Sikkerhedsforanstaltninger og driftsprocedurer i et (A) BSL-4 Laboratorieundersøgelser: 2. Generelle Practices

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mazur, S., Holbrook, M. R., Burdette, T., Josleyn, N., Barr, J., Pusl, D., Bollinger, L., Coe, L., Jahrling, P. B., Lackemeyer, M. G., Wada, J., Kuhn, J. H., Janosko, K. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices. J. Vis. Exp. (116), e53600, doi:10.3791/53600 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Arbejde i et bio-niveau 4 (BSL-4) inddæmning laboratorium kræver tid og stor sans for detaljer. Det samme arbejde, der er gjort i en BSL-2 laboratorium med ikke-høj konsekvens patogener vil tage betydeligt længere i en BSL-4 indstilling. Denne øgede tid krav skyldes en lang række faktorer, der tager sigte på at beskytte forsker fra laboratorie-infektioner, arbejdsmiljø fra potentiel forurening og lokalsamfundet fra mulige frigivelse af høj konsekvens patogener. Inde i laboratoriet, er bevægelse begrænset på grund af luftslanger knyttet til de obligatoriske full-body sikkerhed jakkesæt. Desuden er desinfektion af hvert element, der er fjernet fra klasse II biosikkerhed kabinetter (BSC) påkrævet. Laboratorieundersøgelser specialister skal uddannes i praksis i BSL-4 laboratorium og skal vise stor færdighed i de færdigheder, de udfører. Fokus i denne artikel er at skitsere korrekte procedurer og teknikker til at sikre laboratorium biosafety og eksperimentel nøjagtighed ved anvendelse af en standard viral plaque-assay som et eksempel procedure. Især korrekte teknikker arbejde sikkert i en BSL-4 miljøet, når du udfører et eksperiment vil blive visuelt fremhævet. Disse teknikker omfatter: at oprette en klasse II BSC for eksperimenter, ordentlig rengøring af klasse II BSC når færdig med at arbejde, affaldshåndtering og sikker bortskaffelse af affald, der produceres i et BSL-4 laboratorium, og fjernelse af inaktiverede prøver fra inde i en BSL- 4 laboratorium til BSL-2 laboratorium.

Introduction

Som sikkerhed for laboratoriepersonale, der håndterer høj konsekvens patogener (ingen infektion forebyggelser eller behandlingsmuligheder eksisterer) er altafgørende, har det amerikanske Department of Health og Human Services etablerede retningslinjer for anlæg konstruktion og bedste praksis for sikker gennemførelse af arbejdet med patogener i biomedicinsk og kliniske laboratorier fra et bio perspektiv 1. Gennem lovgivning og regulering, mange af de metoder og procedurer er blevet obligatoriske krav, der skal følges for arbejdet med disse patogener. I USA, patogener, som er let overføres fra person til person, resultere i høje sag dødelighed, og / eller har potentiale for stor indflydelse den offentlige sundhed og bioterrorisme, er kategoriseret som National Institute of Health / National Institute of Allergy og smitsomme sygdom (NIH / NIAID) prioritet A patogener og eller Centers for Disease Control og Forebyggelse (CDC) Bioterrorisme kategori A Agenter to. Desuden hIGH-konsekvens patogener er klassificeret som Tier 1 Vælg Agenter hvis disse patogener er potentielle bioterrorisme agenter, har potentiale for massedrab eller ødelæggende virkninger for økonomien, kritisk infrastruktur eller offentlighedens tillid 3.

BSL-4 operationer, herunder adgang til institutter med BSL-4 laboratorier, der er mere meget kontrolleret end BSL-2/3 operationer. For eksempel er det betydeligt vanskeligere at få adgang til en BSL-4 laboratorium i forhold til en BSL-2 eller BSL-3 laboratorium grundet betydelige kulør uddannelseskrav, omfattende mentorordninger krav, og yderligere medicinsk biosikkerhed forudsætninger. Desuden er der typisk mere fysiske sikkerhedsforanstaltninger barrierer i en BSL-4 facilitet versus en BSL-2 eller BSL-3 anlæg 4-6. Som beskrevet i vores første artikel om procedurer BSL-4 indrejse og udrejse, laboratoriepersonale gennemgå omfattende uddannelse og psykologisk screening for at kvalificere sig til indgangen til BSL-4 laboratorium 7. Wnden for BSL-4 laboratorium, er risiko for infektion og fejltagelser undgås eller mildnes ved at følge etablerede procedurer. Forskning skal gå forsigtigt og bevidst, med minimal multitasking eller distraktioner. Bøjet over i positive trykdragter er vanskelig, og ansigtsmaske kan begrænse procedurer såsom mikroskopi. Voluminøse handsker hindre udførelsen af ​​finmotoriske opgaver, såsom håndtering af småting eller mærkning rør. For at minimere tidsforbruget i BSL-4 laboratorier, bør laboratorium specialister gennemgå arbejdsgange for at identificere trin, der kan gøres foran i en BSL-2 laboratorium og derefter transportere disse materialer i BSL-4 laboratorium for færdiggørelse af opgaven (r). Når du fjerner materiale til videre forarbejdning i BSL-2 laboratorium, materialer fast og fjernes fra BSL-4 laboratorium i en forseglet sekundær beholder. Eksempler på prøver, der kan have brug for at blive fjernet, omfatter: faste plader eller rør af inficeret materiale, der vil blive analyseret ved enzymbundet immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescens-assay (IFA), eller polymerasekædereaktion (PCR).

Ud over større fysiske begrænsninger, som personlige værnemidler, der kræves i BSL-4 laboratorier sammenlignet med dem i BSL-2 laboratorier, procedurer for inaktivering af høj konsekvens patogener i cellekultur plader og bortskaffelse af affald er strengere end dem, der kræves for mindre patogene vira undersøgt i et BSL-2 laboratorium. Som minimum bør disse metoder opfylder CDC krav. For eksempel kan forurenet cellekultur plader og andre materialer inaktiveres med kemiske reagenser, såsom neutral-pufret formalin. Behandlede cellekulturplader eller rør skal placeres i varmklæbende poser indeholdende formalin og fjernes fra laboratoriet via en dunk tank fyldt med en væske desinfektionsmiddel. spande Affald fyldt med desinficerende løsninger og spray desinfektionsmidler anvendes til midlertidigt at modtage affald, der opstår i løbet af eksperimentet og Disinfecting handsker, rengøring biosikkerhed kabinet overflader og instrumenter, hhv. Kvartær ammonium desinficerende opløsning på den anførte koncentration betragtes som den gyldne standard for alle amerikanske BSL-4 laboratorier (Barr J, personlig kommunikation, 2015). Fast affald fra spild spand er autoklaveres for at eliminere risikoen for forurening.

I et forsøg på at visuelt vise arbejdsgangen og begrænsninger generelle BSL-4 procedurer, brugte vi en standard viral plaque assay som et eksempel på et almindeligt anvendt viral procedure. Mens den virale assay procedure er beskrevet i almindelighed, understreger vi de biosikkerhed procedurer, der anvendes til at sikre sikkerheden for laboratoriepersonale i denne protokol. Der henvises til tidligere klassiske plak assay visualiseringer for yderligere baggrund på plaque assay teknik 8,9.

De procedurer, der præsenteres her følger BMBL specifikationer skitseret af CDC 1. Men de præsenterede protokoller erspecifikke for IRF-Frederick. Hver BSL-4 anlæg har forskellige standardprocedurer (SOP) og virkemåde, der påvirker udførelsen af ​​eksperimenter inden for BSL-4 laboratorium. Alternative procedurer for affaldsstrømmen ledelse og udførelse af plak assays kan variere baseret på forvaltningen og driften af ​​disse laboratorier. Ikke desto mindre vil en generel forståelse af opsætningen af ​​et BSL-4 dragt laboratorium og procedurer til at udføre arbejdet med klasse II kabinetter inde i BSL-4 miljø hjælpe forskerne forstå de begrænsninger og sikkerhedsmæssige konsekvenser, når de overvejer studier af risiko patogener høje. Øget bevidsthed om eksterne samarbejdspartnere i de vanskeligheder, der omgiver arbejde i et BSL-4 laboratorium kan føre til justerede forventninger og større lethed i at udvikle medicinske modforanstaltninger i forskningsverdenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Laboratory indtastning

  1. Saml alle leverancer fra en BSL-2 laboratorium for eksperimentet (fx celler, medier og hjælpematerialer) forud for indtræden i BSL-4 laboratorium.
  2. Gennemfør proceduren for BSL-4 post (skitseret i detaljer i henvisning 7).

2. Udarbejdelse af en klasse II biosikkerhed kabinet i BSL-4 Laboratory

  1. Inde i BSL-4 laboratorium, sikre den daglige interne tjekliste (figur 1) er afsluttet. Udfyld tjeklisten, hvis tjeklisten ikke tidligere er blevet udfyldt og angive, hvilke virus, vil blive brugt. Hvis tjeklisten allerede er afsluttet, tilsættes navn, og som virus vil blive brugt til listen.
  2. Rengør Klasse II BSC ved sprøjtning ned hele indersiden af BSC (herunder rammen) med 5% dual kvaternær ammonium desinficerende opløsning (f.eks n-alkyl Dimethylbenzylammoniumchlorid, n-alkyl dimethyl ethyl benzyl ammoniumchlorid eller andet desinfektionsmiddel passende for midlet, der anvendes) og tørre ned med køkkenrulle 10,11. Spray 70% ethanolopløsning inde i kabinettet og rammen for at fjerne klæbrige desinficerende opløsning.
  3. Hvis siddende, sætte stolen foran klasse II BSC i en behagelig højde for at sikre, at der kan opnås på bagsiden af kabinettet, og at ansigtet af laboratoriet specialist ligger over den forreste åbning (figur 2) 11.
  4. Forbered en affaldscontainer for biosikkerhed kabinet. Sikre at den endelige koncentration af dobbelt kvaternær ammonium desinficerende opløsning i affaldscontaineren er ikke mindre end 5%. Planlæg i overensstemmelse hermed og lave en 10% opløsning til hvilken affaldet vil blive tilføjet som vil udvande desinfektionsmiddel. Derudover placere en sprayflaske med 5% dual kvaternær ammonium desinficerende opløsning inde i klasse II BSC at sprøjte nogen produkter før fjernelse og behandskede hænder under og efter afslutningen af ​​assayet.
  5. <li> Placer egnede materialer, der er nødvendige for hele eksperiment i klasse II BSC så langt tilbage i skabet som muligt for at undgå gentagne materiale introduktioner i klasse II BSC og afbrydelse af luftstrømmen 11.

3. Eksempel: Plaque Assay

  1. Hent virus-holdige prøver og kontrollere virus fra opbevaringsstedet med hånden og tø materialer i en inkubator ved 37 ° C.
  2. Mærk brøndene i 6-brønds plader, der skal anvendes ifølge virusfortyndingerne planlagt. Markér låg og krop af pladerne for at sikre en vellykket matchning, hvis låg og krop er adskilt.
  3. Bring materialer fra trin 3,1-3,2 ind i klasse II BSC. Læg alle genstande, som ikke eller ikke vil komme i kontakt med virus på den ene side ( "rene side"), og affald på den anden side ( "beskidte side"). Hvis det er muligt, at holde "rene poster" mindst 30 cm afstand fra "beskidte poster" under aerosol-genererende aktiviteter 11.
  4. Arbejde så tæt på indersiden midten af klasse II BSC som muligt, som indvendig center er designet til at være den mest effektive position til at beskytte sig 11.
  5. Fjern 50 pi virus prøve og kontrol-virus og anbringes i 450 pi Dulbeccos modificerede Eagles medium med 2% føtalt bovint serum. Fortsæt med at gøre seriefortyndinger så langt ud efter behov (figur 3A).
  6. I løbet af fortyndinger, blande virus prøver mindst 5 gange med en pipettespids langsomt og forsigtigt, mens du prøver at minimere luftboble generation i prøverne. Skift pipettespidserne efter hver tilsætning til næste fortynding godt.
  7. I den sidste fortynding, efter blanding af prøven 5 gange, kassere 50 pi virus prøven i affaldsbeholder for at sikre lige store volumener af fortyndinger.
  8. Ved bortskaffelse af tips, skylles hver spids med desinficerende opløsning fra affaldet spand til at rense indersiden og ydersiden af ​​spidsen før expelling spidsen ind i affaldet spand.
  9. Når fortyndinger fremstilles, indstille fortyndingsforhold brønde til side og begynde opsugning medier fra brøndene i cellekulturplader, hvorefter 500 pi medier i hver brønd i en 6-brønds plade.
  10. Når færdig med pipettespidsen, aspireres desinficerende opløsning fra affaldet spand til toppen af ​​pipetten ved hjælp af en manuel, justerbar volumen, trykknap-pipette, for at sikre korrekt dekontaminering af indersiden af ​​pipetten. Efterlad spidsen ned i affaldet spand indtil afslutningen af ​​eksperimentet.
  11. Når medierne er blevet fjernet fra pladerne, tilsættes 100 pi af den korrekte prøve i den korrekte brønd i præ-mærkede plader i to eksemplarer, skiftende tips hver for hver prøve.
  12. Ved afslutningen af ​​plaque assay vaccinationer, spray off behandskede hænder med desinficerende opløsning og bruge en køkkenrulle vædet med desinficerende opløsning til at aftørre ydersiden af ​​alle plader, før du placerer pladerne tilbage i inkubatoren i hånden. Retørv denne proces, indtil alle plader er tilbage i inkubatoren.
  13. Rock pladerne i en 8-tals bevægelse for at sikre en korrekt spredning af prøven over cellerne hver 15 min i 1 time.
  14. Ved afslutningen af ​​rocking plader, returnere plader ind i klasse II BSC sammen med en blanding af 2x Eagles minimale essentielle medium og 1,6% tragant, et halvfast overlay, der er lettere at manipulere end agarose, der anvendes til overlejring af plaque assay.
  15. Tilsæt 2 ml af overlay blandingen til hver brønd i en 6-brønds plade og rock igen i en 8-tals forslag til ligelig fordeling af overlægget hele overfladen af ​​brønden. Gentag denne proces, indtil alle brugt godt overlejres med overlay blanding.
  16. Sørg for, at spidsen af ​​serologiske pipette ikke rører nogen væske i brøndene for at undgå krydskontaminering, når du udfører overlay procedure.

4. Affald Bortskaffelse og rengøring af instrumenter og biosikkerhed Cabinet

<ol>
  • Helt oversvømme alt affaldsmateriale i 5% desinficerende opløsning i affaldet spand for en kontakttid på mindst 10 min. Desinficere pipettespidser, serologiske pipetter og andet affald, som beskrevet ovenfor. Desuden sprøjte affald spand (indefra og ud) med 5% desinficerende opløsning, hvorefter opløsningen forbliver i kontakt med affaldet spand til en kontakttid på 10 minutter.
  • Mens vi venter på den kontakt, tid til at gå for affaldet, sættetid et stykke køkkenrulle med 5% desinficerende opløsning, tørre ned instrumenter såsom mikropipetter, og fjerne dem fra BSC. Spray behandskede hænder med 5% desinficerende opløsning før at bringe behandskede hænder ud af klasse II BSC.
    1. Efter fjernelse af mikropipetter fra BSC, tørre dem med et separat stykke køkkenrulle med 70% ethanol løsning til at undgå klistret oprustning på instrumenterne. Spray alle instrumenter, der ikke effektivt kan tørres af med 5% desinfektionsmiddel og efterlade i kontakt med opløsningen i BSC i 10 min.
  • Efter tilstrækkelig kontakttid, fjerne alle elementer fra BSC. Tag poster, herunder affald spand indeholdende affaldsmaterialer, til vasken. Skyl elementer, der kan genbruges til at fjerne desinficerende rest. Retur alle elementer til deres oplagringssteder.
  • Rengør klasse II BSC arbejde overflade, fryser sider og ryg, indre af glas, og rammen 1 med 5% desinficerende opløsning efterfulgt af 70% ethanol løsning.
  • Træk og dræne de serologiske pipetter fra affald spand og sted overfladeaktive desinficeret serologiske pipetter i separate pipette bakker til autoklavering (serologiske pipetter kan udgøre en skarpe fare og kan rive gennem papirkurven taske. Placer disse pipetter i en hård-sidet beholder før autoklavering).
  • Hæld indholdet af affald spanden i en si anbragt i bunden af ​​vasken.
  • Medbring en biologisk farligt affald beholder, der er foret med et rødt biohazard taske til vasken og dump indholdet af strainer ind i det røde biohazard taske. Ræk ikke ind i si for at fjerne mikropipette tips, der kan holde sig til indersiden af ​​sien. Hit sien langs indersiden af ​​affaldsbeholderen, indtil alle tips er fjernet, eller bruge en pincet til at fjerne tip fra sien.
  • Skyl affaldet spand og sted at tørre på stativet ved siden af ​​vasken.
  • 5. Autoklavering affald

    1. Fjern biohazard taske fra beholder og sted for biologisk betinget fare affald i en autoklave bakke på en vogn.
    2. Efterlad biohazard poser åbne og lægge et stykke autoklave tape over ydersiden af ​​posen, der forbinder siderne af autoklaven bakke til at holde posen fastgjort i bakken.
    3. Placer to stykker autoklave tape på serologisk pipette spids bakke og mærke det med sine initialer og dato. Placer serologisk pipette bakke på vognen med autoklaven bakken.
    4. Åbne autoklaven. Tilslut det medfølgende autoklave lastning / losning cart til autoklaven og bringe det optrækkelige autoklave platform til at hvile på vognen.
    5. Fjern metalstangen fra autoklaven og åbne toppen. Placer en biologisk indikator hætteglas indeholdende sporer af Geobacillus stearothermophilus i metalstangen at kontrollere, at autoklaven sterilisation cyklus blev afsluttet med succes.
    6. Placer metalstang ind til centrum af affaldsposen i autoklaven magasinet, men sikrer, at metalstangen er stadig let tilgængelige.
    7. Placer autoklave bakke fyldt med affald og serologisk pipette bakke på optrækkelige autoklave platform og skubbe den tilbage i autoklaven.
    8. Frigør autoklaven lastning / losning vogn fra autoklaven og luk autoklaven dør.
    9. Start autoklaven.
    10. Lad ikke autoklaven, indtil cyklussen er startet. Den opererer skærm af autoklaven vil indikere resterende tid for at køre.
    11. Efter autoklaven kørslen er færdig, skal du fjerne den biologiske indICATOR og evaluere for vækst ved opvarmning i en specificeret inkubator. Hvis der registreres vækst på den biologiske indikator, re-run papirkurven i autoklaven, og vurdere ny indikator. Hvis der ikke registreres vækst, fjerne papirkurven fra anlægget.

    6. Eksempel: Fastsættelse og Farvning af plakanalyser

    1. Efter det passende antal dage (som er afhængigt af den anvendte virus) er gået, vender tilbage ind i laboratoriet og udfør trin fra punkt 1 og 2 igen.
    2. Fjern forsigtigt plak assay plader fra inkubatoren afsluttet i trin 3.1.2, og anbringes i klasse II BSC i hånden.
    3. Pipette off alle de medier og overlay materiale og dispensere i desinficerende opløsning beholder og erstatte med en blanding af 10% neutral bufferet formalin og 0,8% krystalviolet 12,13. Lad blandingen forblive på pladerne i 30 minutter for at inaktivere virusset på pladerne.
    4. Efter inaktivering, forsigtigt fjerne neutralebufferet formalin / krystalviolet blandingen og sted i en separat beholder affald, der skal neutraliseres før bortskaffelse.
    5. Spray behandskede hænder med desinfektionsmiddel og tørre ydersiden af ​​pladerne før passerer dem ud af klasse II BSC som beskrevet ovenfor.
    6. Fortsæt til vasken, skylles pladerne for at fjerne overskydende pletten, og derefter placere pladerne på en vogn for at tørre.
    7. Når pladerne er helt tørre, kan du bruge en lyskasse til at tælle plaques. Optag alle tæller og beregne virustitere fra standard ligning (figur 3B).

    7. Fjernelse Prøver fra BSL-4 Laboratory

    1. Inaktivere eventuelle prøver, der vil blive manipuleret under BSL-2 laboratorieforhold. Følge en af to metoder, der er godkendt af den interne biosikkerhed kontor på IRF-Frederick anvendelse af 10% neutral-pufret formalin (NBF) eller Trizol LS (phenol, guanidinisothiocyanat, ammoniumthiocyanat, natriumacetat, glycerol) 1,14. Transfer samples til en ny ren rør eller plade uden for BSC før emballage til fjernelse fra BSL-4 laboratorium.
    2. Varmeforsegling inaktiverede prøver i rør eller plader i en varmeforseglet pose indeholder tilstrækkeligt 5% desinfektionsmiddel eller fikseringsopløsning at desinficere indersiden af ​​posen og ydersiden af ​​prøverørene undergår overførsel ud af BSL-4 laboratorium. Placer denne pose i en anden pose efter samme procedure.
    3. Forsegle den anden pose og placere det varmeforseglede pose i en dunk tank indeholdende 5% desinficerende opløsning i mindst 10 min at desinficere ydersiden af ​​det varmeforseglede pose.
    4. Udfyld en dunk tank logbog inde i laboratoriet ved at afgrænse antallet og størrelsen af ​​rør, volumen i rør, middel, der anvendes, inaktivering anvendte metode, og plads til hvor prøver vil blive overført.
    5. Koordinere med en kollega på ydersiden af ​​BSL-4 laboratorium for at hente posen fra dunk tank og udtage prøver til BSL-2 laboratorium.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Efter korrekte procedurer i BSL-4 laboratorium er afgørende for at sikre en sikker og effektiv gennemførelse af analyser. Ved at henvise til den udfyldte daglige interne tjekliste (figur 1), laboratoriepersonale sikre, at udstyret er fuldt funktionsdygtigt. Korrekt organ positionering i midten af BSC sikrer, at forsøget udføres under optimale luftstrømningsbetingelser (figur 2). Viruset Prøven fortyndes serielt til opnåelse plader, der har 30-300 plaques per plade (figur 3A) og til bestemmelse virustiter (figur 3B). En række faktorer påvirker dannelsen af plaques, herunder virus tropisme for vært cellelinjer, podning teknik, betingelser for virus vækst, passende fortynding rækkevidde, og overlay udvælgelse 8. Affald genereret i BSC under proceduren er korrekt desinficeret før fjernelse fra BSC og igen ved autoklavering førforlader BSL-4 miljø. Ved at følge disse procedurer, er der ikke laboratorie-infektioner blevet registreret under BSL-4 forskning på IRF-Frederick.

    figur 1
    Figur 1:. Prøve daglige interne tjekliste Daglig gennemførelse af denne tjekliste sikrer, at laboratoriepersonale har kontrolleret udstyr i laboratoriet (vigtigst BSC) før initiering arbejde. Hvis BSC viser sig at være uden for det kalibrerede område, må dette BSC ikke anvendes, og vedligeholdelse skal anmeldes. Alle BSC skal være behørigt kalibreret og fungerer. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2:. Tilbage og fra siden af en laboratorie specialist pipettering prøver i en klasse II biosikkerhed kabinet (A) Affald spand indeholder gul desinficerende opløsning og brugte pipetter er til højre for de brønde (B), og desinfektionsmidlet sprayflaske er at højre for affald spand (a). klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3: Beregning af viral titer af prøve Viral titer udtrykkes som plakdannende enheder (pfu) per ml.. For at beregne den virale titer, tælle antallet af klart definerede plaques (pfu) og dividere med produktet af fortyndingsfaktoren (d) gange volumenet af fortyndet virus til brønden (V).d / 53600 / 53600fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Arbejde i et BSL-4 laboratorium kræver megen tid og ekstra opmærksomhed for detaljer. Enhver form for arbejde i dette miljø kræver veluddannede, grundig og samvittighedsfulde individer. Standarden viral plaque assay giver en nøjagtig model af en fælles procedure for at arbejde med high-konsekvens patogener i BSL-4 laboratorium, som analysen omfatter flere store begreber, som laboratorie arbejdere skal uddannes.

    Den første store koncept er korrekt brug og anvendelse af sikker praksis i klasse II BSC, der fungerer som primær inddæmning til high-konsekvens patogener. Forståelse af, hvordan en klasse II BSC funktioner vil diktere praksis, der i høj grad begrænse risikoen for eksponering for enkeltpersoner. Work flow fra et rent område ( "rene side") til en forurenet område ( "beskidte side") på tværs arbejdet zone i klasse II BSC hjælper også til at undgå krydskontaminering 11. Ren og kontaminerede materialer og supplerne skal holdes adskilt for at begrænse bevægelsen af ​​forurenede genstande end rene elementer.

    Det andet store koncept er fysisk og biologisk affaldsbehandling. Ordentlig skridt i bortskaffelse begge typer affald er afgørende at sikre, at de laboratorieundersøgelser specialister forbliver sikkert og miljøet ikke forurenes. Skridt under et eksperiment er designet til at inaktivere og ødelægge patogener, før prøverne føres ud af BSL-4 laboratorium. Eksempler på sådanne kritiske skridt omfatter: pipettering desinfektionsmiddel i hvert tip, så i det mindste en 10 min kontakttid af potentielt forurenede materialer med desinfektionsmidler, autoklavering affald, og validering sterilitet under autoklave cyklusser. Disse skridt er designet til at være overflødigt at sikre destruktion af høj konsekvens patogener.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Micro-Chem Plus National Chemical Laboratories 255
    Ethanol Fisher BP2818500
    2 ml 96-Deep Well Plates Fisher 278743
    10 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11E
    25 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11
    6-well plates Fisher 140675
    Crystal Violet Sigma HT90132-1L
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher 22-050-105
    Tragacanth Fisher 50-702-2000 
    20 μl Pipette Tips Fisher 21-402-550
    200 μl Pipette Tips Fisher 21-402-561
    1,000 μl Pipette Tips Fisher 21-402-581
    DMEM Lonza 12-604Q
    FBS Sigma F2442-500mL
    Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
    2x EMEM Quality Biological 115-073-101
    Pipettor Drummond 4-000-101
    1,000 μl Pipette  Rainin  L-1000XLS+
    200 μl Pipette  Rainin  L-200XLS+
    12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor Rainin L12-200XLS+
    8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor Rainin LA8-1200XLS
    Attest Express Medical Supplies  MMM12192
    Autoclave Getinge GEB 2404 AMB-2
    Autoclave Bag Fisher 01-828E
    2,000 ml Beaker Fisher 02-591-10H
    Autoclave Tray Fisher 13-359-20B
    Pipette Tray Fisher 13-361-5
    37 °C Incubator Fisher WU-39321-00
    Biohazard Can Rubbermaid Commercial FG614500 RED
    Autoclave Tape Fisher 15-903
    Autoclave Rod Made by IRF Facility N/A
    Light Box Fisher S11552
    Heat Sealer Fisher NC9793612 
    Heat Seal Pouches Fisher 01-812-25H
    Biohazard Bag Fisher 01-828E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. , U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
    2. Bioterrorism agents/diseases by category. Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
    3. Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. The White House, Office of the Press Secretary. Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
    4. Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
    5. de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
    6. Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
    7. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. (2015).
    8. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. e52065 (2014).
    9. Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. e4297 (2012).
    10. Biosafety manual for Texas Tech University. Texas Tech University. Lubbock, TX. Available from: http://www.depts.ttu.edu/ehs/web/docs/ttu_biosafety_manual.pdf (2005).
    11. Working safely in your NuAire biological safety cabinet. NuAire. Plymouth, MN. Available from: http://ors.uchc.edu/bio/resources/pdf/3.2.3.A.3_nuaireBSC.pdf (2015).
    12. Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. (2015).
    13. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
    14. Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).

    Erratum

    Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
    Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

    A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

    One of the authors names was corrected from:

    Nicole Joselyn

    to:

    Nicole Josleyn

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics