA के 2 मिलीलीटर मिश्रण, 2.5% पानी और 2.5% तीस साथ समझो।
    3. आरटी पर 30 मिनट के लिए मिश्रण हिला।
    4. Polypropylene कारतूस का मिलाना का उपयोग कर निस्पंदन द्वारा राल निकालें और नाइट्रोजन की एक धारा से सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना।
    5. पानी में अवशेषों को भंग करने और एचपीएलसी और / या एमएस का उपयोग कर उत्पाद का विश्लेषण।

संस्कृति परख में 10 Leishmania डोनोवनी Promastigote व्यवहार्यता

    <ली> Leishmania डोनोवनी (एल डोनोवनी) विकास और उपचार की स्थिति
    1. संस्कृति एल 26 डिग्री सेल्सियस पर 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज, एल glutamine, और सोडियम पाइरूवेट साथ ईगल मध्यम (DMEM) की है Dulbecco संशोधन में डोनोवनी promastigotes।
    2. एल समझो डोनोवनी 26 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए चक्रीय पेप्टाइड्स (100 माइक्रोन) के साथ promastigotes।
  1. Leishmania डोनोवनी (एल डोनोवनी) व्यवहार्यता परख
    1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार alamarBlue 20 μl के साथ परजीवी व्यवहार्यता का आकलन करें।
    2. (570 एनएम उत्तेजना और 590 एनएम उत्सर्जन पर) प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा alamarBlue कमी का निर्धारण करते हैं। उच्च प्रतिदीप्ति मूल्यों अधिक से अधिक चयापचय गतिविधि और बढ़ परजीवी व्यवहार्यता का संकेत मिलता है।

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Representative Results

यहाँ हम विशेष रूप से Leishmania परजीवी के महत्वपूर्ण पीपीआई को निशाना बनाने और (एजेंसी एजेंट 87 के रूप में पीपीआई लक्ष्य है कि पेप्टाइड्स के बारे में समीक्षा के लिए) एजेंसी के एजेंट के रूप में कार्य है कि रीढ़ की हड्डी चक्रीय पेप्टाइड्स के एक केंद्रित छोटे पुस्तकालय के विकास का वर्णन है। उपन्यास रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड्स के संश्लेषण के माध्यम से, pharmacophores बढ़ाई आकार का एक पाड़ में संरक्षित कर रहे हैं। यहाँ प्रस्तावित ध्यान केंद्रित पुस्तकालय की ताकत चक्रगति के माध्यम से गठनात्मक स्वतंत्रता की एक सीमित डिग्री की अनुमति है जबकि पेप्टाइड पाड़ आकार भिन्न करने की क्षमता है। रीढ़ की हड्डी चक्रीय पेप्टाइड्स की पूरी संश्लेषण Fmoc / TBU प्रोटोकॉल के बाद, ठोस समर्थन पर एक स्वचालित माइक्रोवेव सिंथेसाइज़र का उपयोग किया गया था। चक्रगति लिंकर, एनहाइड्राइड / एसिड, और लाइसिन पक्ष श्रृंखला एमाइन के बीच एक एमाइड बांड बनाने के द्वारा प्रदर्शन किया गया था। अंतिम दरार और पक्ष श्रृंखला deprotection संश्लेषण योजना और च के लिए (स्वयं माइक्रोवेव ऊर्जा के बिना बाहर किया गयाinal उत्पादों संरचना) चित्रा 3 देखें। उत्पाद -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत सफेद पाउडर के 25 मिलीग्राम की उपज के लिए प्रारंभिक HPLC द्वारा विश्लेषण किया गया था। उत्पाद का एक नमूना एमएस (चित्रा 4) द्वारा जाँच की थी और पवित्रता की अपनी डिग्री विश्लेषणात्मक एचपीएलसी (चित्रा 5) का उपयोग निर्धारित किया गया था। प्रत्येक चक्रीय पेप्टाइड का एक नमूना जैविक जांच के लिए भेजा गया था। चार चक्रीय पेप्टाइड्स (PL1) में से एक Leishmania डोनोवनी (एल डोनोवनी), आंत लीशमनियासिस, मनुष्यों में सबसे गंभीर लीशमनियासिस के कारण एक परजीवी के खिलाफ सक्रिय था। पेप्टाइड PL1 नियंत्रण उपचार (तालिका 4) के साथ तुलना में 75% से परजीवी व्यवहार्यता कम कर दिया।

चित्र तीन
चित्रा 3. संश्लेषण योजना और इस अध्ययन में संश्लेषित रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड की संरचना अभिकर्मकों और शर्तों:। (मैं) एमिनो एसिड युग्मन: 300 सेकंड, 25 डब्ल्यू, 75 डिग्री सेल्सियस,1: 2.2 अमीनो एसिड / उत्प्रेरक / उत्प्रेरक आधार 1.1 का उपयोग कर। (Ii) Fmoc deprotection: 30 सेकंड और 180 सेकंड दोनों DMF + 0.1 एम HOBt में 20% piperidine का उपयोग कर 45 डब्ल्यू, 75 डिग्री सेल्सियस, पर। (Iii) एनहाइड्राइड युग्मन: 300 सेकंड, 10 का उपयोग कर 25 डब्ल्यू, 75 डिग्री सेल्सियस,: एन एम पी में 1 एनहाइड्राइड / DIEA / DMAP: 10। (Iv) Mtt deprotection: 3 * (300 सेकंड, 0 डब्ल्यू, आरटी) 1 का उपयोग: 5: 94 टीएफए / तीस / डीसीएम। (V) चक्रगति: 300 सेकंड, 05:10 PyBOP का उपयोग कर 25 डब्ल्यू, 75 डिग्री सेल्सियस, / डी बी में DIEA। (Vi) के विखंडन और deprotection: 90 का उपयोग कर 3 घंटे, 0 डब्ल्यू, आर टी,: 2.5: 2.5: 5 टीएफए / तीस / एच 2 ओ / फिनोल। पेप्टाइड्स ठोस चरण संश्लेषण के हिस्से के रूप में एक एमाइड बांड के माध्यम से एक बुनना 47-57 (Tyr-Gly-Arg-लिस-लिस-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) वाहक पेप्टाइड संयुग्मित किया गया। के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्रा 4 MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोस्कोपी ट्रेसप्रतिनिधि रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड। मनाया मास, 2853.456 गणना जन, 2854.271 के करीब समझौते में है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
प्रतिनिधि रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड की चित्रा 5. विश्लेषणात्मक रिवर्स चरण एचपीएलसी ट्रेस। क्रूड (ए) और शुद्ध (बी) रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड का विश्लेषणात्मक एचपीएलसी निशान दिखाए जाते हैं। विलायक इस्तेमाल किया प्रणालियों और बी (सीएच 0.1% टीएफए के साथ 3 सीएन) (0.1% टीएफए के साथ एच 2 ओ) एक थे। एक C18, 5 माइक्रोन, 150 मिमी स्तंभ लागू किया गया था और पता लगाने की 215 एनएम पर था के साथ 40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट में 1 मिलीलीटर में 5-50% बी के एक रेखीय ढाल / मिनट। कृपया यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

समाधान अभिकर्मक मेगावाट (छ / मोल) डी (जी / एमएल) वॉल्यूम (एमएल) एकाग्रता (एम) कुल रकम
- एमिनो एसिड समाधान - Alanine अमीनो एसिड 311.34 0.2 6.23 छ
DMF में अमीनो एसिड की 0.2 एम DMF 100 100 मिलीलीटर
एलनाइन अमीनो एसिड, लेकिन एक ही गणना के लिए एक उदाहरण उचित मेगावाट के साथ, प्रत्येक अमीनो एसिड के लिए किया जाना चाहिए। एक 100 मिलीलीटर अमीनो एसिड समाधान 100 मिलीलीटर DMF में एलनाइन अमीनो एसिड की 6.23 ग्राम भंग तैयार करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- Deprotection समाधान- HOBt 135.1 0.1 3.37 छ
0.1M HOBt साथ DMF में piperidine के 20% v / वी समाधान Piperidine 50 50 मिलीलीटर
DMF 200 200 मिलीलीटर
समूह की रक्षा - deprotection Fmoc एन α को हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक 250 मिलीलीटर deprotection समाधान 200 मिलीलीटर DMF में 3.37 जी HOBt भंग करने और 50 मिलीलीटर piperidine जोड़ने तैयार करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- उत्प्रेरक समाधान - HBTU 379.24 0.45 18.96 छ
DMF में 0.45 एम HBTU DMF 100 100 मिलीलीटर
उत्प्रेरक हैयुग्मन प्रतिक्रिया से पहले एमिनो एसिड सक्रिय करने के लिए उत्प्रेरक के आधार के साथ इस्तेमाल किया। एक 100 मिलीलीटर उत्प्रेरक समाधान 100 मिलीलीटर DMF में 18.96 छ HBTU भंग तैयार करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- उत्प्रेरक आधार समाधान - DIEA 129.24 0.742 2 34.80 मिलीलीटर
एन एम पी 2 एम DIEA एनएमपी 65.20 मिलीलीटर
उत्प्रेरक आधार युग्मन प्रतिक्रिया से पहले एमिनो एसिड सक्रिय करने के लिए उत्प्रेरक के साथ प्रयोग किया जाता है। एक 100 मिलीलीटर उत्प्रेरक आधार समाधान मिश्रण 34.8 मिलीलीटर DIEA और 65.2 मिलीलीटर एन एम पी तैयार करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
समाधान अभिकर्मक मेगावाट (छ / मोल) डी (जी / एमएल) वॉल्यूम (एमएल) Eq कुल रकम
एनहाइड्राइड समाधान - 10: 1: एन एम पी में 10 एनहाइड्राइड / DMAP / DIEA Glutaric / Succinic एनहाइड्राइड 114.1 / 100.07 10 0.11 / 0.10 छ
DMAP 122.2 1 0.01 छ
DIEA 129.24 0.742 10 0.09 मिलीलीटर
एनएमपी 5 5 मिलीलीटर
, 5 मिलीलीटर एन एम पी में glutaric / succinic एनहाइड्राइड की 0.11 / 0.10 ग्राम भंग समाधान के लिए 0.01 DMAP की जी और DIEA के 0.09 मिलीलीटर जोड़ें। एक ताजा समाधान तैयार है।
एसिड समाधान - 10: 1: DMF में 10 एसिड / DMAP / डीआईसी वसीय / Pimelic एसिड 146.14 / 160.17 10 0.15 / 0.16 छ
DMAP </ टीडी> 122.2 1 0.01 छ
डीआईसी 126.2 0.806 10 0.16 मिलीलीटर
DMF 5 5 मिलीलीटर
, 5 मिलीलीटर DMF में Adipic / Pimelic एसिड की 0.15 / 0.16 ग्राम भंग समाधान के लिए 0.01 DMAP की जी और डीआईसी के 0.16 मिलीलीटर जोड़ें। एक ताजा समाधान तैयार है।
चक्रगति समाधान - डी बी में 05:10 PyBOP / DIEA PyBOP 520.3 5 0.26 छ
DIEA 129.24 0.742 10 0.09 मिलीलीटर
डी बी 5 मिलीलीटर 5 मिलीलीटर
5 मिलीलीटर डी बी में 0.26 जी PyBOP भंग करने और समाधान के लिए DIEA के 0.09 मिलीलीटर जोड़ें। एक तैयार करेंताजा समाधान।

रीढ़ की हड्डी चक्रीय पेप्टाइड संश्लेषण संश्लेषण के लिए समाधान और अभिकर्मकों की। सूची के लिए तालिका 1. अभिकर्मकों और समाधान प्रदान की जाती है।

माइक्रोवेव चक्र पावर (वत्स) अस्थायी (डिग्री सेल्सियस) समय (सेकंड)
1 अमीनो एसिड युग्मन 25 75 300
2 Fmoc की रक्षा समूह के deprotection (एक) प्रारंभिक deprotection 45 75 30
(ख) पूरा deprotection 45 75 180


युग्मन और deprotection के लिए तालिका 2. माइक्रोवेव चक्र। के लिए माइक्रोवेव चक्रएमिनो एसिड युग्मन और Fmoc-deprotection। एमिनो एसिड की (1) युग्मन। प्रारंभिक और (ख) पूरा deprotection (एक): Fmoc मास्किंग समूह (2) deprotection दो चरणों में किया जाता है।

समस्या संभावित कारण समाधान
कैसर या Chloranil परीक्षण अमीनो एसिड युग्मन के बाद सकारात्मक रहे हैं एमिनो एसिड युग्मन अधूरा है युग्मन चरण को दोहराएँ
पेप्टाइड्स कुशलता से सतह पर तैरनेवाला से अलग नहीं कर रहे हैं टीएफए की अतिरिक्त राशि नाइट्रोजन की एक धारा का उपयोग नमूना लुप्त हो जाना
उत्पाद में हटाए जाने के दृश्यों की उपस्थिति Fmoc हटाने अधूरा है Fmoc हटाने अधूरा दोहराने कदम है मामले में कैसर या Chloranil परीक्षण और / या छोटे पैमाने पर दरार से deprotection, मॉनिटर
एमिनो एसिड couplआईएनजी अधूरा है कदम दोहराने अमीनो एसिड युग्मन अधूरा है, के मामले में कैसर या Chloranil परीक्षण और / या छोटे पैमाने पर दरार से युग्मन पर नजर रखने और / या उससे अधिक समय प्रतिक्रिया समय का उपयोग

सबसे आम सिंथेटिक चुनौतियों के समाधान के लिए तालिका 3. समस्या निवारण सलाह सूची प्रदान की जाती है।

पेप्टाइड अनुक्रम n सुश्री। काल। एमएस ओ बीएस। एचपीएलसी प्राप्ति परजीवी व्यवहार्यता
PL1 RNGQCQRK-सीजी-YGRKKRRQRRR 2 2854.321 2853.456 98% 86% 25%
pL2 RNGQCQRK-सीजी-YGRKKRRQRRR 3 2868.348 98% 87% 100%
PL3 RNGQCQRK-सीजी-YGRKKRRQRRR 4 2882.375 2881.823 96% 89% 97%
PL4 RNGQCQRK-सीजी-YGRKKRRQRRR 5 2896.402 2895.603 97% 85% 98%

तालिका 4. विशेषता और इस अध्ययन में पेप्टाइड्स के bioactivity। एन एल्काइल स्पेसर (संरचना के लिए चित्रा 3 देखें) में methylenes की संख्या को दर्शाता है। एमएस MALDI तकनीक का उपयोग किया गया था और पवित्रता विश्लेषणात्मक एचपीएलसी द्वारा निर्धारित किया गया था। पेप्टाइड्स Leishmania डोनोवनी promastigotes करने के लिए जोड़ा गया था और परजीवी की व्यवहार्यता का आकलन किया और पेप्टाइड के अभाव में incubated संस्कृतियों को नियंत्रित करने के प्रतिशत अस्तित्व रिश्तेदार के रूप में व्यक्त की गई थी। केवल PL1 उच्च Leishmanicidal गतिविधि थी। समीक्षकप्रयोगात्मक शर्तों को अंधा हो गया था। डेटा, तीन स्वतंत्र अनुभवों के प्रतिनिधि हैं।

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Discussion

एक पूरी तरह से स्वचालित माइक्रोवेव सिंथेसाइज़र का उपयोग Leishmania परजीवी की कमी प्रोटीन से निकाली गई रीढ़ चक्रीय पेप्टाइड्स के एक केंद्रित पुस्तकालय के संश्लेषण में वर्णित है। चक्रीय पेप्टाइड्स की एक केंद्रित पुस्तकालय संरक्षित pharmacophores और विभिन्न linkers के साथ विकसित किया गया था। ऐसे glutaric एनहाइड्राइड, succinic एनहाइड्राइड, वसीय अम्ल, pimelic एसिड, लाइसिन, ओर्निथिन, और अन्य इमारत ब्लॉकों के रूप में विभिन्न linkers के अलावा चक्रीय पेप्टाइड्स के गठनात्मक अंतरिक्ष की विविधता को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक केंद्रित चक्रीय पेप्टाइड्स पुस्तकालय के संश्लेषण के शोधकर्ताओं इष्टतम गठनात्मक अंतरिक्ष के लिए स्क्रीन करने के लिए अनुमति देता है। चक्रीय पेप्टाइड्स की रचना ऐसी अंगूठी के आकार और स्थिति के रूप में मानकों पर निर्भर करता है के बाद से, विभिन्न रचना के साथ विविध एनालॉगों जैविक संरचना गतिविधि संबंध में उपयोगी हो सकता है, जो उत्पन्न 88 के अध्ययन किया जा सकता है।

SPPS में एक मुख्य चुनौती SYNT निदान किया जाता हैकोई मध्यवर्ती के बाद से hetic प्रगति और समस्या को सुलझाने अलग कर रहे हैं। इसलिए, कई वर्णमिति परीक्षण ऐसे कैसर और Chloranil परीक्षण से मुक्त अमाइन की पहचान है कि उन लोगों के रूप में प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कैसर या Chloranil परीक्षण संकेत नहीं हैं, तो एक छोटे पैमाने दरार प्रतिक्रिया (उनके अल्फा अमीनो समूह पाँच अंग का अंगूठी का हिस्सा है क्योंकि जैसे, प्रोलाइन और हाइड्रोक्सी प्रोलाइन अन्य अमीनो एसिड के रूप में एक ही रास्ते में ninhydrin के साथ प्रतिक्रिया नहीं है) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण संश्लेषण प्रगति की निगरानी करने के लिए लागू किया जा सकता है।

विखंडन समय और दरार कॉकटेल रासायनिक गुणों और इस्तेमाल की रक्षा के समूहों की संख्या के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। यह राल (1-10 मिलीग्राम) की एक छोटी राशि का उपयोग कर एक प्रारंभिक परीक्षण दरार उचित शर्तों को सत्यापित करने के लिए किया जा सिफारिश की है। राजा एट अल। विभिन्न पेप्टाइड्स और उनके विस्तृत दिशा-निर्देश के लिए परीक्षण किया है विभिन्न दरार कॉकटेल reactio का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताएन की स्थिति 89। रीढ़ की हड्डी चक्रीय पेप्टाइड्स के लिए, कम से कम 3 घंटे के लिए ऊष्मायन पूर्ण दरार के लिए एक डिफ़ॉल्ट के रूप में सिफारिश की है। हालांकि, रक्षा के समूहों या मुश्किल की रक्षा समूहों के एक उच्च संख्या युक्त पेप्टाइड्स (जैसे, टी butyl एस्टर या pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-Sulfonyl) पूरा deprotection सुनिश्चित करने के लिए एक लंबे समय के लिए incubated होना चाहिए। इस के साथ साथ, हम व्यवस्थित इष्टतम दरार समय या कॉकटेल अध्ययन नहीं किया है। फिर भी, हम एक छोटी दरार समय (कम से कम 2 घंटा) कुछ की रक्षा समूहों की अधूरी दरार के परिणामस्वरूप पाया।

मानक माइक्रोवेव पेप्टाइड संश्लेषण प्रोटोकॉल पेप्टाइड्स की एक किस्म के संश्लेषण के लिए एक आम तौर पर लागू विधि है। ज्यादातर मामलों में, एक स्वचालित माइक्रोवेव सिंथेसाइज़र का उपयोग संश्लेषण की अवधि को कम कर देता है और उत्पादों की उपज और पवित्रता बढ़ जाती है। इसके अलावा, यह racemization और aspartimide गठन के रूप में इस तरह के पक्ष प्रतिक्रियाओं कम हो जाती है। हम ऐसा नहीं किया है हालांकिहमारे और अन्य प्रयोगशालाओं के अनुभव पर आधारित इस अध्ययन में माइक्रोवेव और पारंपरिक संश्लेषण का एक पक्ष द्वारा साइड तुलना, यह माइक्रोवेव की सहायता संश्लेषण का उपयोग पारंपरिक प्रोटोकॉल 61,70 से बेहतर है कि दिखाया गया था। लगभग सभी activators और रेजिन प्रभावी ढंग से माइक्रोवेव SPPS में इस्तेमाल किया जा सकता है और सामान्य विधि को भी संशोधित जैसे पेप्टाइड्स, glycopeptides, phosphopeptides, azapeptides, peptoids, और चक्रीय पेप्टाइड्स 90 की एक किस्म के संश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है।

चक्रगति रेखीय व्यापारियों की शक्ति और स्थिरता को बढ़ाने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है। चक्रीय पेप्टाइड्स बंधन आत्मीयता और चयनात्मकता वृद्धि हुई करने के लिए योगदान कर सकते हैं कि एक वांछनीय विवश रचना प्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, रैखिक पेप्टाइड्स संभवतः कई अंतर्जात प्रोटीन बाध्यकारी इंटरफेस 91 को लक्षित करने के लिए उन्हें सक्षम, कई चक्रीय छोरों को रोकने के लिए संशोधित किया जा सकता है। हालांकि, यह है कि चक्रगति नोट करने के लिए necess महत्वपूर्ण नहीं होता हैarily सभी या कभी कभी इन गुणों में से किसी में सुधार करने के लिए नेतृत्व। कुछ चक्रीय पेप्टाइड्स लक्षित रिसेप्टर्स द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं कर रहे हैं कि रचना में परिणाम कर सकते हैं (उदाहरण के लिए 92,93) इसलिए, चक्रीय पेप्टाइड्स के एक केंद्रित पुस्तकालय bioactivity के लिए स्क्रीन करने के लिए आवश्यक है। अंत में, सिंथेटिक चक्रीय पेप्टाइड्स, वांछनीय औषधीय विशेषताओं का प्रदर्शन कोशिका झिल्ली को पार करने के लिए काफी छोटे हैं, और उच्च चयनात्मकता है करने के लिए काफी बड़े हैं। उच्च शक्ति, विशिष्टता, और सुरक्षित प्रोफ़ाइल दवा उम्मीदवार के रूप में चक्रीय पेप्टाइड्स 'वादा करने के लिए योगदान करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए लॉरेन वान Wassenhove, Sunhee ह्वांग, और दारिया Mochly-रोजेन धन्यवाद। funders के अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी NQ के लिए काम स्वास्थ्य अनुदान एनआईएच RC4 TW008781-01 सी आइडिया (चिंगारी) के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic.
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials - micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
Nitrogen cylinder
Desiccator
Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).
Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).

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