Ontwikkeling van een Backbone cyclisch peptide bibliotheek als potentieel antiparasitaire Therapeutics behulp van microgolfstraling

1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn nauw betrokken bij bijna alle biologische processen en zijn verbonden met vele menselijke ziekten. Daarom is er een grote inspanning om protonpompremmers in fundamenteel onderzoek en in de farmaceutische industrie richten. Eiwit-eiwit interfaces zijn meestal groot, plat, en vaak niet zakken, complicerende de ontdekking van kleine moleculen die dergelijke sites richten. Alternatieve targeting benaderingen met behulp van antilichamen hebben beperkingen als gevolg van slechte orale biologische beschikbaarheid, lage cel-permeabiliteit, en de productie inefficiëntie.

Met behulp van peptiden aan PPI interfaces doel heeft verschillende voordelen. Peptiden hebben hogere conformationele flexibiliteit, verhoogde selectiviteit en die in het algemeen goedkoop. Echter, peptiden hun eigen beperkingen waaronder slechte stabiliteit en inefficiëntie oversteken celmembranen. Om zulke beperkingen te overwinnen, kan peptide cyclisatie worden uitgevoerd. Cyclisatie werd aangetoond dat peptide selectiviteit te verbeteren, Metabolische stabiliteit en biobeschikbaarheid. Echter, het voorspellen van de biologisch actieve conformatie van een cyclisch peptide is niet triviaal. Om deze uitdaging te overwinnen, een aantrekkelijke benadering is om een ​​gerichte bibliotheek scherm waarin alle backbone cyclische peptiden hebben dezelfde primaire sequentie, maar verschillen in parameters die hun conformatie beïnvloeden, zoals de ring grootte en positie te screenen.

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de synthese van een bibliotheek van backbone cyclische peptiden gericht op specifieke parasiet PPI. Met behulp van een rationeel ontwerp aanpak, ontwikkelden we peptiden afgeleid van het schavot eiwit L eishmania receptor voor geactiveerde C-kinase (gebrek). Onze hypothese was dat sequenties in LACK die geconserveerd in parasieten, maar niet in de zoogdiergastheer homoloog kan interactieplaatsen voor eiwitten die essentieel zijn voor de levensvatbaarheid van de parasieten zijn vertegenwoordigen. De cyclische peptiden werden gesynthetiseerd onder microgolfbestraling op reactietijden verminderen enefficiency. Het ontwikkelen van een bibliotheek van backbone cyclische peptiden met verschillende ringmaten vergemakkelijkt een systematische scherm voor de meest biologisch actieve conformatie. Deze werkwijze geeft een algemene, snelle en gemakkelijke manier om cyclische peptiden te synthetiseren.

Introduction

Eiwit-eiwit interacties (PPI's) spelen een centrale rol in de meeste biologische processen, van intracellulaire signaaltransductie celdood 1. Daarom richten PPI is van fundamenteel belang voor fundamenteel onderzoek en therapeutische toepassingen. PPI kan worden geregeld door specifieke en stabiele antilichamen, maar antilichamen zijn duur en moeilijk te vervaardigen en hebben een slechte biobeschikbaarheid. Als alternatief kan PPI's worden gericht op kleine moleculen. Kleine moleculen zijn gemakkelijker te synthetiseren en goedkoop in vergelijking met antilichamen; Maar ze relatief minder flexibel en beter passen aan kleine holtes dan groot eiwit-eiwit interfaces 2,3. Diverse studies hebben aangetoond dat peptiden, die eenvoudiger en goedkoper dan antilichamen en flexibeler dan kleine moleculen, eiwitten interfaces kunnen binden en reguleren PPI 4,5. De wereldwijde therapeutisch peptide markt werd gewaardeerd zo'n vijftien miljard dollar in 2013 en groeit 10,5% annually 6. Verder zijn er meer dan 50 gebracht peptiden, ongeveer 270 peptiden in verschillende stadia van klinische proeven, en ongeveer 400 peptiden in gevorderde preklinische stadia 7. Hoewel talrijke peptiden worden gebruikt als geneesmiddelen, peptiden nog stel verschillende problemen die hun wijdverbreide toepassing zoals een slechte biologische beschikbaarheid en stabiliteit, ondoelmatigheid kruising celmembranen en conformationele flexibiliteit 8,9 beperken. Een alternatief voor deze nadelen overwinnen is om verschillende modificaties toepassen zoals lokale (D-aminozuur en N-alkylering) en globale (ringvorming) beperkingen 8,10-12. Deze wijzigingen komen ook van nature. Bijvoorbeeld, cyclosporine A, een immunosuppressivum cyclisch natuurlijke peptide, bevat één D-aminozuur en ondergaat N-alkylering modificaties 13,14.

Modificatie van natuurlijke aminozuren aan lokale beperkingen, zoals de D- en N-alkylering veroorzaken, vaak van invloed op het peptide9; s biologische activiteit. Echter, cyclisatie, waarbij de sequentie van interesse kan hetzelfde blijven, is het waarschijnlijker dat de biologische activiteit behouden. Cyclisatie is een zeer aantrekkelijke manier om peptide conformationele ruimte te beperken door het verminderen van het evenwicht tussen de verschillende conformaties. Het verhoogt gewoonlijk biologische activiteit en selectiviteit door het op de peptide om de actieve conformatie dat slechts één functie medieert. Cyclisatie peptide verbetert ook de stabiliteit door het houden van het peptide in een conformatie die minder wordt herkend door enzymen. Inderdaad werden cyclische peptiden getoond metabolische stabiliteit, biologische beschikbaarheid en selectiviteit te zijn verbeterd in vergelijking met hun lineaire tegenhangers 15-17.

Echter, cyclisatie een tweesnijdend zwaard omdat in sommige gevallen de beperking mogelijk dat de peptiden van het bereiken van een bioactieve conformatie. Om deze hindernis te overwinnen, een gerichte bibliotheek waarin alle peptiden hebben dezelfde primaire sequencere en daardoor constant farmacoforen kunnen worden gesynthetiseerd. Peptiden in de bibliotheek verschillen parameters die de structuur beïnvloeden, zoals ring grootte en positie, om vervolgens screenen op de biologisch actieve conformatie 9,18.

Peptiden kunnen worden gesynthetiseerd zowel in oplossing en een vaste-fase peptidesynthese (SPPS) benadering, die thans de meest voorkomende peptidesynthese benadering en zullen verder worden besproken. SPPS is een proces waarbij chemische transformaties worden uitgevoerd op een vaste drager via een linker aan een groot aantal synthetische verbindingen 19 te bereiden. SPPS maakt het samenstellen peptiden door achtereenvolgende koppeling van aminozuren stapsgewijs vanaf de C-terminus, die aan een vaste drager is gehecht aan de N-terminus. De N-α-aminozuur zijketens worden gemaskeerd met beschermende groepen die stabiel zijn bij de reactieomstandigheden tijdens peptide verlenging aan de toevoeging van één aminozuur per st waarborgenep. In de laatste stap wordt het peptide vrijgemaakt uit de hars en de zijketen beschermende groepen worden tegelijkertijd verwijderd. Terwijl het peptide wordt gesynthetiseerd, kunnen alle oplosbare reagentia uit de peptide-vaste dragermatrix door filtratie verwijderd en weggespoeld aan het einde van elke koppelingsstap. Met een dergelijk systeem kan een grote overmaat reagentia in hoge concentratie koppelingsreacties rijden voltooid en alle stappen van de synthese kan in hetzelfde vat worden uitgevoerd zonder overdracht van materiaal 20.

Ofschoon SPPS heeft een aantal beperkingen zoals de productie van onvolledige reacties, nevenreacties, onzuivere reagentia, alsook problemen de reactie 21, zijn de voordelen van SPPS is de "gouden standaard" voor peptidesynthese gemaakt. Deze voordelen omvatten de mogelijkheid om niet-natuurlijke aminozuren, automatisering, gemakkelijke zuivering omvatten de minimale fysieke verliezen, en het gebruik van overmaat reagentia, waardoorhoge opbrengsten. SPPS is gebleken uiterst nuttig bij de synthese van moeilijke sequenties 21,22, fluorescent wijzigingen 23 en peptidebibliotheken 24,25 zijn. SPPS is ook zeer nuttig zijn voor andere poly-keten samenstellen zoals oligonucleotiden 26,27, 28,29 oligosacchariden en peptidenucleïnezuren 30,31. Interessant is dat in sommige gevallen, werd SPPS getoond voordelig voor het synthetiseren van kleine moleculen die traditioneel in oplossing 32,33 te zijn. SPPS wordt zowel in kleine schaal voor onderzoek en onderwijs 34,35 evenals grote schaal in de industrie 36-38.

Twee synthesestrategiën die hoofdzakelijk worden gebruikt in SPPS methodologie voor de synthese van peptiden butyloxycarbonyl (Boc) en 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). De originele strategie ingevoerd voor SPPS is Boc, die sterk zure omstandigheden vereist zij keten van r te verwijderen beschermende groepen en splitsen van de peptideEsin. Fmoc gebaseerde peptidesynthese echter gebruik gematigde basisomstandigheden en een milder alternatief voor de zuur-labiele Boc protocol 39. De Fmoc strategie maakt gebruik van orthogonale t-butyl (tBu) zijketen bescherming die wordt verwijderd in de laatste stap van de synthese, terwijl het splitsen van het peptide van de hars onder zure omstandigheden.

Het algemene principe van peptidesynthese op vaste drager wordt in figuur 1. De eerste aminozuur, gemaskeerd door een tijdelijke beschermende groep op het N-α-terminus wordt op de hars van de C-terminus geladen. Een semi-permanente beschermende groep aan de zijketen maskeren wordt eveneens gebruikt indien nodig (Figuur 1, stap 1). De synthese van de doelwit peptide is samengesteld uit de C-terminus aan de N-terminus van herhaalde cycli van ontscherming van de N-α-tijdelijke beschermende groep (Figuur 1, stap 2) en koppelen van het volgende beschermde aminozuur (Figuur 1 ong>, stap 3). Na het laatste aminozuur wordt geladen (Figuur 1, stap 4), wordt het peptide gesplitst van de hars drager en de semi-permanente beschermende groepen worden verwijderd (Figuur 1, stap 5).

Figuur 1
Figuur 1. Algemene schema van vaste fase peptidesynthese. Het is N-α-beschermde aminozuur verankerd via de carboxylgroep via een linker aan de hars (stap 1). Het gewenste peptide wordt vervaardigd lineair vanaf de C-terminus aan de N-terminus van herhaalde cycli van ontscherming van de tijdelijke beschermgroep (TPG) van de N-α (stap 2) en aminozuur- koppeling (stap 3). Na voltooiing van de synthese (stap 4) worden de semi-permanente beschermende groepen (SPG) gedeprotecteerd in splitsingsplaats (stap 5).krijgen = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na montage van de volledige peptideketen, kan cyclisering worden bereikt door verscheidene alternatieven: (A) head-to-tail cyclisatie - Dit is een handige manier maar beperkt omdat het voorziet slechts één optie voor ringsluiting (figuur 2A), (B) cyclisatie met de aminozuren van de sequentie van belang die bioactieve functionele groepen bevatten - Het gebruik van deze aminozuren kunnen de biologische activiteit (Figuur 2B), en (C) ringsluiting te beïnvloeden door het toevoegen van aminozuren (of andere bouwblokken) zonder verstoring het biologisch actieve sequentie. Introductie van deze moleculen wijdverspreid omdat hiermee de productie van gerichte bibliotheken zonder dat de van belang zijnde sequentie (figuur 2C).

Figuur 2
Figure 2. Alternatieve peptide cyclisatie strategieën (A) kop aan staart cyclisatie, via een peptide binding tussen de C-terminus en de N-terminus.; (B) cyclisatie tussen functionele groepen zoals een disulfidebinding tussen cysteïneresiduen (1), of een amidebinding tussen de zijketens van lysine / glutaminezuur (2) of zijketen aan N- of C-terminus (3 Aspartic -4); (C) cyclisatie door het toevoegen van extra aminozuren of aminozuur derivaten of kleine moleculen, bijvoorbeeld voor (R0) en na (R7) de bioactieve reeks. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

-Microgolf-geassisteerde synthese maakt gebruik van microgolfstraling om reacties te verwarmen, waardoor het versnellen van organische chemische omzettingen 40,41. Magnetron chemie is gebaseerd op het vermogen van het reagens / oplosmiddel aan het absorberenmicrogolf energie omzetten in warmte 42. Voor de techniek algemeen werd, had grote bezwaren worden overwonnen, zoals de controleerbaarheid en de reproduceerbaarheid van syntheseprotocollen en gebrek aan beschikbare systemen voldoende temperatuur en druk controles 43,44. De eerste melding van microgolven peptide synthese werd uitgevoerd met een keuken microgolf verscheidene korte peptiden te synthetiseren (7-10 aminozuren) met een significante verbetering van de koppelingsefficiëntie en zuiverheid 45. Bovendien werd microgolfenergie aangetoond keten aggregatie verlagen kant reacties te verminderen, racemisatie te beperken, en het verbeteren van de koppeling tarieven, die alle kritische voor moeilijke en lange sequenties 46-53 zijn.

Momenteel is het gebruik van microgolfbestraling voor de synthese van peptiden of verwante verbindingen op een vaste drager is uitgebreid, waaronder (A) synthese in water in plaats van organische oplosmiddelen 54; (B) de synthese van peptiden metgemeenschappelijke post-translationele modificaties, zoals glycopeptiden 55-58 of 59-61 fosfopeptiden, waarvan de synthese is meestal moeilijk vanwege de lage koppelingsrendement van sterisch gehinderde aminozuur derivaten; (C) synthese van peptiden met wijzigingen in de backbone, zoals azapeptides, dat kan worden gevormd door de vervanging van de C (α) van een aminozuurrest met een stikstofatoom 62 of peptoïden, waarvan de zijketen is verbonden met de amide stikstof in plaats van de Ca-atoom 63,64; (D) synthese van cyclische peptiden 65-71; en (E) synthese van combinatorische bibliotheken 51,72. In veel gevallen, de auteurs rapporteerden hogere efficiëntie en verminderde synthese keer met microgolfbestraling in vergelijking met de conventionele protocol.

Met behulp van een rationeel ontwerp 73-75, ontwikkelden we anti-parasitaire peptiden die zijn afgeleid van receptor het schavot L eishmania's for geactiveerde C-kinase (gebrek). GEBREK speelt een belangrijke rol in de vroege fase van Leishmania-infectie 76. Parasieten uitdrukken lagere niveaus van GEBREK niet om zelfs immuun-gecompromitteerde muizen parasiteren 77 een gebrek is betrokken bij essentiële parasiet signalering processen en eiwitsynthese 78. Daarom GEBREK is een belangrijke scaffold eiwit 79 en een waardevolle drug target. Gericht op sequenties in LACK die geconserveerd in de parasieten, maar niet in het ontvangende zoogdier homoloog RACK identificeerden we een 8 aminozuurpeptide (RNGQCQRK) die Leishmania sp. Levensvatbaarheid daalde in kweek.

We beschrijven hier een protocol voor de synthese van hoofdketen cyclische peptiden afgeleid van de eiwitsequentie LACK hierboven beschreven. De peptiden werden gesynthetiseerd op een vaste drager via microgolf verhitting door SPPS methodologie Fmoc / tBu protocol. Peptiden werden geconjugeerd aan een TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) dragerpeptide via een amidebinding alseen deel van de SPPS. TAT-gebaseerde transport van diverse ladingen in cellen is gebruikt voor meer dan 15 jaar en de levering van de lading in subcellulaire organellen is bevestigd 80. Vier verschillende linkers, barnsteenzuuranhydride en glutaarzuuranhydride en adipinezuur en pimelinezuur, werden gebruikt om de cyclisatie uit te voeren om carbonzuur linkers van 2 tot 5 koolstofatomen genereren. Cyclisering werd uitgevoerd met microgolfenergie, en de uiteindelijke splitsing en zijketen-deprotectie stappen handmatig zonder microgolfenergie. Het gebruik van een geautomatiseerde synthesizer microgolf verbeterde de product zuiverheid, verhoogde de productopbrengst en verminderde de duur van de synthese. Deze algemene protocol kan worden toegepast op andere studies die peptiden gebruiken om belangrijke moleculaire mechanisme te begrijpen in vitro en in vivo en verdere ontwikkeling van potentiële geneesmiddelen voor ziekten bij de mens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Apparatuur en reagentia Voorbereiding

  1. Voorbereiden van apparatuur
    1. Voer alle stappen in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
    2. Chemisch synthetiseren peptiden op vaste drager met behulp van een magnetron Peptide Synthesizer met een extra module van Discover voorzien van een vezeloptische temperatuursensor voor het regelen van de microgolf vermogensafgifte in een Teflon reactievat (30 ml, met glasfrit) of in een wegwerp polypropyleen cartridge (12 ml, met een grove frit).
    3. Voor een goede menging, sluit stikstof toevoer naar het reactievat, of als alternatief verzegelen beide uiteinden van de polypropyleen cartridge, en te plaatsen op een rondschudapparaat.
    4. Om reactiemengsels of wast afvoer, aan te sluiten op het huis vacuum via een sifon.
    5. Plaats de vezeloptische sonde in het reactievat.
  2. De voorbereiding van reagentia
    1. Bereid de hars door weging Rink Amide AM hars 100-200 mesh (0,204 mg)Voeg 5 ml van 1: 1 mengsel van N, N-dimethylformamide (DMF) / dichloormethaan (DCM) aan het reactievat / polypropyleen patroon naar de hars te spoelen, schud gedurende 2-4 uur goed zwellen en afvoer.
    2. Bereid 0,2 M 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) aminozuur oplossingen door oplossen van de overeenkomstige Fmoc-aminozuur in DMF en vortex het mengsel tot de aminozuren worden opgelost (tabel 1).
    3. Bereid 0,45 M activatoroplossing mix door het oplossen van 18,96 g O - (benzotriazol-1-yl) - N, N, N ', N' tetramethyluroniumhexafluorfosfaat (HBTU) in 100 ml DMF en het mengsel vortexen totdat de vaste stof is opgelost (Tabel 1).
    4. Bereid 2 M activator basisoplossing mix combineert 34,8 ml N, N-diisopropylethylamine (DIEA) met 65,2 ml 1-methyl-2-pyrrolidinon (NMP) (Tabel 1).
    5. Bereid 0,1 M oplossing deprotectie mix door het oplossen van 3,37 g 1-hydroxybenzotriazool hydraat (HOBt)in 250 ml van een 20% v / v oplossing van piperidine in DMF en het mengsel vortexen totdat de vaste stof is opgelost (tabel 1).

2. Fmoc-beschermde aminozuur Coupling

  1. Aminozuur koppeling
    1. Voeg aminozuur (2,5 ml) / activator (1 ml) / activator base (0,5 ml) aan het reactievat / polypropyleen cartridge en liet de reactie verlopen gedurende 300 seconden (25 W, 75 ° C, tabel 2). Giet de oplossing.
    2. Was de hars met DMF. Voeg DMF aan de hars voor 120 sec (7 ml, 0 W, RT) en laat de oplossing. Herhaal dit vijf keer.
  2. Fmoc ontscherming
    1. 7 ml 20% piperidine in DMF met 0,1 M HOBt aan reactievat / polypropyleen cartridge en incubeer gedurende 30 sec (45 W, 75 ° C, tabel 2).
    2. Afvoer van het reactiemengsel.
    3. 7 ml 20% piperidine in DMF met 0,1 M HOBt aan reactievat / polypropyleen cartridge Incubeer 180 sec (45 W, 75 ° C, tabel 2).
    4. Afvoer van het reactiemengsel.
    5. Was de hars met DMF. Voeg DMF aan de hars voor 120 sec (7 ml 0 W, rt) en laat de oplossing. Herhaal dit vijf keer.
      Opmerking: Eventueel pauze de procedure hier en hervatten op een later tijdstip.
  3. Na aminozuur koppelingstap, was de hars met DCM en opslag gedurende ten minste enkele dagen bij 4 ° C (gedurende langere opslag de hars bij - 20 ° C).
    1. Verplaats de hars uit het reactievat naar een polypropyleen cartridge.
    2. Was de hars met DCM. Voeg DCM aan de hars voor 120 sec (7 ml, 0 W, rt) en laat de oplossing. Herhaal dit drie keer.
    3. Verzegeling van de polypropyleen cartridge stevig met een dop en kraan.
    4. Voordat een nieuwe synthese, zwellen de hars voor 3-4 uur in DMF (7 ml).
  4. Monitoring van de synthese
    1. Gebruik de Kaiser (ninhydrine) -test of chloranil test om snel te bepalen de voortgang van desynthese. Eventueel uitvoeren van een kleinschalig splitsingsreactie om de zuiverheid en de massa van het gesynthetiseerde peptide te bepalen. Zie hoofdstuk 9.
      Opmerking: Voor meer het oplossen van problemen zie tabel 3.
  5. Herhaal de stappen 2,1 en 2,2 wens gerichte peptide te synthetiseren: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Anhydride / Acid Coupling

  1. Anhydride koppeling
    1. Was de hars met NMP. NMP toe te voegen aan de hars voor 120 sec (7 ml, 0 W, rt) en laat de oplossing. Herhaal dit drie keer.
    2. Los 10 equivalenten van het overeenkomstige anhydride in NMP (5 ml), voeg 1 equivalent 4-dimethylaminopyridine (DMAP) en 10 equivalenten DIEA aan de oplossing (Tabel 1).
    3. Voeg een 10: 1: 10 mengsel van anhydride / DMAP / DIEA de hars en incubeer gedurende 300 sec (25W, 75 ° C, tabel 2). Giet de oplossing.
    4. Was de hars met NMP. NMP toe te voegen aan de hars voor 120 sec (7 ml, 0 W, rt) en laat de oplossing. Herhaal dit drie keer.
  2. Zuur koppeling
    1. Was de hars met DMF. Voeg DMF aan de hars voor 120 sec (7 ml, 0 W, rt) en laat de oplossing. Herhaal dit drie keer.
    2. Los 10 equivalenten van het overeenkomstige dicarbonzuur in DMF (5 ml). Voeg 1 equivalent DMAP en 10 equivalenten N, N '-Diisopropylcarbodiimide (DIC) aan de oplossing (Tabel 1).
    3. Pre-activeert het mengsel door mengen gedurende 30 min.
    4. Voeg het mengsel aan de hars en incubeer gedurende 300 seconden (25 W, 75 ° C, Tabel 2) en laat de oplossing.
    5. Was de hars met DMF. Voeg DMF aan het hars 120 sec (7 ml, 0 W rt) en tap oplossing. Herhaal stap drie keer.

4. N-methyltrityl (MTT) beschermende groep DEPROTECTion

Opmerking: De lysinezijketen werd beschermd N-methyltrityl (Mtt) 81, een beschermende groep die selectief kan worden ontschermd onder zure omstandigheden labiele 82,83. DEPROTECT Mtt beschermende groep handmatig op een schudder zonder microgolven.

  1. Breng het hars met een polypropyleen cartridge uitgerust met dop stekker en afsluiter.
  2. Was de hars met DCM. Voeg DCM aan de hars voor 120 sec (7 ml, 0 W, rt) en laat de oplossing. Herhaal dit drie keer.
  3. Voeg 15-25 ml van een mengsel van 1% trifluorazijnzuur (TFA), 5% triisopropylsilaan (TIS) en 94% DCM naar polypropyleen cartridge per één gram hars.
    Opmerking: TFA is een sterk zuur en bijtend is zeer irriterend voor huid, ogen en longweefsel.
    1. Blijf geconcentreerde oplossing van TFA in de kap te allen tijde.
    2. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (oogbescherming, een laboratoriumjas en handschoenen) en werken in een goed geventileerde kap. Change handschoenen onmiddellijkals ze in contact komen met TFA en onmiddellijk opruimen morsen. Als huid of ogen in contact komen met het zuur, spoel het getroffen gebied onmiddellijk met water en wassen voor een extra 15 minuten.
  4. Plaats het polypropyleen cartridge op een shaker en schud gedurende 5 min bij RT.
  5. Afvoer van de oplossing van de polypropyleen cartridge door het toepassen van vacuüm.
  6. Herhaal stap 4,3-4,5, driemaal.
  7. Was de hars met DCM. Voeg DCM aan de hars voor 120 sec (7 ml, 0 W, rt) en laat de oplossing. Herhaal dit vijf keer.

5. Cyclisatie van het lineaire peptide

  1. Was de hars met DCM. Voeg DCM aan de hars voor 120 sec (7 ml, 0 W, rt) en laat de oplossing. Herhaal dit vijf keer.
  2. In een 50 ml polypropyleen buis los 5 equivalenten benzotriazol-1-ly-oxy-tris- pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) in dibroommethaan (DBM, 5 ml) en voeg 10 equivalenten DIEA aan de oplossing (Tabel 1).
  3. tabel 2). Giet de oplossing.
  4. Was de hars met DCM. Voeg DCM aan de hars voor 120 sec (7 ml, 0 W, rt) en laat de oplossing. Herhaal dit drie keer.

6. Splitsing en Ontscherming van zijketengroepen

  1. Was de hars met DCM en diethyl ether.
    1. Voeg DCM aan de hars voor 120 sec (7 ml, 0 W, rt) en laat de oplossing. Herhaal dit tweemaal.
    2. Voeg diethylether aan het hars 120 sec (7 ml, 0 W rt) en laat de oplossing. Herhaal dit tweemaal.
  2. Droog de hars onder vacuüm exsiccator bij kamertemperatuur gedurende ten minste 3 uur in kaliumhydroxide (KOH, 1-10 g).
  3. Weeg het gedroogde hars en overbrengen naar een polypropyleen cartridge.
  4. Voeg 10 ml van een voorgekoelde trifluorazijnzuur (TFA) splitsing cocktail (bijvoorbeeld 90% TFA, 2,5% water, 2,5% TIS en 5% fenol) om alle gram hars.
  5. Schud gedurende 3 uurbij kamertemperatuur.
  6. Verzamel de TFA splitsingsoplossing door filtreren van de hars in een 50 ml polypropyleen buis. Voor de filtratie gebruikt de frit die in 12 ml polypropyleen cartridge.
  7. Voeg koude diethylether (35 ml) aan de buis.
  8. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1207 xg bij 4 ° C.
  9. Schenk de ether laag.
  10. Herhaal stap 6,7-6,9, vijf keer.

7. Drogen van de Backbone cyclisch peptide

  1. Houd het geprecipiteerde peptide in dezelfde buis en droog het in een kap gedurende 30 min.
  2. Los het peptide in een 1: 1 mengsel van water en acetonitril (ACN).
  3. Bevries het uiteindelijke productoplossing in vloeibare stikstof.
  4. Lyofiliseren het eindproduct.

8. Kenmerkend de Backbone cyclisch peptide

  1. Los een klein monster (1 mg) van het product in water (400 ui).
  2. Injecteer de opgeloste peptide (10-200 ui) om een ​​omgekeerde fase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) systeem om het peptide zuiverheid 34 testen.
  3. Controleer de massa van het peptide met massaspectrometrie-matrix-geassisteerde laser desorptie ionisatie (MALDI-MS) 84.
    1. Meng 1 pl (100 pM) peptide in een 1: 1 (v / v) mengsel van acetonitril: water met 1 pi matrix (5 mg / ml, α-cyano-4-hydroxykaneelzuur) in een 1: 1 (v / v) mengsel van acetonitril: water met TFA (0,1%).
    2. Spot 1 pl op de MS-MALDI plaat.
    3. Droog het monster en plaats deze in de massaspectrometer.
  4. Weeg het peptide en berekenen van het percentage opbrengst.
  5. Bewaren bij -20 ° C.

9. Toezicht op de Synthese

  1. Kaiser (ninhydrine) -test 85
    1. Bereid het reagens oplossingen.
      1. Bereid een oplossing door het oplossen van 16,5 mg kaliumcyanide (KCN) in 25 ml gedestilleerd water. Verdun 1 ml van de bovengenoemde oplossing met 49 ml pyridine.
      2. Bereid Oplossing Bdoor het oplossen van 1 g ninhydrine in 20 ml ethanol.
      3. Bereid Oplossing C door oplossen van 40 g fenol in 20 ml ethanol.
    2. Gebruik de Kaiser test om de voltooiing van aminozuur koppeling of de deprotectie van de beschermende groep controleren.
      1. Breng enkele korrels van de hars tot een reageerbuis.
      2. Drie druppels (~ 100 ul) van elke oplossing (A, B en C) en meng.
      3. Verwarm de reageerbuis op een verwarmingsblok op 110 ° C gedurende 5 min.
        Opmerking: Blue gekleurde kralen (positief resultaat) geven onvolledige koppeling reactie of ontscherming van Fmoc beschermende groep.
  2. Chloranil-test 86
    1. Bereid de volgende reagentia vers elke test.
      1. Bereid een oplossing van 2% chlooranil in DMF oplossing A.
      2. Bereid een oplossing van 2% aceetaldehyd in DMF oplossing B.
    2. Voer de chloranil test om de voltooiing van aminozuur koppeling of t controlerenHij ontscherming van de beschermende groep.
      1. Meng 100 ul van een oplossing met 100 ul oplossing B in een 1,5 ml buis.
      2. Drop de kralen in en schud 5 minuten.
        Opmerking: donkerbruin gekleurde kralen (positief resultaat) geven ontscherming van de Fmoc beschermende groep of een onvolledige koppeling reactie.
  3. Kleinschalige splitsingsreactie
    1. Verwijderen van een kleine hoeveelheid hars die een 3 ml cartridge polypropyleen dop voorzien stekker en afsluiter.
    2. Behandelen met een mengsel 2 ml van 95% TFA, 2,5% water en 2,5% TIS.
    3. Schud het mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder de hars door filtratie via de frit van polypropyleen patroon en verdampen de oplosmiddelen door een stikstofstroom.
    5. Los het residu op in water en het product geanalyseerd met HPLC en / of MS.

10. Leishmania donovani promastigoot Levensvatbaarheid in Cultuur Assay

    <li> Leishmania donovani (L. donovani) groei en de behandeling
    1. Cultuur L. donovani promastigoten in Dulbecco's modificatie van Eagle's Medium (DMEM) met 4,5 g / L glucose, L-glutamine en natriumpyruvaat bij 26 ° C.
    2. Behandel de L. donovani promastigoten met cyclische peptiden (100 pM) gedurende 24 uur bij 26 ° C.
  1. Leishmania donovani (L. donovani) levensvatbaarheid assay
    1. Beoordelen parasiet levensvatbaarheid met 20 ul AlamarBlue volgens het protocol van de fabrikant.
    2. Bepaal AlamarBlue reductie door het meten van fluorescentie (bij 570 nm excitatie en 590 nm emissie). Hogere waarden geven een grotere fluorescentie metabolische activiteit en een verhoogde leefbaarheid parasiet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier beschrijven we de ontwikkeling van een gerichte kleine bibliotheek van backbone cyclische peptiden die zich specifiek richten op vitale PPI's van de Leishmania parasiet en fungeren als antiparasitaire middelen (review over peptiden die PPI's richten als antiparasitaire agenten 87). Door de synthese van nieuwe backbone cyclische peptiden worden farmacoforen geconserveerd in een scaffold uitschuifbare grootte. De sterkte van de hier voorgestelde gerichte bibliotheek is de mogelijkheid om peptide steiger maten variëren terwijl een beperkte mate van conformationele vrijheid door middel van cyclisatie. De volledige synthese van de hoofdketen cyclische peptiden werd uitgevoerd met een geautomatiseerde synthesizer microgolf op vaste drager na de Fmoc / tBu protocol. Cyclisatie werd uitgevoerd door het creëren van een amidebinding tussen de linker, anhydride / zuur en de zijketen van lysine amine. De uiteindelijke splitsing en side-keten ontscherming werden handmatig zonder microgolven uitgevoerd (synthese schema en final producten structuur zie figuur 3). Het product werd geanalyseerd door preparatieve HPLC 25 mg wit poeder werd bewaard bij -20 ° C verkregen. Een monster van het product werd gecontroleerd door MS (figuur 4) en de zuiverheid werd bepaald met analytische HPLC (figuur 5). Een monster van elke cyclische peptide werd gestuurd voor biologische screening. Eén van de vier cyclische peptiden (PL1) was actief tegen Leishmania donovani (L. donovani), een parasiet veroorzaakt viscerale leishmaniasis, de ernstigste leishmaniasis bij de mens. Peptide PL1 verminderd parasiet levensvatbaarheid met 75% in vergelijking met de controlebehandeling (Tabel 4).

Figuur 3
Figuur 3. Synthese systematiek en de structuur van het skelet cyclische peptide gesynthetiseerd in dit onderzoek Reagentia en omstandigheden:. (I) Aminozuren koppeling: 300 sec, 25 W, 75 ° C,gebruik 1,1: 1: 2,2 aminozuur / activator / activator base. (ii) Fmoc ontscherming: 30 sec en 180 sec zowel op 45 W, 75 ° C, met behulp 20% piperidine in DMF + 0,1 M HOBt. (iii) Anhydride koppeling: 300 sec, 25 W, 75 ° C, met behulp 10: 10: 1 anhydride / DIEA / DMAP in NMP. (iv) ontscherming Mtt: 3 * (300 sec, 0 W rt) met 1: 5: 94 TFA / TIS / DCM. (v) Cyclisatie: 300 sec, 25 W, 75 ° C, met behulp 05:10 PyBOP / DIEA in DBM. (vi) Afsplitsing en ontscherming: 3 h, 0 W, rt, gebruikt 90: 2,5: 2,5: 5 TFA / TIS / H 2 O / fenol. Peptiden werden geconjugeerd aan een TAT 47-57 (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) dragerpeptide via een amidebinding in het kader van de synthese. Klik hier om bekijk een grotere versie van deze figuur.

Figuur 4
Figuur 4. MALDI-TOF massaspectroscopie spoor vanrepresentatieve backbone cyclisch peptide. De waargenomen massa, 2853.456 is in nauw overleg met de berekende massa 2854,271. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Analytische omgekeerde fase HPLC spoor van representatieve backbone cyclisch peptide. De analytische HPLC sporen van onzuivere (A) en gezuiverd (B) backbone cyclische peptide getoond. Het oplosmiddel systemen waren A (H2O met 0,1% TFA) en B (CH3CN met 0,1% TFA). Een lineaire gradiënt van 5-50% B bij 1 ml / min in 15 minuten bij 40 ° C met een C18, 5 urn, 150 mm kolom werd toegepast en de detectie was bij 215 nm. Klik hiervoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Oplossing Reagens MW (g / mol) d (g / ml) Volume (ml) Concentratie (M) Totaalbedrag
- Amino zure oplossing - Alanine aminozuur 311,34 0.2 6,23 g
0,2 M aminozuur in DMF DMF 100 100 ml
Een voorbeeld alanine aminozuur, maar dezelfde berekening worden uitgevoerd voor elk aminozuur, met de juiste MW. Ter voorbereiding van een 100 ml aminozurenoplossing los 6,23 g alanine aminozuur in 100 ml DMF. Bewaar bij 4 ° C.
- Deprotectie oplossing- HOBt 135,1 0.1 3,37 g
20% v / v oplossing van piperidine in DMF met 0,1 M HOBt Piperidine 50 50 ml
DMF 200 200 ml
Ontscherming wordt gebruikt voor het verwijderen van de Fmoc N α - beschermende groep. Ter voorbereiding van een 250 ml deprotectie oplossing oplossen 3,37 g HOBt in 200 ml DMF en voeg 50 ml piperidine. Bewaar bij 4 ° C.
- Activator oplossing - HBTU 379,24 0.45 18,96 g
0,45 M HBTU in DMF DMF 100 100 ml
Activatorgebruikt bij de activator base om het aminozuur voordat de koppelingsreactie te activeren. Ter voorbereiding van een 100 ml activator oplossing te ontbinden 18,96 g HBTU in 100 ml DMF. Bewaar bij 4 ° C.
- Activator baseoplossing - DIEA 129,24 0,742 2 34,80 ml
2 M DIEA in NMP NMP 65,20 ml
Activator base wordt gebruikt met de activator met de aminozuursequentie voordat de koppelingsreactie te activeren. Een 100 ml activator baseoplossing mix bereiden 34,8 ml DIEA en 65,2 ml NMP. Bewaar bij 4 ° C.
Oplossing Reagens MW (g / mol) d (g / ml) Volume (ml) Eq Totaalbedrag
Anhydrideoplossing - 10: 1: 10 anhydride / DMAP / DIEA in NMP Glutaarzuuranhydride / Barnsteenzuuranhydride 114,1 / 100,07 10 0,11 / 0,10 g
DMAP 122,2 1 0,01 g
DIEA 129,24 0,742 10 0,09 ml
NMP 5 5 ml
Los 0,11 / 0,10 g glutaarzuuranhydride / barnsteenzuuranhydride in 5 ml NMP, voeg 0,01 g DMAP en 0,09 ml DIEA aan de oplossing. Bereid een verse oplossing.
Zure oplossing - 10: 1: 10 zuur / DMAP / DIC in DMF Adipinezuur / pimelinezuur 146,14 / 160,17 10 0,15 / 0,16 g
DMAP </ td> 122,2 1 0,01 g
DIC 126,2 0,806 10 0,16 ml
DMF 5 5 ml
Los 0,15 / 0,16 g adipinezuur / pimelinezuur in 5 ml DMF, voeg 0,01 g DMAP en 0,16 ml DIC aan de oplossing. Bereid een verse oplossing.
Cyclisatie oplossing - 05:10 PyBOP / DIEA in DBM PyBOP 520,3 5 0,26 g
DIEA 129,24 0,742 10 0,09 ml
DBM 5 ml 5 ml
Los 0,26 g PyBOP in 5 ml DBM en voeg 0,09 ml DIEA aan de oplossing. Bereid eenverse oplossing.

Tabel 1. Reagentia en oplossingen voor de ruggengraat cyclische peptidesynthese. Lijst van de oplossingen en reagentia voor de synthese verschaft.

Magnetron cyclus Vermogen (Watt) Temp (° C) (Sec)
1 Koppeling aminozuren 25 75 300
2 Ontscherming van de Fmoc beschermende groep (a) Eerste ontscherming 45 75 30
(b) Complete ontbescherming 45 75 180


Tabel 2. Magnetron cycli van ontscherming en koppeling. Microwave cycliaminozuur- koppeling en Fmoc-ontscherming. (1) Koppeling van aminozuren. (2) Ontscherming van de Fmoc maskerende groep gebeurt in twee stappen: (a) de eerste en (b) volledige verwijdering van de bescherming.

Probleem Mogelijke oorzaak Oplossing
Kaiser of chloranil tests zijn positief na aminozuur koppeling Het aminozuur koppeling onvolledig Herhaal de koppelingsstap
Peptiden zijn niet efficiënt gescheiden van het supernatant Overmaat TFA Damp het monster met behulp van een stikstofstroom
Aanwezigheid van deletie sequenties in het product Fmoc verwijdering onvolledig Toezien op de verwijdering van de bescherming van Kaiser of chloranil tests en / of kleine schaal splitsing, in het geval de verwijdering van Fmoc onvolledig is herhaal de stap
Aminozuur coupling onvolledig Controleer de koppeling door Kaiser of chloranil proeven en / of kleinschalige splitsing, wanneer het aminozuur koppeling onvolledig herhaalt de stap en / of gebruik langere reactietijd

Tabel 3. Problemen advies Lijst van oplossingen voor de meest voorkomende synthetische uitdagingen wordt verstrekt.

Peptide Sequentie n MEVR. Cal. MS Obs. HPLC Opbrengst Parasiet levensvatbaarheid
PL1 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 2 2854.321 2853.456 98% 86% 25%
PL2 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 3 2868.348 98% 87% 100%
PL3 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 4 2882.375 2881.823 96% 89% 97%
pL4 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 5 2896.402 2895.603 97% 85% 98%

Tabel 4. Karakterisatie en bioactiviteit van peptiden die in deze studie. N verwijst naar het aantal methylenen in de alkyl- afstandhouder (zie figuur 3 voor constructie). MS werd uitgevoerd met behulp van MALDI techniek en zuiverheid werd bepaald met analytische HPLC. Peptiden werden aan Leishmania donovani promastigoten en de levensvatbaarheid van parasieten werd bepaald en uitgedrukt als percentage overleving in kweken geïncubeerd in afwezigheid van peptide regelen. Alleen PL1 had hoge Leishmanicidal activiteit. De waarnemerwerd verblind voor de experimentele omstandigheden. De gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De synthese van een gefocusseerde bibliotheek van hoofdketen cyclische peptiden afgeleid uit het ontbreken eiwit van de Leishmania parasiet met een volautomatische magnetron synthesizer wordt beschreven. Een gerichte bibliotheek van cyclische peptiden werd ontwikkeld met geconserveerde farmacoforen en diverse linkers. Toevoeging van verschillende linkers zoals glutaarzuuranhydride, barnsteenzuuranhydride, adipinezuur, pimelinezuur, lysine, ornithine en andere bouwstenen kan worden gebruikt om de verscheidenheid van de conformationele ruimte van de cyclische peptiden verhogen. De synthese van cyclische peptiden gefocusseerde bibliotheek stelt onderzoekers te screenen op optimale conformationele ruimte. Aangezien de conformatie van de cyclische peptiden is afhankelijk van parameters zoals ringgrootte en positie kunnen diverse analogen met verschillende conformaties worden gegenereerd die bruikbaar zijn in biologische structuur-activiteitsrelatie kan bestudeert 88.

Een belangrijke uitdaging in SPPS is de diagnose van de synthetic vooruitgang en het oplossen van problemen omdat er geen tussenproducten worden geïsoleerd. Derhalve kunnen verschillende colorimetrische bepaling worden gebruikt voor de reactie, zoals die vrije amines te identificeren door Kaiser en chlooranil de examens. Indien de Kaiser of chloranil tests niet indicatief (bijvoorbeeld proline en hydroxy-proline niet reageren met ninhydrine op dezelfde wijze als de andere aminozuren, omdat hun alpha aminogroep die deel uitmaakt van een vijfledige ring), een kleinschalige splitsingsreactie en massaspectrometrie analyse kan worden toegepast om de voortgang synthese te volgen.

Splitsing tijd en de splitsing cocktail kan worden aangepast op basis van de chemische eigenschappen en het aantal van de beschermende groepen gebruikt. Aanbevolen wordt een eerste proef splitsing met een kleine hoeveelheid van de hars (1-10 mg) worden uitgevoerd om de juiste omstandigheden te controleren. Koning et al. Hebben getest verschillende splitsing cocktails van verschillende peptiden en hun gedetailleerde richtlijnen kunnen worden gebruikt voor keuze reactietijd optimaliserenn voorwaarden 89. Voor backbone cyclische peptiden is incubatie gedurende ten minste 3 uur aanbevolen als een standaard voor volledige splitsing. Echter, peptiden die een groot aantal beschermende groepen of moeilijke beschermende groepen (bv, t-butyl ester of pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl) worden gedurende een langere tijd om volledige deprotectie waarborgen. Hierin hebben we niet systematisch onderzocht de optimale splitsing tijd of cocktail. Niettemin vonden we dat een korte splitsing tijd (minder dan 2 uur) resulteerde in incomplete klieving van bepaalde beschermende groepen.

De standaard microgolf peptidesynthese protocol is een algemeen toepasbare werkwijze voor de synthese van verschillende peptiden. In de meeste gevallen is het gebruik van een automatische synthesizer microgolf reduceert de duur synthese en verhoogt de opbrengst en zuiverheid van de producten. Bovendien vermindert nevenreacties zoals racemisatie en aspartimide formatie. Hoewel we nog niet gedaaneen side-by-side vergelijking van microgolf en conventionele synthese in dit onderzoek, op basis van onze ervaringen en andere labs, werd aangetoond dat het gebruik van microgolven synthese superieur aan de conventionele protocol 61,70. Bijna alle activators en harsen kunnen effectief worden gebruikt in de magnetron SPPS en de algemene werkwijze kan ook worden toegepast op de synthese van een verscheidenheid van gemodificeerde peptiden, zoals glycopeptiden, fosfopeptiden, azapeptides, peptoïden en cyclische peptiden 90.

Cyclisatie is een handige manier om de sterkte en stabiliteit van lineaire voorlopers te vergroten. Cyclische peptiden kunnen een gewenste conformatie beperkt die kunnen bijdragen aan bindingsaffiniteit en selectiviteit verhoogde verkrijgen. Bovendien kunnen lineaire peptiden worden gemodificeerd om meerdere cyclische lussen bevatten, waardoor ze mogelijk doelwit meerdere endogene eiwit binding interfaces 91. Het is echter belangrijk op te merken dat de cyclisatie niet necessarily leiden tot verbeteringen in alle of soms een van deze eigenschappen. Bepaalde cyclische peptiden kunnen leiden conformaties die niet gericht receptoren herkend (bijvoorbeeld 92,93) .Daarom een gefocusseerde bibliotheek van cyclische peptiden moeten scherm bioactiviteit. Concluderend synthetische cyclische peptiden wenselijke farmacologische eigenschappen, zijn klein genoeg om het celmembraan passeren en zijn groot genoeg om hoge selectiviteit. Hoge potentie, specificiteit en veilig profiel bijdragen tot belofte cyclische peptiden als gegadigde geneesmiddelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang en Daria Mochly-Rosen voor behulpzaam discussies. Het werk werd gesteund door de National Institutes of Health Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (VONK) naar NQ de financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic.
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials - micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
Nitrogen cylinder
Desiccator
Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).
Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450, (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
  3. Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5, (11), 797-807 (2009).
  4. Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochemistry. 37, (16), 5616-5622 (1998).
  5. Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282, (6), 4113-4123 (2007).
  6. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15, (1-2), 40-56 (2010).
  7. Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, American Chemical Society. 17-24 (2005).
  8. Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305, (5689), 1411-1413 (2004).
  9. Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10, (2), 256-266 (2008).
  10. Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6, (6), 872-877 (2002).
  11. Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21, (7), 512-523 (1982).
  12. Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24, (12), 1847-1852 (2003).
  13. Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochemistry. 30, (26), 6574-6583 (1991).
  14. Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116, (11), 1783-1799 (2015).
  15. Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O'Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61, (6), 287-297 (2003).
  16. Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121, (51), 12204-12205 (1999).
  17. Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274, (25), 17573-17579 (1999).
  18. Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6, (1), 99-104 (2004).
  19. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  20. Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using 'safety catch' methodology. J Vis Exp. (63), e4112 (2012).
  21. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2, (12), 3247-3256 (2007).
  22. Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91, (2), 157-168 (2009).
  23. Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based 'building block' approach. Nat. Protoc. 2, (12), 3210-3218 (2007).
  24. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  25. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126, (Pt 3), 789-802 (2013).
  26. Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11, (2), 203-216 (2008).
  27. Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9, (2), 169-185 (2009).
  28. Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446, (7139), 1046-1051 (2007).
  29. Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291, (5508), 1523-1527 (2001).
  30. Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3, (4), 646-654 (2008).
  31. Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1, (3), 175-183 (1995).
  32. Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90, (4), 526-536 (2008).
  33. O'Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10, (10), 857-876 (2007).
  34. Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84, (12), 1988-1991 (2007).
  35. Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79, (1), 85-86 (2002).
  36. Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis - A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13, (1-2), 75-82 (2007).
  37. Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2, (7), 587-593 (2003).
  38. Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29, (2), 4-7 (2011).
  39. Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37, (22), 3404-3409 (1972).
  40. Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27, (3), 279-282 (1986).
  41. Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27, (41), 4945-4948 (1986).
  42. Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5, (1), 51-63 (2006).
  43. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, (46), 6250-6284 (2004).
  44. de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34, (2), 164-178 (2005).
  45. Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57, (18), 4781-4784 (1992).
  46. Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20, (1), 1-47 (1991).
  47. Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27, (3), 213-224 (1998).
  48. Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11, (6), 762-770 (2008).
  49. Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5, (1), 39-50 (2010).
  50. Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2, (9), 2222-2227 (2007).
  51. Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2, (3), 624-631 (2007).
  52. Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13, (3), 143-148 (2007).
  53. Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
  54. Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11, (20), 4488-4491 (2009).
  55. Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13, (1-2), 203-208 (2007).
  56. Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7, (5), 877-880 (2005).
  57. Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8, (20), 4465-4468 (2006).
  58. Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71, (26), 9609-9621 (2006).
  59. Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12, (4), 349-357 (2006).
  60. Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14, (4), 387-392 (2008).
  61. Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85, (3), 300-305 (2014).
  62. Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7, (25), 5649-5652 (2005).
  63. Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4, (23), 4057-4059 (2002).
  64. Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7, (8), 1521-1524 (2005).
  65. Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51, (9), 2701-2707 (2008).
  66. Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75, (1), 40-50 (2010).
  67. Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131, (22), 7917-7927 (2009).
  68. Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
  69. Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10, (12), 2329-2332 (2008).
  70. Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14, (6), 683-689 (2008).
  71. Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2, (3), 281-283 (2004).
  72. Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127, (38), 13271-13280 (2005).
  73. Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20, (1), 25-33 (2009).
  74. Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28, (1), 14-16 (2010).
  75. Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7, (2), e87-e93 (2010).
  76. Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268, (5210), 563-566 (1995).
  77. Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198, (11), 1689-1698 (2003).
  78. Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6, (6), e20710 (2011).
  79. Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259, (3), 909-916 (1999).
  80. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13, (10), 443-448 (2007).
  81. Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45, (5), 488-496 (1995).
  82. Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60, (5), 300-303 (2002).
  83. Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6, (6), 264-270 (2000).
  84. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373 (2011).
  85. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34, (2), 595-598 (1970).
  86. Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33, (10), 763-766 (1979).
  87. Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32, (6), 62-66 (2014).
  88. Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39, (16), 3174-3178 (1996).
  89. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36, (3), 255-266 (1990).
  90. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41, (5), 1826-1844 (2012).
  91. Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28, (11), 2698-2709 (2008).
  92. Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58, (3), 246-256 (2001).
  93. Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52, (2), 83-90 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics