אמצעי בטיחות ונהלי הפעלה בבית (א) BSL-4 מעבדה: 3. Aerobiology

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bohannon, J. K., Janosko, K., Holbrook, M. R., Barr, J., Pusl, D., Bollinger, L., Coe, L., Hensley, L. E., Jahrling, P. B., Wada, J., Kuhn, J. H., Lackemeyer, M. G. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology. J. Vis. Exp. (116), e53602, doi:10.3791/53602 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

העברת וירוסים מתרחשת בדרך כלל על ידי מגע ישיר או פיזי, אך רבים מחלות ויראליות חשוב (למשל, חצבת, אבעבועות רוח, שפעת) נגרמות על ידי פתוגנים המועברים על ידי תרסיס או טיפות הנשימה. פתוגנים כאלה יש פוטנציאל לגרום מגיפה עם השלכות החל ממחלה מתונה נפוצה בא לידי ביטוי באובדן העבודה (למשל, הצטננות) כדי נדירות מחלה רצינית עם הקטלניות גבוהה (למשל, מחלת האבעבועות השחורות). פתוגנים גבוה תוצאה שהתפשט באופן טבעי על ידי תרסיס או על ידי שחרור אירוסול מכוון (נשק ביולוגי) הם בעלי העניין מיוחד aerobiology 1. בני אדם עלולים להידבק במהירות עם כמה פתוגנים אלה על ידי טיפות נשימה גדולות או גרעינים קטן-חלקיק ובקלות להפיץ פתוגנים אלה לאחרים דרך פרשות רוק, שיעול, התעטשות 2. בקהילה להגנה מפני טרור ביולוגי בארה"ב, פתוגנים גבוהה מכך (למשל, הפילו-וירוסים או Ca NIAID אחריםפתוגנים עדיפים tegory AC וסוכני הטרור הביולוגי CDC) הם המוקד של תוכניות מחקר אירוסול בשל הקטלניות גבוהות של הזיהומים הקשורים 3,4. צעדים מדעיים משמעותיים בתחום aerobiology נעשו בעשור האחרון בשל התקדמות טכנולוגית בציוד אירוסול ומתקני בלימה גבוה 5,6. המחקר של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIH / NIAID), מתקן מחקר משולב בפורט דטריק הממוקם פרדריק, MD, ארה"ב (IRF-פרדריק) מתמקד פתוגנים המתעוררים גבוהה תוצאה הדורשים בטיחות ביולוגית חיה רמה 4 בלימה (ABSL-4). המשימה הכוללת של IRF-פרדריק היא להעריך להקל על הפיתוח של חיסוני מועמד ותרופות (נגד רפואי).

מחקר עם פתוגנים גבוהה תוצאה בבית IRF-פרדריק נשלטת על ידי בטיחות ביולוגית מחמירים טיפול בבעלי חיים דרישות השימוש. requir אלהements המפורטת ב הבטיחות הביולוגית ב מיקרוביולוגיות ביו מעבדות (BMBL) ידני 7 והתקנות הרווחה הפדרליות חיה. דרישות נחוצות אלה עשויות להגביל את סוג המחקר שניתן לבצע ולהשפיע מערך מחקר כללי. ככל שאנו שתוארנו לעיל ביומן הזה, אך כל המחקרים שנערכו בסביבה ABSL-4 מחייב זהירות מיוחדת, הכשרה מאוד מיוחדת, וכן מתקן חזק מיותר תשתית 8,9.

וכניסה במעבדת חליפת IRF-פרדריק ABSL-4 דורשת עוטה בלחץ חיובי encapsulating חליפה 8. בלחץ חיובי encapsulating חליפות אינם נדרש להזנה במעבדת ארון ABSL-4. עוטה חליפה לשפשף, כפפות גומי או ניטריל, ונעליים צבאיות קרוב מתאים כאשר מניפולציה חומר זיהומיות סיכונים קבוצה 4 בתוך בטיחות ביולוגית מוסמך Class III הקבינט (BSC) במעבדה ארון ABSL-4 7.

באותו IRF-פרדריק, ציוד תרסיס מתוכנן, התאספו, ומתוחזק בשני הרמטית, נירוסטה, אוויר חזק, מחלקה שלילית בלחץ III BSCs, איור 1. הליבה IRF-פרדריק Aerobiology מעסיקה פלטפורמת ניהול אירוסול אוטומטי ( AAMP) לשלוט ולפקח ניסויים אירוסול בתוך BSCs אלה, איור 2. פרסום קודם התווה את הפונקציות הספציפיות של III BSCs המחלקה בבית IRF-פרדריק והקשר למעבדת החליפה דרך יציאת תמסורת 5. ההליך של הכנת BSC Class III לפני הניסויים הוא ספציפית IRF. III BSCs מח' אחר המשמש במוסדות אחרים פועל באופן דומה המחלקה השלישית BSC בשימוש באותה IRF, אבל יכול להיות מנגנונים שונים לתחבורה, גישה, או עגינה.

כדי להבין יותר כיצד פתוגנים גבוהה תוצאה להישאר זיהומיות ולהפיץ הולכתו אירוסול, AE בטוחניסויי robiological חייבים להתנהל בכיתה אלה III BSCs על פי נוהל עבודה ספציפית. חוקרים היו בזהירות הכשרה יסודית כדי להבטיח זרימת עבודה זו היא המיושמת בצורה בטוחה ועקבית. לפני הפרימטים אנושי (NHP) אתגר אירוסול, כמה אפיון תרסיס או ריצות תרסיס דמה מבוצעים כדי לבדוק את היציבות ואת הכדאיות של סוכן בעת ​​בצורה בתרסיס. תהליך אפיון אירוסול המחקה את האתגר אירוסול בפועל, ואת החוקר מעריך את המשתנים הקשורים מחקרים אירוסול.

חלק אחר של זרימת העבודה הוא להקליט מניפולציות פיסיות, ממשל או הרדמה או תרופות אחרות, או פרוצדורות שיגרתיות על תרשימים עבור כל NHP. תרשימי נושא אלה מנותחים באופן יסודי על מנת להבטיח עקביות וסטנדרטיזציה פרוצדורליים. נושאים מורדמים לפני ריסוס חשיפה. הרדמת דוגמא כוללת tiletamine / zolazepam, קטמין / acepromazine, ו ketamine. הרדמה נבחרת על בסיס מזעור דיכוי וקידום נשימה של מבוקר, נשימה יציבה. אספקת הרדמה נוספת נשמרת בחדרי הליך החיה והובלה על עגלת ההעברה עם NHP למעבדת ארון aerobiology ABSL-4.

בתוך המעבדה חליפה ABSL-4, NHPs לעבור plethysmography באמצעות אחת משתי שיטות (כלומר, plethysmography ראש-אאוט, plethysmography אינדוקטיביים הנשימה [RIP]) כדי לקבוע נפח גאות inspiratory ו קצב הנשימה משתנה 10-12. פרמטרים נגזרים אלה משמשים לחישוב מדויק של המנה בשאיפה המשוערת של הפתוגן מייד לפני או במהלך חשיפה אירוסול. ראש-אאוט plethysmography משתמש בתא גלילי ארוך כי הבתים 13 NHP. ירידת הלחץ שנוצרה כאשר בעל חיים הם בצילינדר הוא נתפס על ידי pneumotachograph, שנמסרו לבית המגבר, מעובד על ידי זרם חילופין / curren הישירהממיר t, והשתלב התוכנה לגזור את הפרמטרים ריאתי לעיל. RIP משתמשת בחיישנים עשויים חוטי נחושת אינדוקטיביים מפותלים המוטבעות גומיות סביב החזה של הנושא 11,12 בטן. אינדוקטיביים-קבלים יוצרים שדה מגנטי ב החיישן. נשימה משנה את השדה המגנטי, ושינויי המתח וכתוצאה מכך הם במימסר משדר ליד הגומייה למקלט במחשב באמצעות גלי רדיו בתדירות קצר גל אולטרה-גבוהה. תוכנה ייעודית קובעת קצב נשימה ואת נפח גאות מן עקירת חזה הכולל.

היקף הדקות (MV) שהושג באמצעות plethysmography משמש בחישוב המינון בשאיפה המוערך (D). ביצירה ולדגום בתרסיסים, ריכוז האירוסולים (AC) מחושב על ידי הכפלת ריכוז biosampler (BC) על ההיקף כולל של תקשורת (V) על ידי חלוקת תוצאה של הכפלת קצב הזרימה של biosampler (FL) על ידיזמן חשיפה (T). הנוסחה פשוטה מיוצג AC = BC x V ÷ FL x ט בתורו, לאתגר אירוסול בפועל NHPs, D מחושבת על ידי הכפלת AC ידי MV ואת משך החשיפה (זמן = T). הנוסחא הפשוטה מיוצגת D = AC x MV x ט

מטרת מאמר זה היא ויזואלית מדגימה את הליך אתגר אירוסול כולו באמצעות NHPs משתי נקודות מבט, צד מעבדת חליפת ABSL-4 וצד מעבדת ארון ABSL-4. למרות נהלים אלה יכול שיהיו כלליות בטבע במשך כמה שיטות שהוזכרו, הם ספציפית Core IRF-פרדריק Aerobiology ולייצג את שיטות בפועל נעשה שימוש במוסד הזה. מאמר זה מתמקד על נהלי הבטיחות הביולוגיים הדרושים לביצוע אתגר אירוסול בבטחה, לא אתגר אירוסול בפועל עצמו. בנהלים אלה, אנו משתמשים נושא דמה להראות נוהלי בטיחות ביולוגית, בשל הסיכון הכרוך בהרדמת NHP. עם זאת, התהליך של performing אתגר אירוסול כתוב באופן כללי כי ההליך הוא זהה, ללא קשר הפתוגן גבוהה תוצאה בשימוש. אנו שואפים לשפר את הידע והבנה של מדענים על קשיי עורכי מחקרים אירוסול של פתוגנים תוצאה גבוהים בתנאים אטימים מרביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה פועל לפי הנחיות טיפול בבעלי החיים הבאות. בעלי חיים שוכנו במתקן מוכר על ידי האגודה הערכה וההסמכה של הבינלאומי טיפול בבעלי חיים מעבדה. כל הפרוצדורות אושרו על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המחלקה למחקר קליני, טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש והיו ועמידה בכללי תקנות חוק צער בעלי חיים, מדיניות השירות לבריאות הציבור, ואת מדריך לטיפול ושימוש המלצות בחיות מעבדה.

1. Aerobiology: 4 רמה בטיחות ביולוגית בעלי חיים (ABSL-4) מעבדה Suit

  1. הכנת מעבדה
    1. השלם את נהלי כניסת מעבדת חליפת ABSL-4 (מתואר בפירוט 8).
    2. בדוק את הפונקציונליות של כל הציוד (למשל, ציוד plethysmography, מחשב נייד, פחי אשפה ביולוגיים מסוכנים, מכולות החדים ביולוגיות מסוכנות, מכשיר ניטור הנושאהים) המעורב בהליכי aerobiology המתרחשים בתוך מעבדת חליפת ABSL-4 על פי הפרוטוקול של היצרן.
    3. ודא עגלת ההעברה נקיה ביולוגי לפני הבדיקה הפונקציונלית של הנמל מעבר המהיר (RTP), המקשר את עגלת תחבורת דרך הקיר אל Class III BSC).
    4. טפל לדלל הפתוגן רק בתוך BSCs מוסמך. הכן את הפתוגן בניסוח המתאים בתוך BSC Class II המכיל חומרי חיטוי מתאימים. הובלת הפתוגן במיכל משני-אוויר חזק שכותרתו עם סמל Biohazard על קרח רטוב בעגלת התחבורה. להעביר את הפתוגן דרך RTP לתוך Class III BSC במעבדה ארון ABSL-4, איור 1.

2. Plethysmography: 4 רמה בטיחות ביולוגית בעלי חיים (ABSL-4) מעבדה Suit

  1. הגדרת כיול Plethysmography
    1. לקבוע איזו שיטה של ​​רכישת plethysmography(Plethysmography-אאוט הראש או plethysmography השראות הנשימה [RIP]) ישמש ולהתחבר מרכיבים למכשור יחד.
    2. כייל את plethysmograph לפני הניסוי באמצעות פרוטוקול של היצרן.
  2. Plethysmography רכישה
    1. בעת טיפול NHPs, דון זוג חיצוני של כפפות לטכס או ניטריל מעל העליון של כפפות המשפט כדי למנוע זיהום צולב ולקדם שיטות בטוחות. בסיום טיפול NHPs, הסיר את הכפפות עודפות אלו וזורקים לפח האשפה הביולוגי המסוכן בתוך החדר.
    2. אם באמצעות plethysmography-אאוט הראש, לצרף גומי חדש / סכר שיניים אל מול הגליל. חותכים חור קטן בסכר עבור ראש NHP כדי להתאים דרך החלק העליון של הגליל. כאשר יושבים, הסכר יוצר חותם סביב צווארו של NHP.
    3. אם אתה משתמש RIP, לבדוק כי להקות RIP מצוידות כראוי סביב החזה והבטן של NHP וההקשרים האלקטרוניים נחטפים tighבעדינות.
    4. שלח את כל הנתונים רכשו מהליך plethysmography החוקרים במעבדת ארון ABSL-4. לייצא את הנתונים לגבי נפח ונפח דקות הגאים עבור כל חיה באמצעות תכנית תואמת לשימוש במהלך התהליך בתרסיס.

מעבדת Suit 4 רמת בטיחות הביולוגית בעלי חיים: 3. תחבורת טיפול לא אנושיות הפרימאטים

  1. טיפול NHP
    1. לנטר ולהקליט כל מניפולציות פיסיות, ממשלים, או פרוצדורות שיגרתיות על תרשימים עבור כל NHP.
    2. כאשר אתגר אירוסול הושלם, למקם את NHP בתוך מכל התחבורה ולחזור NHP לכלוב בבית ממוקם בחדר ההחזקה של בעלי החיים.
    3. בעת טיפול חי, בצע את שלטון המנדט הדורש 2 אנשי צוות כדי להיות נוכח.
  2. תחבורת NHP
    1. קבע את סוג ההרדמה, משך ההרדמה (מכסה תחבורה, plethysmography acquisitיון, ואתגר תרסיס) ומינון מקביל הרדמה לפני מתן. לגמרי להרדים את NHP מבוסס על התהליך שנבחר על ידי צוות הרפואה ההשוואתית. אם נדרשת הרדמה נוספת, להבטיח כל המחטים, החדים, המזרקים, והכובעים מבוטלים במכל חד ממוקם באחד חדרי הליך חיה. אל וסקור מחטים לאחר השימוש.
    2. תחבורה מורדמת NHPs במיכלים ברור כי מובטחות תפס מכסה קופסא התחבורה.
    3. מכולות מטען טען על עגלה ניידת לאפשר לחוקרים מתאימים לחלוטין לעבור באמצעות קווי אוויר לנשימה בחופשיות דרך לחץ האוויר עמיד (אפר) דלתות, איור 1.
    4. כפי אין אוויר לנשימה נוסף עבור NHP מסופק מכל התחבורה, לצמצם את זמן הובלה.

4. Aerobiology: ABSL-4 מעבדה הקבינט

  1. הגדרת Class III BSC
    1. במקביל להכנת חיה המבוצעת על ידי צוות לרפואה השוואתית, להכין את Class III BSC. ראייה לוודא שלחץ שלילי Class III BSC נשמר בטווח שצוין (125 Pa או -0.5 ב מד מים (WG) מינימום; 250 Pa או -1.0 ב wg מומלץ). בדוק את Class III BSC עבור כל הדלפות פוטנציאל או סדקים (ראה איור 1).
    2. פיזית בדוק חזותית את Class III כפפות גומי סינתטי BSC ו O- טבעות המצורפת Class III BSC למצוא נקודות חולשה, קורע, קורע, או ריקבון יבש. החזר את המחלקה הפגומה III כפפות גומי סינטטיים ו / או טבעות אטימות מייד לפני שימוש. בשלב זה, המחלקה השלישית BSC אינו מזוהם.
    3. במקרה של דליפה בעוד Class III BSC מזוהם, לזהות את המיקום של הנהלת מתקן ההפרה ודרוכה ואנשי בטיחות ביולוגיים. אם Class III BSC כפפה משולבת נקרעה או פר, להחליף את הכפפה הפגומה מייד על ידי ביצוע טכניקת ההכשרה המתאימה והבינומח' סופית III נוהל עבודה רגילה BSC.
    4. כדי לשנות כפפה משולבת המכילה דמעה או פרה קטנה במהלך חשיפה, ראשון לרסס את מדמיע או פר באופן מוגזם עם הריכוז המתאים של אמוניום רבעונים כפול (n-אלקיל כלוריד אמוניום דימתיל בנזיל, n-אלקיל כלוריד אמוניום בנזיל אתיל דימתיל) חיטוי . אל תעשו תנועות מוגזמות בזמן הזה ליצור עליית זרימת האוויר.
    5. בזהירות, להסיר טבעות האטם החיצוניות (2 מהם) עוזבות את הכפפה המשולבת הפגומה עדיין מחוברת Class III BSC. מעט להזיז את שרוול כפפה משולבת פגום מהנמל תוך הקפדה על חותם ההכפפה המשולבת נותר בשלמותה. אם את החותם נפגע, אזעקה תישמע המציינת את ההליך לא בוצע כהלכה. שרוול הכפפה המשולב צריך להישאר מחובר ליציאה לאחר האטם השני יוסר Class III BSC.
    6. מניח כפפת גומי סינטתית BSC חדשה Class III מעל של i הכפפה הישנהn באותו כיוון. מניח כפפה חדשה זו באופן מלא מעל הנמל דומה ליציאות כפפת Class III BSC האחרות.
    7. החלף את האטם הקרוב ביותר Class III BSC מעל הכפפה המשולבת החדשה. באמצעות יציאת הכפפה משולבת סמוכים, למשוך את כפפת הגומי הסינטטי BSC III המחלקה הפגומה בזהירות בתוך BSC Class III. כפפת הגומי סינטטי החדשה Class III תשמש המכשול לשמור בלימה. לאחר כפפת גומי סינתטי פגום אחרים Class III מוסר (משך פנימה), להחליף את האטם החיצוני אחרים ולהמשיך לעבוד.
    8. להקליט את כל הפרטים הנוגעים כפפה מדמיעה / הפרה ביומן BSC הספציפי Class III. אם הכפפה המשולבת הפגומה מוסר או פרצת הבלימה מתרחשת, נמל הכפפה / משולב הנפגעת עדיין שומר על זרימת אוויר פנימה של 0.47 מ '3 / sec. זרימת האוויר פנימה זהו זרימת האוויר באותו בשימוש עם Class II BSC, ובכך שמירה על עקביות בין Class II ו Class III BSCs.
    9. בדוק טנק דאנק ולוודא כי הטנק דאנק מתמלא חיטוי לרמה ניכרת בתוך הטנק דאנק, איור 1. בדוק את ריכוז של חומר חיטוי במיכל דאנק הוא מינימום של 3,500 מיקרו-שניות באמצעות מד מוליכות. מוליכות זה שווה ריכוז 5% של חומר חיטוי.
    10. ודא חיטוי Class III BSC הוא פונקציונלי מבצעי כך כל הפסולת והציוד המזוהמים ניתן autoclaved, איור 1. חיטוי ציוד יחיד שידוע לקיים בתלאות של תהליך העיקור.
    11. בדוק את הפונקציונליות של ציוד aerobiology אחר (למשל, רכיבי AAMP, מחשב נייד) וקווי אוויר ואקום מעורבים בניסוי, איור 2.
    12. להציב שלטים על BSC Class III המציינים את מצב הזיהום הנוכחי של היחידה.
  2. התקנת הרכבת המערכת של ראש-רק חשיפה NHP קאמרית
    1. להרכיב צ'ה חשיפה חזיתית רק NHP 16-Lmber ידי החדרת משלוח נירוסטה קווי פליטה, איור 2. הגדר את קאמרית דחיפה / משיכה, תצורה דינמית על ידי חיבור קווי אוויר, אבק, ואת הלחץ המתאים AAMP. חבר את AAMP למקור חשמל בתוך BSC Class III ומחשב נייד דרך יציאה סגורה הרמטית ממוקמת על גבי Class III BSC (איור 1).
    2. בדוק את הראש בלבד NHP התאסף חשיפה הקאמרית עבור כל הדלפות או סדקים, ולהבטיח כי הקאמרי מורכב כראוי.
    3. צרף מחולל אירוסול מכשיר קריאת גודל חלקיקים אווירודינמי לתא החשיפה חזיתית רק NHP.
    4. פתח את מקור אוויר ואקום AAMP.
    5. הפעל את תוכנת פרוטוקול אירוסול במחשב הנייד. הזן את הראש בלבד NHP המתאים קאמרי חשיפה, מחולל אירוסול זרימת biosampler השיעור, ומידע מנהלי לתוך תפריטי תוכנה.
    6. חשב את האתגר אירוסולזמן מהנתונים רכשו במהלך הליך plethysmography, צעד 2.2.4. אם באמצעות plethysmography-אאוט הראש, לחשב את המינון לפני החשיפה אירוסול. אם אתה משתמש RIP, לחשב את המינון בו זמנית במהלך החשיפה אירוסול.
    7. מלאו את מחולל אירוסול עם הפתוגן.
    8. באמצעות תוכנת אירוסול, להפוך את מחולל אירוסול "על" ולרסס את החלק הפנימי של חדר החשיפה בלבד ראש NHP עם חומר האתגר במשך 10 דקות.
    9. כבה את מחולל אירוסול, רוקן את חומר האתגר, וזורק את חומר האתגר לתוך שקית אשפה ביולוגית מסוכנת ממוקם הפנימי של BSC Class III.
  3. חשיפה NHP ראש בלבד
    1. צרף biosampler לתא החשיפה חזיתית רק NHP, למלא את biosampler עם תקשורת אוספת, ולצרף את קו הוואקום המתאים biosampler.
    2. בדוק את עומק ההרדמה של NHP. אם עומק ההרדמה נחשב נאות (
    3. מניח את NHP במצב שכיבה לרמפת חשיפת NHP.
    4. בעדינות להעביר את ראשו של NHP דרך סכר הגומי / שיניים המצורפת לפורטל ראש לשכת החשיפה חזיתית רק NHP. הגומי / סכר השיניים מבטיח חותם נוצר סביב הצוואר של NHP במהלך החשיפה אירוסול.
    5. ודא את הסימנים החיוניים של NHP יציבים מבחינה ויזואלית והן עם צג נושא נייד.
    6. הזן את שעת אתגר אירוסול מחושבת משלב 4.2.6. ומזהה ציוד דרוש לכלtinent לכל אירוסול לרוץ לתוך התוכנה אירוסול ולהתחיל את האתגר בתרסיס.
    7. אמת נתוני גודל חלקיקים במהלך כל סיבוב אירוסול עם מנתח גודל חלקיקי תרסיס כדי להבטיח את התפלגות גודל חלקיקים הרצויה מושגת. בצע אימות זה ברציפות או לסירוגין במהלך החשיפה.
    8. לאחר אתגר אירוסול יושלם, להסיר את NHP מאולם החשיפה בלבד הראש ולנגב את פן / ראשו של NHP את עם חומר החיטוי המתאים להפחתת זיהום פוטנציאל צוות המעבדה.
    9. טהר את תא התרסיס או אוויר לשטוף את חלקיקי הנותרים מפגרים במשך 5 דקות על ידי העברת אוויר ואקום דרך התא. הליך זה יהיה "לנקות" ולהסיר חלקיקים שיורית מאולם החשיפה אירוסול לחשיפות אירוסול עוקבות NHP.
    10. להעביר את NHP בחזרה דרך RTP החוקרים ממוקמים על בתוך מעבדת חליפת aerobiology ABSL-4.
    11. מחק את כל החדים used בתוך III BSC המחלקה במכל חדים מיועד שנשאר BSC. כאשר במכל החד הוא ¾ מלא, להציב לתוך שקית אשפת Biohazard.
    12. רוקן את מחולל אירוסול וכל שנותר חומר אתגר לתוך שקית האשפה הביולוגית המסוכנת המכילה אשפה, ציוד מתכלה, ו / או ¾-מלא במכל חד אם זה אפשרי.
    13. רוקן את התקשורת האוספת מן biosampler התרסיס לתוך הצינורות האוספים שכותרתו כראוי ומניח על קרח רטוב.
    14. חזור על שלבים 4.3.1 עד 4.3.13 עד שכל הנבדקים מבחן מתוכנן כבר אתגר.
    15. לעבור את כל דגימות אירוסול biosampler דרך RTP החוקרים עבור titrations כימות והאחורי של מנה בתרסיס.
    16. מניח את האשפה וציוד מן אתגר התרסיס לתוך חיטוי התמסורת המצורף BSC Class III ובחר מחזור עיקור ישים (איור 3).
    17. לפרק את הראש בלבד NHP גhamber ו לטהר את התא החזיתי בלבד BSC Class III עם מחזור גז paraformaldehyde תוקף עם אינדיקטורים ביולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קבינט הבטיחות הביולוגי Class III (BSC) הוא ארון נירוסטה הרמטית המכיל סביבת ABSL-4 תחת לחץ שלילי בתוך מעבדת ארון ABSL-4 (איור 1). חומרים יכולים להיות מוחדרים BSC ידי צוות עובדים במעבדת ארון ABSL-4 באמצעות במכל נירוסטה רכובה תחת ארון (המכונה כמו "טנק דאנק" ב ABSL-4 או BSL-4 הגדרות) המכיל 5 אמוניום הרביעון כפול% (אמוניום כלוריד בנזיל דימתיל n-אלקיל, n-אלקיל כלוריד אמוניום בנזיל אתיל דימתיל) פתרון חיטוי. מכיוון BSC מובנה בתוך הקיר המפריד בין מעבדת ארון ממעבדת חליפת ABSL-4, חומרים, בעלי חיים, ופתוגנים ויראלי יכולים גם להעביר לתוך BSC מצד מעבדת חליפת ABSL-4 באמצעות עגלת הובלת העברה מהירה פורט (RTP). התכנים בתוך BSC ניתן להשפיע מבחוץ על ידי חוקרים לובשים סוגים שונים של כפפות גומי סינתטי, פוליאתילן ניאופרן / chlorosulphonated במיוחד. תוכן, כולל מדגמים זיהומיות, יוסר מן BSC לאחר עיקור באמצעות חיטוי או חיטוי פעמי דלת באמצעות טנק דאנק. על ידי סימון / שאימתו כי BSC Class III וציוד bioaerosol (איור 2) מתפקד כראוי, אנחנו שומרים על סביבה בטוחה ותפעולי כראוי. תחזוקה ושימוש הנכון של BSC Class III הוא נפרד מיגון אישי עבור החוקר. בעקבות חשיפה, אשפה וציוד תרסיס מן האתגר אירוסול לעבור עיקור ממוקמים לתוך חיטוי התמסורת המצורף Class III BSC, איור 3. באמצעות הקפדה על נהלים אלה ושיטות עבודה, אין זיהומים רכשו מעבדה הוקלטו במהלך מחקר bioaerosol בבית IRF-פרידריך.

2fig1.jpg "/>
איור 1. סכמטי מצגת של תוכנית ההתקנה בטיחות ביולוגית הקבינט Class III בבית מצגת IRF-פרדריק. הקבינט במצב סטטי (לשכפל מ 5). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תרסיס ניהול פלטפורמה. מעובד מתוך 5. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. שליבת פעמי דלת חיטוי נספחות Class III BSC. חוקר הוא בחירהמחזור חיטוי מתוכנת מראש על מנת להבטיח את התוכן בתוך תא החיטוי הוא noninfectious כשהדלת החיצונית נפתחה לבסוף. הדלת ממוקמת הקרוב ביותר ל החוקר לא ניתן לפתוח עד מחזור עיקור מלא הושלם. אינדיקטורים ביולוגיים בתוך חדר החיטוי ינותחו כדי לקבוע איון סוכן לאחר תהליך העיקור (לשכפל מ 5). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נתאר את הליכי aerobiology בשימוש בבית IRF-פרדריק לעבודה עם פתוגנים מסוכנים מאוד (סיכונים קבוצה 4). אחת המטרות של לדמיין את הנהלים bioaerosol היא להדגיש את הבטיחות של הצוות בעת שימוש Class III BSC במהלך ניסויים עם פתוגנים כאלה כדי למנוע זיהומים רכשה מעבדה. III המחלקה BSCs לשמור על זרימת אוויר כיוונית פנימה כי מהכלה לתוך מסנני HEPA שוב כדי לוודא פתוגנים נמצאים בתוך המעבדה (איור 1).

ככל Class III BSC הוא המכשול העיקרי במניעת חשיפה הפתוגן פוטנציאל במהלך לימודי bioaerosol, חוקרים נדרשים לבדוק את התקינות של Class III BSC ומצורפים כפפות משולבות דליפות לפני ואחרי כל ניסוי בתרסיס. למרות כל מאמץ נלקח לנטרל את סיכון לחוקרים מעבדה, הפרת BSC Class III משולב כפפת גומי סינתטי עלולה להתרחש. צוות חייב להיות מסופק עםהן דידקטי הדרכה מעשית על נהלי חירום BSC הראויים Class III. נהלים אלו כוללים פינוי מהמעבדה ארון ABSL-4, אבטחת פרצה הבלימה אל Class III BSC, ו עוטה של ​​ציוד מגן אישי בעת הצורך. השתמשנו כפפות אחרות של משתנה עובי בעבר, כי הם תלויים על המוטוריקה העדינה הנדרשת עבור ההליך. לא משנה את העובי, כל הכפפות שנבחרו הם לא פחות מגן בעת ​​ביצוע הליכים אלה. הכשרה מתקדמת, הקפדה על פרוטוקולים בטיחות, בקרות הנדסה לעזור על מנת להבטיח בטיחות העובד בעת שימוש Class III BSCs בבית IRF-פרידריך. התהליכים הנ"ל כפופים לשינויים עקב מתודולוגיות חדשות או הערכה מחדש בטיחות מבוססת על שיפור זרימת העבודה.

בעוד נהלי aerobiological המוצג כאן בדרך כלל פעלו על פי המלצות BMBL 7, נהלים אלה הם ספציפיים IRF-פרידריך. Eמתקן ACH ABSL-4 / BSL-4 יש מפרטי עיצוב בנייה שונים המשפיעים על שיטות המדויקות של פעולת מעבדה. הליכים חלופיים וטכניקות לשימוש במעבדות BSC Class III תלויה, בין השאר על תכנון והפעלה של מעבדות אלה. בנוסף, תקנות ממשלתיות שונות במדינות שונות עשויות להיות גם השפעה על נהלי מחקר בתרסיס. אף על פי כן, הבנה כללית של נהלי אירוסול ABSL-4 ובניין ניטור מערכות התומכות הבטיחות חוקרת במעבדה תעזור למנהלי בריאות, אשר שוקלים את העיצוב של מבנים דומים, ומשתפי פעולה מחוץ מעורבים במחקרים של פתוגנים גבוהה מכך.

בעת תכנון פרוטוקולי bioaerosol עם משתפי פעולה בחוץ, מספיק זמן צריך להיות מוקצב לביצוע פעולות bioaerosol בסיסיות אפילו. ציפיות של מסגרות זמן ומספק תוצאות צריכות להיות מותאמות על ידי קבלת הקשיים כרוכים בעבודהב ABSL-4 Class III מעבדות BSC. נחת כללית היא שכל ניסוי bioaerosol הופיע ABSL-2 (למשל., 2 שעות) ידרשו פעמיים את משך הזמן לבצע ABSL-4 (למשל, 4 שעות).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro-Chem Plus National Chemical Laboratories 255
Ethanol  Fisher  BP2818500
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 441244
Class III BSC Germfree DGB-10
Integrated BSC gloves Piercan 10UY2032-9
Aerosol Management Platform (AeroMP) Biaera Technologies NA
Head-out plethysmography Buxco/Data Sciences International NA
Respriatory inductive plethysmography Data Sciences International NA
Centered flow tangential aerosol generator (CenTAG) CH Technologies NA
Collison nebulizer BGI Inc.  CN25
Autoclave Getinge GEB 2404 AMB-2
Sperian positive-pressure suit Honeywell Safety Products BSL 4-2
Outer suit gloves (latex, Ansell Canners and Handlers) Fisher 19-019-601
Outer suit gloves (nitrile/rubber, MAPA) Fisher 2MYU1
Scrubs Cintas 60975/60976
Socks Cintas 944
Duct tape Pack-N-Tape 51131069695
Towels Cintas 2720
O-rings O-ring warehouse AS568-343
Overshoes Amazon B0034KZE22
Zip lube Amazon B000GKBEJA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alibek, K., Handelman, S. The chilling true story of the largest covert biological weapons program in the world-told from inside by the man who ran it. Random House. New York, NY. (1999).
  2. Roy, C. J., Pitt, L. M. Infectious disease aerobiology: aerosol challenge methods. Biodefense: research methodology and animal models. Swearingen, J. R. Taylor & Francis. Boca Raton, FL. 61-76 (2006).
  3. National Institute of Allergy and Infectious Diseases. NIAID Category A, B, and C Priority Pathogens. National Institutes of Health. Bethesda, MD, USA. Available from: http://www.niaid.nih.gov/topics/biodefenserelated/biodefense/pages/cata.aspx (2014).
  4. National Center for Environmental Health. Bioterrorism agents/diseases by category. Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
  5. Lackemeyer, M. G., et al. ABSL-4 aerobiology biosafety and technology at the NIH/NIAID integrated research facility at Fort Detrick. Viruses. 6, (1), 137-150 (2014).
  6. Bohannon, J. K., et al. Generation and characterization of large-particle aerosols using a center flow tangential aerosol generator with a non-human-primate, head-only aerosol chamber. Inhal Toxicol. (2015).
  7. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Chosewood, L. C., Wilson, D. E., eds, 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C.. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
  8. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL4 Laboratory: 1. Biosafety level 4 suit laboratory suite entry and exit procedures. J Vis Exp. (2015).
  9. Mazur, S., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL4 Laboratory: 2. General Practices. J Vis Exp. (2015).
  10. Mortola, J. P., Frappell, P. B. On the barometric method for measurements of ventilation, and its use in small animals. Can J Physiol Pharmacol. 76, (10-11), 937-944 (1998).
  11. Zhang, Z., et al. Development of a respiratory inductive plethysmography module supporting multiple sensors for wearable systems. Sensors (Basel). 12, (10), 13167-13184 (2012).
  12. Ingram-Ross, J. L., et al. Cardiorespiratory safety evaluation in non-human primates. J Pharmacol Toxicol Meth. 66, (2), 114-124 (2012).
  13. Besch, T. K., Ruble, D. L., Gibbs, P. H., Pitt, M. L. Steady-state minute volume determination by body-only plethysmography in juvenile rhesus monkeys. Lab Anim Sci. 46, (5), 539-544 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics