bir (A) Güvenlik Önlemleri ve Çalışma Usul BSL-4 Laboratuvar: 2. Genel Uygulamalar

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mazur, S., Holbrook, M. R., Burdette, T., Josleyn, N., Barr, J., Pusl, D., Bollinger, L., Coe, L., Jahrling, P. B., Lackemeyer, M. G., Wada, J., Kuhn, J. H., Janosko, K. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices. J. Vis. Exp. (116), e53600, doi:10.3791/53600 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

bir biyogüvenlik düzeyi 4 (BSL-4) çevreleme laboratuvarda çalışma zamanı ve detay için büyük dikkat gerektirir. olmayan yüksek sonucu patojenler ile bir BSL-2 laboratuvarda yapılır aynı iş BSL-4 ortamda önemli ölçüde daha uzun sürer. Bu artan zaman gereksinimi nedeniyle laboratuvar kaynaklı enfeksiyonlar, olası kontaminasyon çalışma ortamı ve yüksek sonucu patojenlerin olası sürümünden yerel halktan araştırmacı korumayı amaçlayan faktörlerin çok sayıda etmektir. laboratuvar içinde, hareket zorunlu tam vücut emniyet elbise bağlı hava hortumları nedeniyle sınırlıdır. Buna ek olarak, Sınıf II biyogüvenlik kabinleri (BSC) kaldırılır her öğenin dezenfeksiyon gereklidir. Laboratuvar uzmanları BSL-4 laboratuvar uygulamaları konusunda eğitilmelidir ve performans becerileri yüksek yeterliliğini göstermek gerekir. Bu yazının amacı, uygun prosedürleri ve laboratuvar b sağlamak için teknikleri ana hatlarıyla ortaya koymaktırörnek prosedür olarak, standart bir virütik plak deneyi kullanılarak iosafety ve deneysel doğruluk. Bir Deney görsel üzerinde durulacaktır Özellikle, uygun teknikler BSL-4 ortamında güvenli çalışma. Bu teknikler şunlardır: deneyler, uygun çalışma bitmiş Sınıf II BSC temizliği, atık yönetimi ve BSL-4 laboratuvar içinde oluşturulan atıkların güvenli bertaraf ve BSL içinden inaktive numunelerin çıkarılması için bir Sınıf II BSC kurma BSL-2 laboratuara 4 laboratuvar.

Introduction

Yüksek sonucu patojenleri ele laboratuvar personelinin güvenliği (enfeksiyon propilaksisler ne tedavi seçenekleri mevcuttur) her şeyden olduğu gibi Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı biyomedikal patojen ile çalışma güvenli yürütülmesi için tesis yapımı için kurallar ve en iyi uygulamaları kurmuştur biyogüvenlik perspektifinden 1 klinik laboratuvarlar. mevzuat ve düzenleme sayesinde, uygulamaları ve prosedürleri çok bu patojenlerin ile çalışmak için uyulması gereken zorunlu gereklilikler haline gelmiştir. ABD, kolayca insandan insana aktarılan patojenlerin, yüksek vaka-ölüm oranları neden ve / veya önemli bir halk sağlığı etkisi ve biyoterörizm potansiyeline sahip, Alerji ve Bulaşıcı Sağlık / Ulusal Enstitüsü Ulusal Enstitüsü olarak kategorize edilir hastalık (NIH / NIAID) Öncelikli A Patojenler ve ya hastalık Kontrol ve Önleme (CDC) Biyoterörizm Kategori Merkezleri A Ajanlar 2. Buna ek olarak, HBu patojenler, potansiyel biyoterörizm ajanları olan kitlesel zayiat veya ekonomi, kritik altyapı, ya da kamu güveninin 3 yıkıcı etkileri potansiyeli varsa igh sonucu patojenler Tier 1 Seç Ajanlar olarak sınıflandırılır.

BSL-4 laboratuvarlar ile enstitüleri erişim dahil BSL-4 operasyonlar, daha çok BSL-2/3 operasyonlarından daha kontrol edilir. Örneğin, bunun nedeni büyük takım eğitim gereksinimleri, geniş rehberlik gereksinimleri ve ilave tıbbi biyogüvenlik önkoşul bir BSL-2 veya BSL-3 laboratuvar ile karşılaştırıldığında BSL-4 laboratuvar erişmek için önemli ölçüde daha zordur. Buna ek olarak, bir BSL-2 veya BSL-3 tesisi 4-6 karşı bir BSL-4 tesis daha fiziksel güvenlik bariyerleri genellikle vardır. BSL-4 giriş ve çıkış işlemleri bizim ilk makalede belirtildiği gibi, laboratuvar personeli BSL-4 laboratuvar 7 içine giriş için hak kazanmak için kapsamlı eğitim ve psikolojik tarama tabi. WBSL-4 laboratuvar ithin, enfeksiyon ve hatalar riski önlenir veya kurulacak prosedürler izlenerek hafifletilmiş. Araştırma asgari çoklu görev veya dikkat dağıtıcı ile, dikkatli ve bilinçli hareket etmelidir. pozitif basınç takım elbiseli eğildim güçtür ve yüz maskesi gibi mikroskopi gibi prosedürleri kısıtlayabilir. Hacimli eldiven gibi küçük öğelerle çalışılırken veya tüpleri etiketleme olarak ince motor görevleri performansını engellemektedir. BSL-4 laboratuvarlar harcanan zamanı en aza indirmek için, laboratuvar uzmanları görev (ler) tamamlanması için BSL-4 laboratuvar içine bu malzemeleri BSL-2 laboratuvarda öncesinde yapılabilir adımları belirlemek ve daha sonra taşımak için çalışma prosedürleri gözden geçirmelidir. BSL-2 laboratuarda daha fazla işlem için malzeme çıkarırken, malzeme sabit ve mühürlü bir sekonder kapta BSL-4 laboratuvar kaldırılır. kaldırılması gerekebilir örnekleri şunları içerir: enzime bağlı immunosorbe ile analiz edilecek sabit plakaları ya da enfekte olmuş malzeme tüplerint deneyi (ELISA), imüno-floresan deneyi (İFA) ya da polimeraz zincir reaksiyonu (PCR).

BSL-2 laboratuarlarında kıyasla BSL-4 laboratuvarlar gerekli kişisel koruyucu ekipman dayattığı fazla fiziksel sınırlamalara ek olarak, hücre kültürü plakaları ve atık yüksek sonucu patojenlerin etkisizleştirilmesi için prosedürler daha az patojenik virüsler için gerekli olan daha sıkı BSL-2 laboratuvarda incelenir. En azından, bu yöntemler, CDC gereksinimi karşılamalıdır. Örneğin, kirli hücre kültür plakaları ve diğer malzemeler arasında, nötr tamponlu formalin gibi kimyasal reaktifler ile inaktive edilebilir. Tedavi hücre kültür plakaları veya tüp, bir sıvı dezenfektan ile dolu bir daldırma tankı ile laboratuvar formalin içeren ısı ile yapıştırılan torbalar içine yerleştirilmiş ve kaldırılması bulunmaktadır. Atık kovaları dezenfektan çözümleri ile dolu ve dezenfektanlar geçici deney sırasında ve DISI için oluşturulan atık almak için kullanılır sprey, Eldiven nfecting sırasıyla biyogüvenlik kabine yüzeyleri ve aletleri temizleme. listelenen konsantrasyona Kuaterner amonyum dezenfektan solüsyon tüm ABD BSL-4 laboratuvarlar (Barr J, kişisel iletişim, 2015) için altın standart olarak kabul edilir. Bir atık kovası Katı atık kirlenme potansiyelini ortadan kaldırmak için otoklava.

adına görsel akışı ve genel BSL-4 prosedürleri sınırlamaları göstermektedir, bir yaygın olarak kullanılan virüs prosedüre bir örnek olarak, standart bir virütik plak deneyi kullanılmıştır. Viral tahlil işlemi genel olarak tarif edilirken, bu protokolde laboratuvar personelinin güvenliğini sağlamak için kullanılan biyogüvenlik prosedürleri stres. Plak tahlil tekniği 8,9 ek arka plan için önceki klasik plak tahlil görselleştirme bakınız.

Burada sunulan prosedürler CDC 1 tarafından açıklanan BMBL talimatlarına uyun. Ancak, sunulan protokollerIRF-Frederick özgü. Her BSL-4 tesis BSL-4 laboratuvar içinde deneylerin yürütülmesini etkileyen farklı standart operasyon prosedürlerini (SOP) ve çalışma yöntemleri vardır. atık akımı yönetimi ve plak deneyleri yürütülmesi için alternatif prosedürler bu laboratuarların yönetimine ve işleyişine ilişkin olarak farklılık gösterebilir. Yine de, bir BSL-4 takım laboratuvar ve BSL-4 ortam içinde Class II dolapları işi gerçekleştirmek için prosedürlerin kurulum genel bir anlayış yüksek riskli patojenlerin çalışmaları düşünürken bilim adamları kısıtlamaları ve güvenlik etkileri anlamanıza yardımcı olacaktır. BSL-4 laboratuvarda çalışmalarını çevreleyen zorluklar dışında işbirlikçileri artan farkındalık düzeltilmiş beklenti ve araştırma topluluğu tıbbi önlemler geliştirmeye daha kolay yol açabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Laboratuvar Girişi

  1. Önce BSL-4 laboratuvara girmeden deney (örneğin, hücreler, medya ve sarf malzemeleri) için bir BSL-2 laboratuvar tüm malzemeleri toplayın.
  2. (Referans 7 ayrıntılı olarak belirtilen) BSL-4 girişi işlemini tamamlayın.

BSL-4 Laboratuvarı Sınıf II Biyogüvenlik Kurulu 2. Hazırlık

  1. Bir kez BSL-4 laboratuvar içinde tamamlanmıştır günlük iç kontrol listesini (Şekil 1) emin olun. Kontrol listesi önceden doldurulması ve virüsler kullanılacak olan işaret edilmemiş ise kontrol listesini doldurun. Kontrol listesi tamamlanmış ise, isim eklemek ve hangi virüs listesine kullanılacaktır.
  2. (% 5, çift dörtlü amonyum dezenfektan çözeltisi ile, örneğin, N-alkil dimetil benzil amonyum klorür, N-alkil dimetil benzil amonyum etil (kanat dahil) BSC tüm içini püskürtülerek Sınıf II BSC temizlemeajan klorür veya başka bir dezenfektan uygun kullanılır) ve kağıt havlu 10,11 ile siliniz ediliyor. yapışkan dezenfektan solüsyon kaldırmak için kabine ve kanat içinde% 70 etanol solüsyonu püskürtün.
  3. Oturmuş ise, kabinin arka ulaşılabilir olmasını sağlamak için rahat bir yükseklikte Sınıf II BSC önünde sandalye ayarlamak ve laboratuvar uzmanının yüz ön açılış yukarıda (Şekil 2) 11 yer aldığını.
  4. Biyogüvenlik kabini için bir atık kabını hazırlayın. çöp bidonuna çift dörtlü amonyum dezenfektan solüsyon son konsantrasyonu hiçbir% 5'ten az olduğundan emin olun. buna göre planlamak ve% 10 çözelti hangi atık dezenfektan sulandırmak olacağı eklenecektir yapmak. Buna ek olarak, sırasında ve testin tamamlanmasından sonra önce çıkarılması ve eldivenli elleri için bir ürün sprey Sınıf II BSC içinde% 5 çift dörtlü amonyum dezenfektan solüsyon ile bir sprey şişesi yerleştirin.
  5. <li> Hava akımının 11 Sınıf II BSC ve bozulma içine tekrarlanan malzeme tanıtımları önlemek için olabildiğince geri olarak kabinede Sınıf II BSC tüm deney için gerekli olan uygun malzemeler yerleştirin.

3. Örnek: plak deneyi

  1. virüs içeren örneklerini almak ve elle saklama konumundan virüsü kontrol ve 37 ° C'de bir inkübatör içinde malzeme eritin.
  2. planlanan virüs seyreltmeleri ile uygun olarak kullanılacak olan 6-çukurlu tablalara, etiketleyin. kapak ve gövde ayrılır başarılı ise eşleştirme sağlamak için levha kapakları ve vücut işaretleyin.
  3. Sınıf II BSC içine adım 3,1-3,2 malzemeleri getir. Diğer tarafta ( "kirli yüzü") üzerine ( "temiz tarafı") ve atık değil ya da bir tarafta virüs ile temas gelmeyecek tüm öğeleri yerleştirin. Eğer mümkünse, aerosol getirici faaliyetlerin 1 sırasında ayrı "kirli bulaşıklar" dan "temiz ürün" en az 30 cm1.
  4. Iç merkez kendini 11 korumanın en etkili pozisyonu olacak şekilde tasarlanmıştır olarak, mümkün olduğunca Sınıf II BSC iç merkezine yakın çalışın.
  5. Virüs numune ve kontrol virüsü 50 ul çıkarın ve% 2 fetal sığır serumu ile Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı içinde, 450 | il içine koyun. Kadar gerekli (Şekil 3A) olarak seri dilüsyonları yaparak devam edin.
  6. örneklerinde hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmek için çalışırken dilüsyonları sırasında, yavaş ve dikkatli bir pipet ile virüs numuneleri en az 5 kez karıştırın. iyi bir sonraki seyreltme her eklemeden sonra pipet uçları değiştirin.
  7. Son seyreltme, örnek 5 kez karıştırıldıktan sonra dilüsyonları eşit hacimlerde sağlamak için atık kabına virüs numunesinin 50 ul atın.
  8. ipuçları atarken, genci önce ucu içini ve dışını temizlemek için atık kova dezenfektan solüsyon ile her ucu durulayınAtık kovanın içine ucu ing.
  9. seyreltme yapıldıktan sonra, 6-çukurlu bir levhanın her çukuruna ortam 500 ul bırakarak kenara sulandırma kaynaklarının ayarlamak ve hücre kültürü levhasına ait gözler içindeki ortam aspire başlar.
  10. Bir kılavuzu, ayarlanabilir ses kullanarak pipet üstüne atık kova pipet, aspirat dezenfektan solüsyon ile bittiğinde, buton pipet, pipet içinin düzgün dekontaminasyonu sağlamak. Deneyin sonuna kadar atık kova içine ucu bırakın.
  11. Ortam plakalardan çıkarıldıktan sonra, her bir örnek için ipuçları, her değişen iki kopya halinde, önceden etiketlenmiş plakaları uygun kuyuya doğru numune 100 ul ilave edin.
  12. Plak tahlil aşılar tamamlanmasının ardından, dezenfektan solüsyon ile eldivenli ellerini sprey ve elle kuvöz içine geri plakaları koymadan önce tüm plakaları dışında silmek için dezenfektan solüsyon ile ıslatılmış kağıt havlu kullanın. YenidenTüm plakaları geri inkübatör içine kadar bu işlemi turba.
  13. 1 saat hücreleri üzerinde her 15 dk numunenin uygun dağılma sağlamak için şekil-8 hareket plakaları sallayın.
  14. Sallanan plakaları tamamlanmasından sonra, plak deneyi içinde bindirme için kullanılan bir 2x Eagle minimum zorunlu ortam maddesi karışımı ve% 1.6 kitre, agaroz daha işlemek için daha kolay olan bir yarı-katı kaplaması ile birlikte, Sınıf II BSC plakalara döndürür.
  15. de yüzeyi boyunca kaplamanın eşit dağılımı için şekil-8 hareket yeniden 6-çukurlu plaka ve kaya içinde her bir oyuğa katlamalı karışımı 2 ml ilave edilir. de kullanılan her bindirme karışımı ile kaplanmış kadar bu işlemi tekrarlayın.
  16. serolojik pipet ucu bindirme işlemi gerçekleştirmeden çapraz kontaminasyonu engellemek için kuyu herhangi bir sıvı temas etmediğinden emin olun.

4. Atık Bertaraf ve Temizlik Cihazları ve Biyogüvenlik Kurulu

<ol>
  • Tamamen en az 10 dakikalık bir temas süresi için atık kovası içerisinde% 5 dezenfektan çözelti içinde tüm atık malzeme daldırın. pipet uçları, serolojik pipet, ve yukarıda tarif edildiği gibi diğer atık dezenfekte. Buna ek olarak, solüsyon 10 dakika temas süresi için atık kovası ile temas halinde kalmasına izin% 5 dezenfektan solüsyon ile atık kova (içten ve dıştan) püskürtün.
  • atık geçmesi için temas süresi için beklerken,% 5 dezenfektan solüsyon ile bir kağıt havluyu emmek gibi mikropipetler olarak araçların aşağı silin ve BSC çıkarın. Sınıf II BSC dışında eldivenli ellerini getirmeden önce% 5 dezenfektan solüsyon ile eldivenli ellerini püskürtün.
    1. BSC gelen mikropipetler çıkardıktan sonra, araçlarla ilgili yapışkan oluşumunu önlemek için% 70 etanol çözeltisi ile ayrı bir kağıt havlu ile silin. etkin bir şekilde% 5 dezenfektan ile sildi olamaz herhangi aletleri Sprey ve 10 dakika boyunca BSC çözelti ile temas halinde bırakın.
  • Yeterli temas süresinden sonra, BSC tüm öğeleri kaldırmak. lavaboya atık malzemeleri içeren atık kovası dahil olmak üzere öğeleri, atın. Dezenfektan kalıntılarını temizlemek için yeniden kullanılabilir öğeleri durulayın. kendi depolama yerlerine tüm öğeleri döndürür.
  • Sınıf II BSC çalışma yüzeyini, kabine tarafını temizlemek ve geri camın iç ve% 5 dezenfektan solüsyon ile kanat 1% 70 etanol çözeltisi ile izledi.
  • çekin ve otoklav için ayrı pipet tepsilerine atık kovası ve yer yüzeyi dezenfekte serolojik pipetler serolojik pipetler tahliye (serolojik pipetler bir kavuz tehlikesi ve çöp torbası ile yırtılabilir. önce sert taraflı kap içinde bu pipetler yerleştirin otoklav).
  • lavabonun altına yerleştirilmiş bir süzgeç içine atık kovası içeriğini dökün.
  • straine içeriğini lavaboya kırmızı biohazard torba ile kaplı olduğu bir biyolojik tehlikeli atık konteyneri getirin ve dökümüKırmızı biyolojik tehlike torbaya r. süzgeç içine yapışabilir mikropipet ipuçları kaldırmak için süzgeç içine sokmayın. Bütün ipuçlarını kaldırılana kadar atık kabının içine boyunca süzgeç vurmak, ya da süzgeç ipuçları çıkarmak için cımbız kullanın.
  • lavabonun yanındaki rafa üzerinde kurumasına atık kova ve yeri durulayın.
  • 5. Otoklavlama Atık

    1. Bir arabası üzerinde bir otoklav tepsisine biyolojik tehlikeli atık kabı ve yerden biyolojik tehlike çantayı çıkarın.
    2. tepsiye güvenli çanta tutmak için otoklav tepsinin kenarlarına bağlayan, açık biohazard çanta bırakmak ve torba dışının üzerinde otoklav bant bir parça yerleştirin.
    3. serolojik pipet ucu tepsiye otoklav bant iki adet koyun ve kişinin baş harflerini ve tarih ile etiketleyin. otoklav tepsisi ile arabası üzerinde serolojik pipet tepsiye yerleştirin.
    4. otoklav açın. sağlanan otoklav yükleme / boşaltma ca bağlayınve otoklav için rt arabası üzerinde dinlenmek için geri çekilebilir otoklav platformu ortaya çıkarmak.
    5. otoklav metal çubuk çıkarın ve üst açın. Otoklav sterilizasyon döngüsü başarıyla tamamlandığını kontrol etmek için metal çubuk haline Geobacillus stearothermophilus sporları içeren bir biyolojik gösterge flakon yerleştirin.
    6. otoklav tepsisine atık torbasına merkezi haline metal çubuğu yerleştirin, ancak metal çubuk hala kolayca erişilebilir olduğundan emin olun.
    7. Geri çekilebilir otoklav platformu üzerine atık ve serolojik pipet tepsi ile dolu otoklav tepsiyi yerleştirin ve tekrar otoklav içine itin.
    8. otoklav gelen otoklav yükleme / boşaltma sepeti ayırın ve otoklav kapağı kapatın.
    9. otoklav başlatın.
    10. devir başlamıştır kadar otoklav bırakmayın. otoklav işletim ekranı o çalıştırmak için kalan süre gösterecektir.
    11. otoklav çalışma tamamlandıktan sonra, biyolojik ind kaldırmakicator ve belirli bir kuluçka makinesi içinde ısıtılarak büyüme değerlendirir. Büyüme biyolojik göstergesi tespit edilirse, otoklav çöp yeniden çalıştırın ve yeniden göstergeyi değerlendirmek. Hiçbir büyüme tespit edilirse, tesis çöp kaldırın.

    6. Örnek: Tespit ve Plak analizi boyanması

    1. geçti (kullanılan virüs bağlıdır) gün uygun sayıda sonra laboratuara geri dönmek ve bir kez daha bölümlerde 1. ve 2. adımları uygulayın.
    2. Dikkatle adım 3.1.2 tamamlanan inkübatör plak tahlil plakaları kaldırmak ve elle Sınıf II BSC içine yerleştirin.
    3. Ortam ve katlamalı malzeme her Pipet ve dezenfektan çözeltisi kap içine dağıtılması ve% 10 nötr tamponlu formalin,% 0.8 kristal violet 12,13 içeren bir karışım ile değiştirin. Karışım tabakalarına virüsü inaktive 30 dakika boyunca plakalar üzerinde kalmasına izin verin.
    4. inaktivasyon sonra, dikkatlice nötr kaldırmakAyrı bir çöp bidonuna tamponlu formalin / kristal viyole karışımı ve yer atılmadan önce nötralize edilecek.
    5. dezenfektan ile eldivenli ellerini Sprey ve yukarıda açıklandığı gibi Sınıf II BSC onları geçirmeden önce plakaların dışında silin.
    6. Fazla leke kaldırın ve sonra kurutmak için arabaya plakaları yerleştirmek için plakaları durulama, lavabo geçin.
    7. Plakalar tamamen kuruduktan sonra, plaklar saymak için bir ışık kutusu kullanın. Tüm sayıları kaydeder ve standart denklemi (Şekil 3B) virüs titreleri hesaplar.

    7. BSL-4 Laboratuvarı Numune Çıkarma

    1. BSL-2 laboratuvar koşullarında manipüle edilecek herhangi bir numune inaktive. Takip% 10'luk nötral tamponlu formalin (NBF) ya da Trizol LS (fenol, guanidin izotiosiyanat, amonyum tiyosiyanat, sodyum asetat, gliserol) 1,14 ile IRF-Frederick iç biyogüvenlik ofisi tarafından onaylanan iki yöntemden birini. aktarım saönce BSL-4 laboratuvar kaldırılması için ambalaj BSC dışında yeni bir temiz tüp veya plaka örnek olarak şunlar verilebilir.
    2. torbanın içine ve BSL-4 laboratuvar üzerinden transferi yapılan numune tüpleri dışında dezenfekte etmek için yeterli,% 5 dezenfektan veya sabitleyici çözeltisi içeren bir ısı ile yapıştırılan bir torbada tüpler ya da plakalar içinde ısı ile yapıştırılan etkisizleştirilmiş örnekler. Aynı prosedürü izleyerek başka kese içine bu keseyi yerleştirin.
    3. İkinci torba kapatılır ve ısıyla kaynaklanarak kese dışında dezenfekte en az 10 dakika süreyle,% 5 dezenfektan içeren bir daldırma tankı içine ısıyla kaynaklanarak kese yerleştirin.
    4. inaktivasyon yöntemi kullanılmış ve oda örnekleri transfer olacak yere, ajan kullanılan tüplere sayı ve tüplerin boyut, hacim ortaya koymaya laboratuarın içinde bir smaç tankı seyir defteri doldurun.
    5. dunk tankından keseyi almak ve BSL-2 laboratuara numune almak için BSL-4 laboratuvar dışında bir meslektaşım ile koordine edin.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    BSL-4 laboratuvar içinde uygun prosedürler izlenerek testlerin güvenli ve etkili tamamlanmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Tamamlanan günlük iç kontrol listesi (Şekil 1) atıfta bulunarak, laboratuvar personeli bu ekipman tam olarak faaliyete olduğundan emin olun. BSC merkezinde uygun vücut pozisyonu deney optimum hava akış koşulları (Şekil 2) altında gerçekleştirilir sağlar. Virüs Örnek seri plaka başına 30-300 plaklar (Şekil 3A) ve virüs titresi (Şekil 3B) belirlenmesi için olan levhalar elde etmek üzere seyreltilmiştir. Bir dizi faktör, konakçı hücre hatları için, virüs tropizm, aşılama tekniğinin virüs büyümesi, uygun seyreltme aralığı ve katlamalı seçimi 8 koşulları dahil olmak üzere, plak oluşumunu etkileyebilir. İşlem sırasında BSC oluşturulan Atık düzgün öncesinde otoklavlayarak önce BSC ve tekrar uzaklaştırılması için dezenfekte edilirBSL-4 ortamından ayrılmadan. Bu prosedürleri takip ederek, hiçbir laboratuvar enfeksiyonları IRF-Frederick de BSL-4 araştırma sırasında kaydedildi.

    Şekil 1
    Şekil 1:. Örnek günlük iç sistemler kontrol listesi Bu kontrol listesinin günlük tamamlama laboratuvar personeli öncesinde çalışmalarını başlatmak için laboratuvarda (en önemlisi BSC) içinde ekipman kontrol ettiğini sağlar. BSC kalibre aralığın dışında olduğu tespit edilirse, bu BSC kullanılmaması gerekir, ve bakım haberdar edilmelidir. Tüm BSC'ler düzgün kalibre ve işleyen. Gereken bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    şekil 2
    şekil 2:. Sarı dezenfektan solüsyon ve kullanılan pipetler içeren bir Sınıf II biyogüvenlik kabini bir laboratuvar uzmanı pipet örneklerinin Arka ve yan görünüm (A) Atık kova kuyucuğu (B) sağında, ve dezenfektan sprey şişesi için atık kovası (A) hakkı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    Şekil 3: Örnek viral titresi hesaplanması viral titresi mL başına plak oluşturan birim (pfu) olarak ifade edilir.. Viral titreyi hesaplamak için, seyreltme faktörü (d) ile seyreltildi virüs hacmi, oyuk (V) 'e ilave kez ürün tarafından açıkça tanımlanmış plakların (pfu) ve bölme sayısını.d / 53600 / 53600fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    BSL-4 laboratuvarda çalışma önemli bir zaman ve detaylara ek dikkat gerektirir. Bu ortamda çalışmanın herhangi bir tür iyi kapsamlı, eğitimli ve vicdani bireyler gerektirir. Tahlil laboratuar çalışanları eğitilmelidir hangi birkaç önemli kavramları karıştırmak gibi standart viral plak deneyi, BSL-4 laboratuvarda yüksek sonucu patojenler ile çalışmak için ortak bir prosedürün doğru bir model sağlar.

    İlk büyük konsept yüksek sonucu patojenler için birincil çevreleme olarak işlev Sınıf II BSC, uygun kullanım ve güvenli uygulamaların bir uygulamadır. Sınıf II BSC fonksiyonları büyük ölçüde bireylerin maruz riskleri sınırlamak uygulamaları dikte edecek nasıl anlayış. Sınıf II çalışma bölgesi boyunca kirlenmiş bölgeye temiz bir alandan iş akışı ( "temiz tarafı") ( "kirli yüzü") BSC da çapraz bulaşmayı 11 önlemeye yardımcı olur. Temiz ve kirlenmiş malzemeler ve suppller temiz bulaşıkların üzerine kirli maddelerin hareketini sınırlamak için ayrılmış olmalıdır.

    İkinci önemli kavram fiziksel ve biyolojik atık yönetimidir. atık iki tip atılmasının uygun adımlar laboratuvar uzmanları güvende kalır ve çevre kontamine olmadığını sağlanması esastır. bir deney sırasında Adımlar inaktive ve örnekler BSL-4 laboratuvar dışına çıkarılmadan önce patojenleri yok etmek için tasarlanmıştır. Böyle kritik adımlardan örnekler şunlardır: Her ucu içine dezenfektan pipetleme dezenfektanlar, otoklav atıkları ile potansiyel olarak kontamine malzemelerin en az 10 dk temas süresi sağlayan ve otoklav döngüleri sırasında sterilite doğrulama. Bu adımlar, yüksek sonucu patojenlerin imha sağlamak için gereksiz olacak şekilde tasarlanmıştır.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Micro-Chem Plus National Chemical Laboratories 255
    Ethanol Fisher BP2818500
    2 ml 96-Deep Well Plates Fisher 278743
    10 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11E
    25 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11
    6-well plates Fisher 140675
    Crystal Violet Sigma HT90132-1L
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher 22-050-105
    Tragacanth Fisher 50-702-2000 
    20 μl Pipette Tips Fisher 21-402-550
    200 μl Pipette Tips Fisher 21-402-561
    1,000 μl Pipette Tips Fisher 21-402-581
    DMEM Lonza 12-604Q
    FBS Sigma F2442-500mL
    Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
    2x EMEM Quality Biological 115-073-101
    Pipettor Drummond 4-000-101
    1,000 μl Pipette  Rainin  L-1000XLS+
    200 μl Pipette  Rainin  L-200XLS+
    12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor Rainin L12-200XLS+
    8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor Rainin LA8-1200XLS
    Attest Express Medical Supplies  MMM12192
    Autoclave Getinge GEB 2404 AMB-2
    Autoclave Bag Fisher 01-828E
    2,000 ml Beaker Fisher 02-591-10H
    Autoclave Tray Fisher 13-359-20B
    Pipette Tray Fisher 13-361-5
    37 °C Incubator Fisher WU-39321-00
    Biohazard Can Rubbermaid Commercial FG614500 RED
    Autoclave Tape Fisher 15-903
    Autoclave Rod Made by IRF Facility N/A
    Light Box Fisher S11552
    Heat Sealer Fisher NC9793612 
    Heat Seal Pouches Fisher 01-812-25H
    Biohazard Bag Fisher 01-828E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. , U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
    2. Bioterrorism agents/diseases by category. Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
    3. Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. The White House, Office of the Press Secretary. Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
    4. Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
    5. de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
    6. Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
    7. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. (2015).
    8. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. e52065 (2014).
    9. Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. e4297 (2012).
    10. Biosafety manual for Texas Tech University. Texas Tech University. Lubbock, TX. Available from: http://www.depts.ttu.edu/ehs/web/docs/ttu_biosafety_manual.pdf (2005).
    11. Working safely in your NuAire biological safety cabinet. NuAire. Plymouth, MN. Available from: http://ors.uchc.edu/bio/resources/pdf/3.2.3.A.3_nuaireBSC.pdf (2015).
    12. Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. (2015).
    13. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
    14. Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).

    Erratum

    Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
    Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

    A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

    One of the authors names was corrected from:

    Nicole Joselyn

    to:

    Nicole Josleyn

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics