Разработка Backbone циклический пептид библиотека как потенциал Противопаразитарные терапии Использование микроволнового облучения

1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Белок-белковые взаимодействия (ИПП) принимают непосредственное участие почти во всех биологических процессов и связан со многими заболеваниями человека. Таким образом, есть серьезные усилия, чтобы цель ИЦП в области фундаментальных исследований, так и в фармацевтической промышленности. Белок-белковые интерфейсы, как правило, большие, плоские, и часто не хватает карманов, усложняя открытие малых молекул, которые нацелены на такие сайты. Альтернативные подходы в отношении использованием антител имеют ограничения из-за плохого пероральной биодоступности, низкая клеток проницаемости и неэффективности производства.

Использование пептидов целевой PPI интерфейсы имеет несколько преимуществ. Пептиды имеют более высокую гибкость, конформационные повышенной селективности и, как правило, недороги. Тем не менее, пептиды имеют свои собственные ограничения в том числе плохой стабильности и неэффективность пересечения клеточных мембран. Чтобы преодолеть эти ограничения, пептид циклизации может быть выполнена. Циклизация было продемонстрировано, чтобы улучшить селективность пептид, Метаболическую стабильность, и биодоступность. Тем не менее, предсказания биологически активный конформацию циклического пептида не является тривиальной. Чтобы преодолеть эту проблему, одна подход привлекательным оно для скрининга библиотеки сфокусированный на экране, в котором все магистральные циклические пептиды имеют одинаковую первичную последовательность, но отличаются параметров, влияющих свою конформацию, таких как размер кольца и положении.

Мы описываем подробный протокол для синтеза библиотеку магистральных циклических пептидов, ориентированные на конкретные паразитов ИЦП. Использование рационального подхода к проектированию, мы разработали пептидов, полученных из леса белка L eishmania рецептора активированной киназы С-(отсутствие). Мы предположили, что последовательности в отсутствии, что сохраняющиеся в паразитов, но не в хозяина млекопитающего гомолога, может представлять сайты взаимодействия для белков, которые имеют решающее значение для жизнеспособности паразитов. Циклические пептиды были синтезированы с использованием микроволнового излучения, чтобы уменьшить время реакции и повыситьЭффективность. Разработка библиотеки системообразующих циклических пептидов с различными размерами кольца облегчает систематическое экран для наиболее биологически активной конформации. Этот метод обеспечивает общий, быстрый и легкий путь к синтезу циклических пептидов.

Introduction

Белок-белковые взаимодействия (ИПП) играют ключевую роль в большинстве биологических процессов, от внутриклеточного передачи сигнала к гибели клеток 1. Следовательно, ориентации ИЦП имеет фундаментальное значение для фундаментальных исследований и терапевтического применения. ИПП может регулироваться конкретных и стабильных антител, но антитела дорого и сложно в изготовлении и имеют низкую биодоступность. Кроме того, ИПП может быть мишенью малых молекул. Малые молекулы легче синтезировать и недороги по сравнению с антителами; Однако, они относительно менее гибким и подходит лучше небольших полостей, чем крупные белок-белковых интерфейсов 2,3. Различные исследования показали, что пептиды, которые проще и дешевле, чем антитела и более гибким, чем малые молекулы, могут связываться белковые интерфейсы ИПП и регулировать 4,5. Глобальный рынок терапевтический пептид был оценен примерно пятнадцать миллиардов долларов в 2013 году и растет на 10,5% однолетнийLLY 6. Кроме того, есть более чем 50 продаются пептиды, около 270 пептидов в различных фазах клинических испытаний, и около 400 пептидов в передовых доклинических стадиях 7. Несмотря на многочисленные пептиды используются в качестве лекарственных средств, пептиды по-прежнему представляют несколько проблем, которые ограничивают их широкое применение в том числе плохой биодоступности и стабильности, неэффективности пересечения клеточных мембран, и конформационной гибкости 8,9. Один из вариантов для преодоления этих недостатков является применение различных модификаций, таких как местные (D-аминокислоты и N-алкилирования) и глобальных (циклизации) ограничений 8,10-12. Эти модификации также происходят естественно. Например, циклоспорин А, иммунодепрессант циклический пептид естественно, содержит один D-аминокислоты и подвергается N-алкилирования модификации 13,14.

Модификация природных аминокислот, чтобы вызвать локальные ограничения, такие как D- и N-алкилированием, часто влияет на пептид9, S биологической активности. Тем не менее, циклизация, в котором последовательность интерес может оставаться таким же, скорее всего, чтобы сохранить биологическую активность. Циклизация является весьма привлекательным способом ограничить пептид конформационные пространство за счет уменьшения равновесие между различных конформаций. Это увеличивает биологическую, как правило, активность и селективность путем ограничения пептид в активной конформации, который опосредует только одну функцию. Циклизация также улучшает стабильность пептида, сохраняя пептид в конформации, которая меньше признанной ферменты, разрушающие. Действительно, циклические пептиды были показаны улучшились метаболическую стабильность, биодоступность, и селективность по сравнению с их аналогами линейных 15-17.

Тем не менее, циклизация может быть обоюдоострым мечом, так как в некоторых случаях ограничение может предотвратить пептидов от достижения биологически активный конформацию. Чтобы преодолеть это препятствие, сфокусированный библиотеку, в которой все пептиды в ту же основную sequencе и, следовательно, постоянные фармакофоров могут быть синтезированы. Пептиды в библиотеке отличаются параметрами, которые влияют на их структуру, таких как размер и положение кольца, для того, чтобы впоследствии скрининга наиболее биоактивного конформации 9,18.

Пептиды могут быть синтезированы как в растворе и пептидного синтеза в твердой фазе (SPPS) подхода, который в настоящее время является более распространенным подходом синтез пептидов и будет обсуждаться дальше. SPPS представляет собой процесс, посредством которого химические превращения выполняются на твердой подложке через линкер подготовить широкий спектр синтетических соединений 19. SPPS позволяет их установку пептиды путем последовательного сцепления аминокислот ступенчатым образом от С-конца, который прикреплен к твердой подложке, на N-конце. N-альфа-аминокислот, боковые цепи должен быть экранирован защитных групп, которые стабильны в условиях реакции, используемых при удлинении пептида, чтобы обеспечить добавление одной аминокислоты на стер. На заключительном этапе, пептид высвобождается из смолы и боковой цепью защитные группы удалены одновременно. В то время как пептид синтезируют, все растворимые реагенты могут быть удалены из пептида-твердой подложке матрицы путем фильтрации и смыл в конце каждой стадии связывания. При такой системе, большой избыток реагентов при высокой концентрации может управлять реакции сочетания к завершению, и все стадии синтеза могут быть выполнены в том же сосуде без переноса материала 20.

Хотя SPPS имеет некоторые ограничения, такие как производство неполных реакций, побочных реакций, нечистых реагентов, а также трудности мониторинга реакции 21, преимущества SPPS сделали его "золотым стандартом" для синтеза пептидов. Эти преимущества включают в себя опцию, чтобы включить ненатуральных аминокислот, автоматизация, простое очищение, свернутые физические потери, и использование избытка реагентов, в результате чеговысокие урожаи. SPPS было показано быть чрезвычайно полезным в синтезе сложных последовательностей 21,22, флуоресцентные модификаций 23 и пептидных библиотек 24,25. SPPS также очень полезно для других узлов поли-цепи, такие как олигонуклеотиды, олигосахариды 26,27 28,29, и пептидных нуклеиновых кислот 30,31. Интересно, что в некоторых случаях, SPPS было показано, что выгодно для синтеза малых молекул, которые традиционно изготавливают в растворе 32,33. SPPS используется как в небольших масштабах для научных исследований и преподавания 34,35, а также больших масштабах в промышленности 36-38.

Две стратегии синтеза, которые используются главным образом в методологии SPPS для синтеза пептидов бутилоксикарбонил (Вос) и 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc). Оригинальный стратегия введена SPPS был Вос, что требует условий сильной кислотой, чтобы удалить боковые защитные группы и отщепления пептида с RЕсин. Fmoc-пептид на основе синтеза, однако, использует умеренные базовых условий и является более мягким альтернативой кислотно-лабильных Boc протокола 39. Стратегия Fmoc использует мультиплексирование с ортогональным трет-бутил (TBU) защиту боковой цепи, который удаляется на последней стадии синтеза, а отщепление пептида от смолы в кислых условиях.

Общий принцип синтеза пептидов на твердом носителе представлена ​​на Рисунке 1. Исходное аминокислоты, маскируется временной защитной группы на N-альфа-конце, загружают на смоле от С-конца. Полупостоянная защитную группу, чтобы замаскировать боковую цепь также используется, если необходимо (Рисунок 1, Шаг 1). Синтез целевого пептида собран из С-конца к N-концу с помощью повторяющихся циклов снятия защиты с N-α-временного защитной группы (рисунок 1, шаг 2) и соединительных следующего защищенной аминокислоты (рис 1 Онг> Шаг 3). После последнего аминокислота загружен (Рисунок 1, Шаг 4), пептид отщепл ют от полимерной подложки и полупостоянных защитные группы удаляют (рис 1, Шаг 5).

Рисунок 1
Рисунок 1. Общая схема твердофазного пептидного синтеза. N-α-защищенной аминокислоты закреплена с помощью карбоксильной группы с помощью линкера к смоле (стадия 1). Желаемый пептид, собраны в линейном виде с С-конца к N-концу повторяющихся циклов снятия защиты с временной защищающей группой (ТПГ) из N-альфа (шаг 2) и соединением аминокислот (шаг 3). После выполнения синтез (шаг 4), то полу-постоянные защитные группы (SPG) снимают защиту во время расщепление пептида (шаг 5).получить = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

После сборки полного пептидной цепи, циклизация может быть достигнуто путем нескольких альтернатив: (А) с головы до хвоста циклизации - это удобный способ, но ограничена, поскольку она обеспечивает только один вариант для циклизации (рис 2А), (б) циклизация с использованием аминокислот из последовательности интерес, которые содержат биологически активные функциональные группы - однако, использование этих аминокислот могут влиять на биологическую активность (Фигура 2В), и (с) циклизацию добавлением аминокислот (или другие строительные блоки), не нарушая биоактивный последовательность. Введение этих молекул широко, как это позволяет производить ориентированных библиотек, не изменяя последовательность интерес (фиг.2с).

фигура 2
F2. Альтернативный igure пептид циклизации стратегии (А) голова к хвосту циклизации, через пептидную связь между С-концом и N-концом. (Б) циклизации между функциональными группами, такими как дисульфидной связи между остатками цистеина (1) или амидной связи между боковыми цепями лизина к аспарагиновой кислоты / глутаминовой (2), или боковой цепи, чтобы N- или С-конца (3 -4); (С) циклизация путем добавления дополнительных аминокислот или производных аминокислот или небольших молекул, например, перед (R0) и после (R7) биологически активное последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Микроволновая печь-помощь синтеза использует микроволнового излучения для нагрева реакции, тем самым ускоряя органических химических превращений 40,41. Микроволновая химия основана на способности реагента / растворитель, чтобы поглотитьмикроволновая энергия и конвертировать ее в тепло 42. Перед технология получила широкое распространение, основные недостатки пришлось преодолеть, в том числе управляемости и воспроизводимости протоколов синтеза и отсутствие доступных систем для адекватных температуры и давления управления 43,44. Первый доклад СВЧ-помощь синтеза пептидов проводили с использованием кухня микроволновая синтезировать несколько коротких пептидов (7-10 аминокислот) со значительным улучшением эффективности связи и чистоты 45. Кроме того, микроволновая энергия была показана для уменьшения агрегации цепи, уменьшить побочные реакции, ограничить рацемизацию, и улучшить сцепные ставки, которые все решающее значение для сложных и длинных последовательностей 46-53.

В настоящее время применение микроволнового облучения для синтеза пептидов или родственных соединений на твердой подложке, весьма обширен, в том числе (а) синтеза в воду вместо органического растворителя 54; (В) Синтез пептидов собщие пост-трансляционной модификации, такие как гликопептиды 55-58 или 59-61 фосфопептиды, синтез, как правило, затруднено из-за низкой эффективности связывания стерически затрудненных производных аминокислот; (С) Синтез пептидов с модификацией в основной цепи, например, azapeptides, которые могут быть образованы путем замены C (A) от аминокислотного остатка с атомом азота, 62 или пептоиды, чей боковой цепи соединен с Амид азота, чем атома Cα 63,64; (D), синтез циклических пептидов 65-71; и (Е) Синтез комбинаторных библиотек 51,72. Во многих случаях, авторы сообщили более высокую эффективность и сокращение времени синтеза с использованием микроволнового излучения, по сравнению с обычным протоколом.

Использование рациональную конструкцию 73-75, мы разработали анти-паразитарные пептиды, которые были получены от рецептора эшафот L eishmania в FOг активированного C-киназы (отсутствие). ОТСУТСТВИЕ играет важную роль в ранней фазе инфекции Leishmania 76. Паразиты, выражающие более низкие уровни отсутствия не паразитируют даже ослабленным иммунитетом мышам 77, как отсутствие участвует в основных паразитов сигнализации процессов и синтеза белка 78. Таким образом, не хватает ключевой белок эшафот 79 и ценным объектом наркотиков. Сосредоточение внимания на последовательностях в отсутствии которые сохраняются в паразитов, но не в принимающей млекопитающих гомологов RACK, мы определили пептид 8 аминокислот (RNGQCQRK), что снижение Leishmania зр. Жизнеспособность в культуре.

Здесь мы описываем протокол для синтеза циклических пептидов магистральных, полученных из последовательности белка ОТСУТСТВИЕ описанной выше. Пептиды были синтезированы на твердой подложке с использованием микроволнового нагрева с помощью методологии SPPS с протоколом Fmoc / Tbu. Пептиды, конъюгированный с ТАТ пептид 47-57 (YGRKKRRQRRR) несущей посредством амидной связи, какчасть SPPS. ТАТ на основе транспорт различных грузов в клетки был использован для более чем 15 лет и доставка груза в субклеточных органелл была подтверждена 80. Четыре различных линкеров, янтарная и глутаровый ангидрид, а также адипиновой кислоты и пимелиновой, были использованы для выполнения циклизации генерировать линкеров карбоновых кислот от двух до пяти атомов углерода. Циклизация было сделано с использованием микроволновой энергии и окончательные расщепления и боковой цепи шаги снятия защиты проводили вручную без микроволновой энергии. Применение автоматизированной микроволновой синтезатора улучшило чистоту продукта, увеличение выхода продукта и снижение продолжительности синтеза. Этот общий протокол может быть применен к другим исследований, которые используют пептиды, чтобы понять важную молекулярный механизм в пробирке и в естественных и дальнейшее развитие потенциальных лекарственных препаратов для человека заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Оборудование и реактивы Подготовка

  1. Подготовка оборудования
    1. Выполните все шаги внутри вытяжного шкафа с использованием надлежащего средства индивидуальной защиты.
    2. Химически синтезируют пептиды на твердом носителе с использованием микроволновой печью синтезаторе пептидов с дополнительным модулем Discover, снабженный волоконно-оптического датчика температуры для управления микроволновой подачу питания в тефлоновый реактор (30 мл, со стеклянной фритты) или в одноразовую полипропилена Картридж (12 мл, с грубой фритты).
    3. Для правильного смешивания, подключиться азота в реакционный сосуд, или в качестве альтернативы уплотнение обоих концов полипропиленовой картриджа, и поместить на роторной качалке.
    4. Для слива реакционных смесей или моет, подключиться к вакуумом через ловушку отходов.
    5. Поместите оптоволоконного зонда в реакционный сосуд.
  2. Подготовка реагентов
    1. Подготовка смолы путем взвешивания Каток Амид AM смолы 100-200 меш (0,204 мг), Добавляют 5 мл 1: 1 смеси N, N-диметилформамиде (ДМФ) / дихлорметан (ДХМ), в реакционный сосуд / полипропилена картриджа для промывки смолы вниз, встряхивают в течение 2-4 ч, чтобы должным образом набухают, и слейте.
    2. Готовят 0,2 М 9-флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc) амино кислотных растворах при растворении соответствующего Fmoc-аминокислоты в ДМФ и вихрь смеси до аминокислоты не растворятся (таблица 1).
    3. Готовят 0,45 М раствор активатора смесь растворением 18,96 г О - (бензотриазол-1-ил) - N, N, N ', N' -tetramethyluronium гексафторфосфат (HBTU) в 100 мл ДМФ и встряхиванием смеси, пока твердое вещество растворяют (табл 1).
    4. Подготовьте 2 М активатора базовую смесь раствор путем объединения 34,8 мл N, N-диизопропилэтиламин (DIEA) с 65,2 мл 1-метил-2-пирролидинона (NMP) (Таблица 1).
    5. Готовят 0,1 М раствора смеси снятия защиты путем растворения 3,37 г 1-гидроксибензотриазола (HOBt)в 250 мл 20% о / о раствор пиперидина в ДМФ и встряхиванием смеси, пока твердое вещество растворяют (таблица 1).

2. Fmoc-защищенных аминокислот Муфта

  1. Связь аминокислот
    1. Добавить аминокислоту (2,5 мл) / активатор (1 мл) / активатор базу (0,5 мл) в реакционный сосуд / полипропилена картриджа и пусть реакция протекать в течение 300 сек (25 Вт, 75 ° C, таблица 2). Слейте раствор.
    2. Вымойте смолы с ДМФ. Добавить DMF к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите пять раз.
  2. Фмок снятие защиты
    1. Добавить 7 мл 20% пиперидина в ДМФА с 0,1 М HOBt в реакционный сосуд / полипропилен картриджа и инкубируют в течение 30 сек (45 Вт, 75 ° C, таблица 2).
    2. Слейте реакционной смеси.
    3. Добавить 7 мл 20% пиперидина в ДМФА с 0,1 М HOBt в реакционный сосуд / полипропилен картридж и инкубировать в течение 180 сек (45 Вт, 75 ° С, Таблица 2).
    4. Слейте реакционной смеси.
    5. Вымойте смолы с ДМФ. Добавить DMF к смоле для 120 сек (7 мл 0 W, R) и слейте раствор. Повторите пять раз.
      Примечание: При желании, приостановить процедуру здесь и возобновить на более поздний срок.
  3. После этапа аминокислоты связи, мыть смолы с DCM и магазин по крайней мере несколько дней при 4 ° С (в течение более длительного периода хранения смолы в - 20 ° С).
    1. Перемещение смолы из реакционного сосуда в полипропиленовую картриджа.
    2. Вымойте смолы с DCM. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.
    3. Печать полипропиленовой картридж плотно с верхней крышки и кран.
    4. Перед началом нового синтеза, набухание смолы в течение 3-4 ч в ДМФ (7 мл).
  4. Мониторинг синтез
    1. С помощью теста Кайзера (нингидриновый) или тест хлоранила быстро определить ход выполнениясинтез. При желании, выполнить мелкого реакции расщепления для определения чистоты и массы синтезированного пептида. Смотрите раздел 9.
      Примечание: Для дальнейшего поиска неисправностей см таблицу 3.
  5. Повторите шаги 2.1 и 2.2, как требуется для синтеза пептида целевой: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. ангидрид / Кислота Сцепление

  1. Ангидрид
    1. Вымойте смолы с NMP. Добавить NMP к смоле для 120 сек (7 мл, 0 Вт, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.
    2. Растворить 10 эквивалентов соответствующего ангидрида в NMP (5 мл), добавляют 1 эквивалент 4-диметиламинопиридин (ДМАП) и 10 эквивалентов DIEA к решению (таблица 1).
    3. Добавить 10: 1: 10 смесь ангидрида / DMAP / DIEA к смоле и инкубировать в течение 300 сек (25Вт, 75 ° С, Таблица 2). Слейте раствор.
    4. Вымойте смолы с NMP. Добавить NMP к смоле для 120 сек (7 мл, 0 Вт, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.
  2. Кислота связь
    1. Вымойте смолы с ДМФ. Добавить DMF к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.
    2. Растворить 10 эквивалентов соответствующего дикарбоновой кислоты в ДМФА (5 мл). Добавить 1 эквивалент DMAP и 10 эквивалентов N, N 'диизопропилкарбодиимид (DIC) в растворе (Таблица 1).
    3. Предварительно активировать смесь путем перемешивания в течение 30 мин.
    4. Добавьте смесь к смоле и инкубировать в течение 300 сек (25 Вт, 75 ° C, таблица 2) и слейте раствор.
    5. Вымойте смолы с ДМФ. Добавить DMF к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите шаг три раза.

4. N-метилтритила (МТТ) Защита в группах снятия защитыион

Примечание: боковую цепь лизина была защищена с N-метилтритила (МТТ) 81, защитной группой, которая может быть удалена избирательно в кислых условиях лабильных 82,83. Снятия защиты Mtt защитную группу вручную в шейкере без микроволновой энергии.

  1. Передача смолы в полипропиленовую картриджа, снабженный крышкой и краном вилки.
  2. Вымойте смолы с DCM. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.
  3. Добавить 15-25 мл смеси 1% трифторуксусной кислоты (TFA), 5% триизопропилсилана (TIS), и 94% DCM в полипропиленовой картриджа на один грамм смолы.
    Примечание: ТФК является сильной кислотой и коррозионными и чрезвычайно раздражает кожу, глаза и легочной ткани.
    1. Держите концентрированные растворы ТФК в капюшоне на все времена.
    2. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (защитные очки, халате и перчатки) и работу в хорошо проветриваемом шкафу. Изменение перчатки Незамедлительноесли они вступают в контакт с ТФК и сразу очистки любых разливов. Если кожа или глаза вступают в контакт с кислотой, промойте пораженный участок промыть водой и вымыть за 15 мин.
  4. Поместите картридж полипропиленовый на шейкере и встряхивают в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Слив раствора из полипропилена картриджа с применением вакуума.
  6. Повторите шаги 4.3-4.5, три раза.
  7. Вымойте смолы с DCM. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите пять раз.

5. Циклизация линейный пептид

  1. Вымойте смолы с DCM. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите пять раз.
  2. В 50 мл полипропиленовую трубку, растворить 5 эквивалентов бензотриазол-1-окси-лы-трис-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (РуВОР), в дибромметане (дБм, 5 мл) и добавления 10 эквивалентов DIEA в раствор (таблица 1).
  3. C, таблица 2). Слейте раствор.
  4. Вымойте смолы с DCM. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.

6. Расщепление и Снятие защиты боковой цепи групп

  1. Промыть смолу ДХМ и диэтиловым эфиром.
    1. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите два раза.
    2. Добавить диэтиловый эфир к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите два раза.
  2. Сушат смолы в вакуумном эксикаторе при комнатной температуре в течение по крайней мере 3 ч в течение гидроксида калия (КОН, 1-10 г).
  3. Взвешивание высушенного полимера и перенести его на полипропиленовую картриджа.
  4. Добавить 10 мл предварительно охлажденного кислоты (TFA) коктейль трифторуксусной расщепления (например, 90% ТФК, 2,5% воды, 2,5% TIS и 5% фенола) к каждому один грамм смолы.
  5. Встряхнуть в течение 3 часовпри комнатной температуре.
  6. Собирают раствор TFA расщепления путем фильтрации смолы в 50 мл полипропиленовую пробирку. Для фильтрации, использовать фритты, который находится в полипропиленовой картриджа 12 мл.
  7. Добавить холодного диэтилового эфира (35 мл) в трубке.
  8. Центрифуга течение 5 мин при 1,207 мкг при 4 ° С.
  9. Декантировать Эфирный слой.
  10. Повторите Шаг 6,7-6,9, в пять раз.

7. Сушка Backbone циклический пептид

  1. Хранить осажденного пептида в той же трубе, и высушить его в вытяжном шкафу в течение 30 мин.
  2. Растворить пептид в смеси 1: 1 воды и ацетонитрила (ACN).
  3. Замораживание окончательное решение продукта в жидком азоте.
  4. Лиофилизацией конечного продукта.

8. Характеризуя Backbone циклический пептид

  1. Растворите небольшой образец (1 мг) продукта в воде (400 мкл).
  2. Вводите растворенного пептида (10-200 мкл) с обращенной фазой высокоэффективной жидкостной chromatograpHY (ОФ-ВЭЖХ) Система для проверки чистоты пептида 34.
  3. Проверить массу пептида помощью масс-спектрометрии матрично-лазерной десорбцией ионизации (MALDI-MS) 84.
    1. Смешайте 1 мкл (100 мкмоль) пептида в 1: 1 (объем / объем) смеси ацетонитрил: вода с 1 мкл матрицы (5 мг / мл, α-циано-4-гидроксикоричной кислоты) в соотношении 1: 1 (об / объем) смесь ацетонитрила: воды с ТФУ (0,1%).
    2. Пятно 1 мкл на МС-MALDI пластины.
    3. Высушите образец и поместите его в масс-спектрометре.
  4. Взвесить пептид и рассчитать процентный выход.
  5. Хранить при -20 ° C.

9. Мониторинг Синтез

  1. Кайзер (нингидриновый) Тест 85
    1. Подготовка реагентов решения.
      1. Получают раствор А путем растворения 16,5 мг калия цианида (KCN) в 25 мл дистиллированной воды. Развести 1 мл вышеуказанного раствора с 49 мл пиридина.
      2. Приготовьте раствор Bрастворением 1 г нингидрина в 20 мл этанола.
      3. Готовят раствор С растворением 40 г фенола в 20 мл этанола.
    2. С помощью теста Кайзера для проверки завершения связи аминокислот или снятия защитной группы.
      1. Передача несколько бусин из смолы в пробирку.
      2. Добавить три капли (~ 100 мкл) каждого раствора (А, В и С) и перемешать.
      3. Нагреть пробирку на нагревательном блоке при 110 ° С в течение 5 мин.
        Примечание: синие шарики (положительный результат) указывают неполное реакции сочетания или снятие защиты Fmoc защитной группы.
  2. Хлоранил тест 86
    1. Подготовьте следующие реагенты свежие для каждого теста.
      1. Готовят раствор 2% Хлоранил в ДМФА, раствор А.
      2. Готовят раствор 2% ацетальдегида в ДМФА, раствор Б.
    2. Проводят исследование Хлоранил проверки завершения сцепления аминокислоты или тон снятия защитной группы.
      1. Смешайте 100 мкл раствора А 100 мкл раствора В в 1,5 мл пробирку.
      2. Бросьте шарики в и осторожно встряхните в течение 5 мин.
        Примечание: темно-коричневого цвета шарики (положительный результат) указывают снятия защитной группы Fmoc или неполной реакции сочетания.
  3. Реакция расщепления Мелкомасштабное
    1. Удалить небольшое количество смолы на 3 мл полипропиленовую картриджа, снабженный крышкой и краном вилки.
    2. Рассматривать с 2 мл смеси 95% TFA, 2,5% воды и 2,5% TIS.
    3. Встряхнуть смесь в течение 30 мин при комнатной температуре.
    4. Удаления смолы фильтрованием, использу фритты полипропилена картриджа и выпаривают растворители потоком азота.
    5. Остаток растворяют в воде и анализируют с помощью ВЭЖХ продукта и / или МС.

10. Лейшмания donovani промастиготы Жизнеспособность в культуре анализе

    <LI> Лейшмания donovani (Л. donovani) роста и лечения условия
    1. Культура Л. donovani promastigotes в модификации Дульбекко из Орла Medium (DMEM) с 4,5 г / л глюкозы, L-глютамина, пируват натрия и в 26 ° C.
    2. Лечить L. donovani promastigotes с циклическими пептидами (100 мкМ) в течение 24 ч при 26 ° С.
  1. Лейшмания donovani (Л. donovani) жизнеспособность анализ
    1. Оценка жизнеспособности паразитов с 20 мкл AlamarBlue в соответствии с протоколом производителя.
    2. Определить снижение AlamarBlue по измерения флуоресценции (при 570 нм и возбуждении 590 нм эмиссии). Более высокие значения флуоресценции указывают большую активность метаболизма и увеличение жизнеспособности паразитов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы опишем развитие целенаправленной небольшой библиотекой системообразующих циклических пептидов, которые специфически целевым жизненные ИЦП паразита Leishmania и действовать в качестве противопаразитарных средств (для обзора о пептидов, которые нацелены на ИЦП в качестве противопаразитарных средств 87). Через синтез новых магистральных циклических пептидов, фармакофоров сохраняются в помосте выдвижной размера. Сила сфокусированного библиотеки предлагаемого здесь является возможность варьировать размеры пептид строительных лесов, позволяя ограниченную степень конформационной свободы через циклизации. Весь синтез пептидов магистральных циклических было сделано с использованием автоматического синтезатора микроволновой на твердом носителе, в соответствии с протоколом Fmoc / Tbu. Циклизация проводили путем создания амидной связи между линкером, ангидрид кислоты / и боковой цепи лизина амина. Окончательный раскол и боковой цепи снятие защиты осуществляется вручную, без микроволновой энергии (схемы синтеза и FСтруктура Инал продукты рисунок 3). Продукт анализировали с помощью препаративной ВЭЖХ до получени 25 мг белого порошка хранили при -20 ° С. Образец продукта была проверена с помощью МС (фиг.4) и его степень чистоты была определена с использованием аналитической ВЭЖХ (фиг.5). Образец каждой циклического пептида был отправлен на биологического скрининга. Один из четырех циклических пептидов (PL1) был активен в отношении Leishmania donovani (Л. donovani), паразита, вызывающего висцерального лейшманиоза, наиболее серьезные лейшманиоз у человека. Пептид PL1 снижается жизнеспособность паразита на 75% по сравнению с контрольной обработки (таблица 4).

Рисунок 3
Рисунок 3. Схема синтеза и структура основной цепи пептида, синтезированного циклического в этом исследовании Реагенты и условия:. (I) Аминокислотный муфты: 300 сек, 25 Вт, 75 ° С,используя 1,1: 1: 2,2 / аминокислотный активатор / активатор базу. (II) удаление защитной группы Fmoc: 30 сек и 180 сек и при 45 Вт, 75 ° C, с использованием 20% пиперидина в DMF + 0,1 М HOBt. (III) ангидрид: 300 сек, 25 Вт, 75 ° С, с использованием 10: 10: 1 ангидрида / DIEA / DMAP в NMP. (IV) Mtt снятие защиты: 3 * (300 сек, 0 Вт, RT) с помощью 1: 5: 94 / TFA / DCM ТИС. (v) Циклизацию: 300 сек, 25 Вт, 75 ° С, используя 5:10 PYBOP / ДИЭА в DBM. (VI) Расщепление и снятие: 3 ч, 0 Вт, RT, используя 90: 2,5: 2,5: 5 ТФК / ТИС / H 2 O / фенол. Пептиды, конъюгированный с ТАТ 47-57 (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) пептида-носителя посредством амидной связи в рамках синтеза твердой фазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. MALDI-TOF масс-спектроскопия следПредставитель основой циклический пептид. Наблюдаемый масса, 2853.456 находится в непосредственной соглашения к вычисленной массе, 2854.271. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Аналитический ВЭЖХ с обращенной фазой след представителем магистральной циклического пептида. В аналитической ВЭЖХ следы сырой нефти (А) и очищенного (B) магистральной циклического пептида показаны. Системы растворителей были использованы A (H 2 O с 0,1% TFA) и B (CH 3 CN с 0,1% TFA). Линейным градиентом 5-50% В в 1 мл / мин в течение 15 мин при 40 ° С с С18, 5 мкм, 150 мм колонка была применена и детектирование при 215 нм. Пожалуйста, нажмите здесьЧтобы смотреть большую версию этой фигуры.

Решение Реагент МВт (г / моль) d (г / мл) Объем (мл) Концентрация (М) Итого
- Аминокислотный раствор - Аминокислота аланин 311,34 0,2 6,23 г
0,2 М аминокислоты в ДМФ ДМФ 100 100 мл
Примером аланин аминокислоты, но в то же расчета должно быть сделано для каждой аминокислоты с соответствующим МВт. Для приготовления раствора 100 мл аминокислота растворяется 6,23 г аминокислоты аланина в 100 мл ДМФ. Хранить при 4 ° С.
- Снятие защиты решение- HOBt 135,1 0,1 3,37 г
20% о / о раствор пиперидина в ДМФА с 0,1 М HOBt Пиперидин 50 50 мл
ДМФ 200 200 мл
Снятие защиты используется для удаления Fmoc N альфа - защитную группу. Чтобы приготовить раствор 250 мл удаление защитной группы растворяются 3,37 г HOBt в 200 мл ДМФ и добавляют 50 мл пиперидина. Хранить при 4 ° С.
- Активатор решение - БТУГ 379,24 0,45 18.96 г
0,45 М HBTU в DMF ДМФ 100 100 мл
Активаториспользуется с активатором базы для активации аминокислоты перед реакцией сочетания. Чтобы приготовить раствор активатора 100 мл растворить 18,96 г HBTU в 100 мл ДМФ. Хранить при 4 ° С.
- Активатор раствор основания - ДИЭА 129,24 0,742 2 34.80 мл
2 М ДИЭА в NMP НМП 65.20 мл
Активатор основание используют с активатором, чтобы активировать аминокислоту перед реакцией сочетания. Для подготовки 100 мл активатора базовой смеси РЕШЕНИЕ 34,8 мл DIEA и NMP 65,2 мл. Хранить при 4 ° С.
Решение Реагент МВт (г / моль) d (г / мл) Объем (мл) Уравнение Итого
Ангидрид решение - 10: 1: 10 ангидрида / DMAP / DIEA в NMP Глутаровая / янтарного ангидрида 114,1 / 100,07 10 0.11 / 0.10 г
ДМАП 122,2 1 0,01 г
ДИЭА 129,24 0,742 10 0,09 мл
НМП 5 5 мл
Растворить 0,11 / 0,10 г глутарового ангидрида / янтарная в 5 мл NMP, добавить 0,01 г ДМАП и 0,09 мл DIEA в раствор. Подготовка свежий раствор.
Раствор кислоты - 10: 1: 10 кислота / DMAP / DIC в ДМФА Адипиновой / пимелиновой кислоты 146,14 / 160,17 10 0,15 / 0,16 г
ДМАП </ TD> 122,2 1 0,01 г
ДВС 126,2 0,806 10 0,16 мл
ДМФ 5 5 мл
Растворить 0,15 / 0,16 г адипиновой кислоты / пимелиновой в 5 мл ДМФ, добавляют 0,01 г ДМАП и 0,16 мл ДИК к раствору. Подготовка свежий раствор.
Циклизация решение - 5:10 РуВОР / ДИЭА в DBM РуВОР 520,3 5 0,26 г
ДИЭА 129,24 0,742 10 0,09 мл
DBM 5 мл 5 мл
Растворить 0,26 г PyBOP в 5 мл DBM и добавить 0.09 мл DIEA в раствор. Подготовитьсвежий раствор.

Таблица 1. Реагенты и растворы для магистральной циклического синтеза пептидов. Список решений и реагентов для синтеза обеспечивается.

Микроволновая печь цикл Мощность (Вт) Температура (° С) Время (сек)
1 Соединительная аминокислоты 25 75 300
2 Снятие защиты Fmoc защитной группы (а) Исходное снятие защиты 45 75 30
(б) Полное снятие защиты 45 75 180


Таблица 2. Микроволновая печь циклов для сцепления и снятия. Микроволновая печь циклыМуфта аминокислоты и Fmoc-снятия защиты. (1) Соединение аминокислот. (2) Снятие защиты маскирующего группы Fmoc делается в два этапа: (а) начального и (б) полное удаления защитных групп.

Проблема Возможная причина Решение
Kaiser или хлоранила тесты положительны после сцепления аминокислоты Муфта аминокислота является неполным Повторите стадии конденсации
Пептиды не эффективно отделены от супернатанта Избыточное количество ТФК Выпаривают образце с помощью потока азота
Наличие делеции последовательностей в продукте Фмок удаление является неполным Монитор снятие защиты Кайзер или хлоранила испытаний и / или малого масштаба расщепления, в случае удаления Fmoc неполная повторите шаг
Аминокислота couplING является неполным Монитор муфту Кайзер или хлоранила испытаний и / или малого масштаба расщепления, в случае муфта аминокислота является неполным, повторите шаг и / или использовать более длительное время реакции

Таблица 3. Устранение неполадок совет Список решений для наиболее распространенных синтетических проблем предоставляется.

Пептид Последовательность N МИЗ. Кэл. МС обсерватория. ВЭЖХ Уступать Паразит жизнеспособность
PL1 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 2 2854.321 2853.456 98% 86% 25%
PL2 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 3 2868.348 98% 87% 100%
PL3 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 4 2882.375 2881.823 96% 89% 97%
pl4 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 5 2896.402 2895.603 97% 85% 98%

Таблица 4. Характеристика и биологическую активность пептидов в этом исследовании. П относится к числу метиленовых в алкильной спейсера (смотри рисунок 3 для структуры). МС проводили с помощью MALDI технику и чистоту определяли с помощью аналитической ВЭЖХ. Пептиды были добавлены к Leishmania donovani promastigotes и жизнеспособность паразитов оценивали и выражали в виде процента выживаемости по сравнению с контрольными культурами инкубировали в отсутствие пептида. Только PL1 была высокая Leishmanicidal деятельности. Наблюдательбыл ослеплен условиям эксперимента. Данные представляют из трех независимых экспериментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Синтез сфокусированного библиотеки магистральных циклических пептидов, полученных из-за отсутствия белка паразита Leishmania использованием полностью автоматизированной микроволновой синтезатор описано. Сосредоточенный библиотека циклических пептидов был разработан с консервативных фармакофоров и различных линкеров. Добавление различных линкеров, таких как глутаровый ангидрид, ангидрид янтарной кислоты, адипиновой кислоты, пимелиновой кислоты, лизин, орнитин и других строительных блоков могут быть использованы для расширения ассортимента конформационного пространства циклических пептидов. Синтез сфокусированного циклических пептидов библиотеки позволяет исследователям для выявления оптимального конформационного пространства. Поскольку конформация циклических пептидов варьирует в зависимости от таких параметров, как размер кольца и положение, различные аналоги с различных конформаций могут быть получены, которые могут быть полезны в биологической взаимосвязи структура-активность изучает 88.

Основной проблемой в SPPS в диагностике SYNThetic прогресс и решение проблем, так как не выделяют промежуточные. Таким образом, несколько колориметрических тестов могут быть использованы для мониторинга реакции, такие как те, которые идентифицируют свободные амины Кайзером и Хлоранил испытаний. Если тесты Kaiser или Хлоранил не указывают (например, пролин и гидрокси-пролин не реагируют с нингидрина таким же образом, как и другие аминокислоты, потому что их альфа-аминогруппа является частью пяти членного кольца), реакция малого масштаба расщепления и Масс-спектрометрический анализ может быть применен для контроля синтеза прогресс.

Расщепление времени и коктейль отщепление может быть изменен на основе химических свойств и количества защитных групп, используемых. Рекомендуется, чтобы начальная пробная расщепления с помощью небольшого количества смолы (1-10 мг) выполняется для проверки соответствующих условий. Кинг и др. Проверили различных коктейлей расщепления для различных пептидов и их подробные рекомендации могут быть использованы для оптимизации reactioп. 89 условий Для магистральных циклических пептидов, инкубации в течение не менее 3 ч рекомендуется по умолчанию для полного расщепления. Однако пептиды, содержащие большое количество защитных групп или сложных защитных групп (например, трет-бутиловый эфир или пентаметил-2,3-дигидробензофуран-5-сульфонил) следует инкубировали в течение более длительного времени, чтобы обеспечить полное удаление защитных групп. Здесь мы не систематически исследовать оптимальное время расщепления или коктейль. Тем не менее, мы обнаружили, что короткий расщепления времени (менее 2 ч) в результате неполного расщепления некоторых защитных групп.

Стандартный протокол синтеза СВЧ-пептид является обычно применяются метод синтеза разнообразных пептидов. В большинстве случаев, использование автоматического синтезатора СВЧ сокращает продолжительность синтеза и увеличивает выход и чистоту продуктов. Кроме того, он уменьшает побочные реакции, такие как рацемизацией и aspartimide образования. Хотя мы не сделалибок-о-бок сравнение микроволновой печью и обычной синтеза в данном исследовании, основаны на нашем опыте и других лабораториях ", было показано, что использование микроволнового синтеза помощь превосходит обычного протокола 61,70. Почти все активаторы и смолы могут быть эффективно использованы в микроволновой SPPS и общий способ может быть также применен к синтезу различных модифицированные пептиды, такие как гликопептиды, фосфопептиды, azapeptides, пептоиды, и циклических пептидов 90.

Циклизация это удобный способ для повышения потенции и стабильности линейных предшественников. Циклические пептиды можно получить желаемый ограниченного конформацию, что может способствовать повышению аффинности связывания и селективности. Кроме того, линейные пептиды могут быть изменены, чтобы содержать несколько циклических петель, что позволяет им, возможно, цель несколько эндогенного белка обязательные интерфейсы 91. Тем не менее, важно отметить, что циклизацию не necessщика привести к улучшению во всех или иногда любое из этих свойств. Некоторые циклические пептиды может привести к конформации, которые не признаются целевыми рецепторами (например 92,93) .Therefore, сфокусированный библиотека циклических пептидов необходимо экране биологической. В заключение, синтетические пептиды обладают циклические желательные фармакологические свойства, достаточно малы, чтобы пересечь клеточную мембрану, и достаточно большой, чтобы иметь высокую селективность. Высокая эффективность, специфичность и безопасно профиль способствовать обещание циклических пептидов в качестве кандидатов наркотиков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Лорен Ван Wassenhove, Sunhee Хван, и Дарья Mochly-Розен за полезные обсуждения. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья Грант NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (СПАРК) для NQ Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic.
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials - micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
Nitrogen cylinder
Desiccator
Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).
Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450, (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
  3. Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5, (11), 797-807 (2009).
  4. Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochemistry. 37, (16), 5616-5622 (1998).
  5. Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282, (6), 4113-4123 (2007).
  6. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15, (1-2), 40-56 (2010).
  7. Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, American Chemical Society. 17-24 (2005).
  8. Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305, (5689), 1411-1413 (2004).
  9. Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10, (2), 256-266 (2008).
  10. Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6, (6), 872-877 (2002).
  11. Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21, (7), 512-523 (1982).
  12. Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24, (12), 1847-1852 (2003).
  13. Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochemistry. 30, (26), 6574-6583 (1991).
  14. Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116, (11), 1783-1799 (2015).
  15. Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O'Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61, (6), 287-297 (2003).
  16. Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121, (51), 12204-12205 (1999).
  17. Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274, (25), 17573-17579 (1999).
  18. Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6, (1), 99-104 (2004).
  19. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  20. Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using 'safety catch' methodology. J Vis Exp. (63), e4112 (2012).
  21. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2, (12), 3247-3256 (2007).
  22. Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91, (2), 157-168 (2009).
  23. Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based 'building block' approach. Nat. Protoc. 2, (12), 3210-3218 (2007).
  24. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  25. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126, (Pt 3), 789-802 (2013).
  26. Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11, (2), 203-216 (2008).
  27. Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9, (2), 169-185 (2009).
  28. Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446, (7139), 1046-1051 (2007).
  29. Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291, (5508), 1523-1527 (2001).
  30. Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3, (4), 646-654 (2008).
  31. Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1, (3), 175-183 (1995).
  32. Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90, (4), 526-536 (2008).
  33. O'Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10, (10), 857-876 (2007).
  34. Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84, (12), 1988-1991 (2007).
  35. Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79, (1), 85-86 (2002).
  36. Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis - A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13, (1-2), 75-82 (2007).
  37. Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2, (7), 587-593 (2003).
  38. Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29, (2), 4-7 (2011).
  39. Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37, (22), 3404-3409 (1972).
  40. Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27, (3), 279-282 (1986).
  41. Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27, (41), 4945-4948 (1986).
  42. Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5, (1), 51-63 (2006).
  43. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, (46), 6250-6284 (2004).
  44. de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34, (2), 164-178 (2005).
  45. Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57, (18), 4781-4784 (1992).
  46. Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20, (1), 1-47 (1991).
  47. Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27, (3), 213-224 (1998).
  48. Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11, (6), 762-770 (2008).
  49. Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5, (1), 39-50 (2010).
  50. Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2, (9), 2222-2227 (2007).
  51. Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2, (3), 624-631 (2007).
  52. Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13, (3), 143-148 (2007).
  53. Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
  54. Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11, (20), 4488-4491 (2009).
  55. Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13, (1-2), 203-208 (2007).
  56. Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7, (5), 877-880 (2005).
  57. Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8, (20), 4465-4468 (2006).
  58. Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71, (26), 9609-9621 (2006).
  59. Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12, (4), 349-357 (2006).
  60. Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14, (4), 387-392 (2008).
  61. Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85, (3), 300-305 (2014).
  62. Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7, (25), 5649-5652 (2005).
  63. Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4, (23), 4057-4059 (2002).
  64. Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7, (8), 1521-1524 (2005).
  65. Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51, (9), 2701-2707 (2008).
  66. Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75, (1), 40-50 (2010).
  67. Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131, (22), 7917-7927 (2009).
  68. Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
  69. Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10, (12), 2329-2332 (2008).
  70. Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14, (6), 683-689 (2008).
  71. Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2, (3), 281-283 (2004).
  72. Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127, (38), 13271-13280 (2005).
  73. Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20, (1), 25-33 (2009).
  74. Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28, (1), 14-16 (2010).
  75. Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7, (2), e87-e93 (2010).
  76. Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268, (5210), 563-566 (1995).
  77. Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198, (11), 1689-1698 (2003).
  78. Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6, (6), e20710 (2011).
  79. Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259, (3), 909-916 (1999).
  80. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13, (10), 443-448 (2007).
  81. Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45, (5), 488-496 (1995).
  82. Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60, (5), 300-303 (2002).
  83. Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6, (6), 264-270 (2000).
  84. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373 (2011).
  85. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34, (2), 595-598 (1970).
  86. Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33, (10), 763-766 (1979).
  87. Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32, (6), 62-66 (2014).
  88. Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39, (16), 3174-3178 (1996).
  89. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36, (3), 255-266 (1990).
  90. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41, (5), 1826-1844 (2012).
  91. Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28, (11), 2698-2709 (2008).
  92. Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58, (3), 246-256 (2001).
  93. Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52, (2), 83-90 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics