मिश्रित 3 डी संस्कृति से चयनात्मक सेल उन्मूलन पास इन्फ्रारेड Photoimmunotherapy तकनीक का प्रयोग

Bioengineering

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Sato, K., Choyke, P. L., Hisataka, K. Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique. J. Vis. Exp. (109), e53633, doi:10.3791/53633 (2016).

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Abstract

Introduction

अन्य कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए बिना विशिष्ट कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए बेहद मुश्किल है, विशेष रूप से स्थापित ऊतकों में, और ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में एक सेल उन्मूलन विधि के लिए एक तत्काल आवश्यकता है। 3 - आजकल पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते), स्टेम कोशिकाओं (पीएससी), या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) का उपयोग ऊतक संस्कृतियों सामग्री का वादा कर रहे हैं 1।

हालांकि इस ऊतक उत्थान का वादा किया है, अवांछित कोशिकाओं के साथ संदूषण एक प्रमुख चिंता का विषय है। इसके अलावा, वहाँ प्रत्यारोपण 4,5 के बाद tumorigenicity के एक सुरक्षा चिंता का विषय है। हालांकि कई अध्ययनों से इन मुद्दों पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित किया है पुनर्योजी दवा 6 में, विशिष्ट कोशिकाओं को खत्म करने के लिए - 8, कोई व्यावहारिक तरीका विकसित किया गया है।

निकट अवरक्त photoimmunotherapy (NIR गड्ढे) एक उपचार एक एंटीबॉडी-photoabsorber conjugat पर आधारित हैई (एपीसी)। एक APC एक सेल विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) और एक photoabsorber, IR700 के होते हैं। IR700 एक हाइड्रोफिलिक सिलिका phthalocyanine व्युत्पन्न है और खुद को 9 से phototoxicity प्रेरित नहीं करता। IR700 covalently लाइसिन अणुओं के पक्ष श्रृंखला पर एमाइड अवशेषों के माध्यम से एंटीबॉडी संयुग्मित है। एपीसी कोशिका झिल्ली पर लक्ष्य अणुओं बांधता है और उसके बाद 690 एनएम पर NIR प्रकाश के संपर्क के बाद लगभग तत्काल सेल नेक्रोसिस लाती है। 14 - NIR प्रकाश, सेलुलर झिल्ली ruptures कोशिका मृत्यु 9 के लिए अग्रणी करने के लिए जोखिम के दौरान। 21 - NIR गड्ढे कई एंटीबॉडी या एंटीबॉडी टुकड़े, विरोधी EGFR, विरोधी HER2, विरोधी PSMA, विरोधी CD25, विरोधी मेसोथेलाइन, विरोधी GPC3, और विरोधी सीईए 15 सहित के साथ प्रभावी साबित हो गया है। इसलिए, NIR गड्ढे लक्ष्य अणुओं की एक विस्तृत विविधता के खिलाफ इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, NIR-पिट एक अच्छी तरह से नियंत्रित इलाज है कि NIR-ligh सीमित द्वारा विशिष्ट क्षेत्रों के चुनिंदा उपचार के लिए अनुमति देता हैटी विकिरण 18,22।

यहाँ, हम मिश्रित 3 डी संस्कृतियों से NIR गड्ढे का उपयोग कर विशेष सेल उन्मूलन का एक तरीका मौजूद है।

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Protocol

नोट: निम्न प्रोटोकॉल NIR गड्ढे का उपयोग कर विशिष्ट कोशिकाओं को खत्म करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन है। नियंत्रण और NIR गड्ढे और सेल व्यवहार्यता के बारे में अन्य विवरण कहीं और 18 पाया जा सकता है।

1. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को IR700 के विकार (एमएबी)

  1. 2-5 मिग्रा / 0.1 एम ना 2 HPO 4 (पीएच 8.6) समाधान में मिलीलीटर पर ब्याज की एमएबी तैयार करें।
  2. 0.1 एम ना 2 4 HPO एक microcentrifuge ट्यूब में समाधान (पीएच 8.6) में 10 मिमी IR700 के 30.8 nmol साथ एमएबी की 6.8 nmol मिलाएं और 1 घंटा, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर के लिए आरटी पर सेते हैं।
  3. 15 मिलीलीटर पीबीएस के साथ पीडी-10 कॉलम (सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) धोने, दो बार। 1.2 कदम से नमूना लोड।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीबीएस क्षालन द्वारा पीडी-10 कॉलम के माध्यम से मिश्रण शुद्ध।
    नोट: यहाँ, क्षालन IR700 के बैंड रंग के साथ था। एक 300 μl नमूना के लिए, पीबीएस क्षालन अंश 4.4 मिलीलीटर मिलीलीटर आम तौर पर 2.5 के बीच है।
  5. निश्चित करोएक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 9 के साथ 595 एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा Coomassie धुंधला के साथ प्रोटीन एकाग्रता। 689 एनएम पर अवशोषण के साथ IR700 की एकाग्रता का निर्धारण प्रत्येक अणु एमएबी 9 संयुग्मित fluorophore अणुओं की संख्या की पुष्टि करें।
    नोट: यह एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 1 एमएबी में IR700 अणुओं की एक इष्टतम विकार संख्या निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। आम तौर पर, 1 एमएबी अणु में 3 आसपास IR700 अणुओं दोनों इन विट्रो और इन विवो के लिए काम में इष्टतम है। एचपीएलसी और एसडीएस पृष्ठ के तरीकों की पुष्टि करने के लिए कि क्या एमएबी और IR700 या बाध्य नहीं कर रहे हैं इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. मिश्रित 3 डी सेल संस्कृति की तैयारी (मिश्रित उपगोल)

  1. बूंद प्लेटों फांसी की थाली जलाशय खंड में बाँझ पानी (लगभग 1 मिलीलीटर) को लागू करें।
  2. A431 ल्यूक-GFP कोशिकाओं 3T3 आरएफपी कोशिकाओं और - हित के प्रकार की कोशिकाओं के विभिन्न अनुपात तैयार करें -कुल 5000 कोशिकाओं, संस्कृति मीडिया के 50 μl में निलंबित कर दिया है जिसमें प्रत्येक नमूने के साथ।
    नोट: संस्कृति मीडिया में ब्याज की कोशिकाओं प्रकार के अनुपातों सेल प्रकार के आधार पर 100, आदि: 100, 10: 100, 25: 100, 50 1 तैयार करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर एक humidified इनक्यूबेटर में 96 अच्छी तरह से फांसी बूंद प्लेट में 5-7 दिनों के लिए मिश्रण को सेते हैं। संस्कृति मीडिया बदलें हर 2 दिन। नोट: 3 डी ठीक अंडाकार आकृति बनाने के लिए, धीरे थाली संभाल, कोशिकाओं से युक्त बूंदों के रूप में 3 डी आकार के गठन से पहले आसानी से गिर जाते हैं।
  4. 40x बढ़ाई - 10X पर एक औंधा brightfield माइक्रोस्कोप का उपयोग आकृति विज्ञान और spheroids के आकार को ध्यान से देखें। नोट: हालांकि यह सेल प्रकार और फांसी-बूंद के आकार पर निर्भर करता है, यह सुनिश्चित करें कि अंडाकार आकृति का व्यास 96 में ऊष्मायन के 7 दिनों में अच्छी तरह से ड्रॉप थाली फांसी के बाद चारों ओर 400-600 मीटर है।

3. मिश्रित 3 डी सेल संस्कृति के लिए इन विट्रो NIR-गड्ढे में

  1. हा की मीडिया बदलें10 माइक्रोग्राम / एमएल एंटीबॉडी photoabsorber साधना (एपीसी) युक्त मीडिया के लिए ड्रॉप प्लेटों nging, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर एक humidified इनक्यूबेटर में 6 घंटे के लिए सेते हैं।
  2. बाद 6 घंटा ऊष्मायन, ताजा संस्कृति मीडिया (फिनोल लाल मुक्त) के साथ दो बार अंडाकार आकृति धो लें। धीरे एक बाँझ 200 μl विंदुक टिप का उपयोग 100 μl ताजा फिनोल लाल मुक्त संस्कृति मीडिया के साथ एक गिलास तली 50 मिमी डिश के लिए अंडाकार आकृति हस्तांतरण टिप के साथ काट दिया। प्रत्येक थाली में एक अंडाकार आकृति रखें।
  3. एक औंधा brightfield माइक्रोस्कोप के साथ अंडाकार आकृति को ध्यान से देखें आकृति विज्ञान के परिवर्तन का पता लगाने के लिए। ऑप्टिकल संवाददाताओं (जैसे, GFP और आरएफपी) का निरीक्षण करने के बाद फिल्टर सेटिंग्स के साथ प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करें: GFP - 469 एनएम उत्तेजना फिल्टर, और 525 एनएम उत्सर्जन फिल्टर; आरएफपी - 559 एनएम उत्तेजना फिल्टर, और 630 एनएम उत्सर्जन फिल्टर।
  4. विकिरण के लिए गिलास तली पकवान ऊपर प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) रखें।
    नोट: Spheroids NIR से अवगत कराया जा सकता हैया तो माइक्रोस्कोप पर या लामिना हुड में प्रकाश।
    1. एक ऑप्टिकल बिजली मीटर 9 के साथ NIR-प्रकाश की शक्ति घनत्व को मापने। इस माप के अनुसार, प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) जो 2 जम्मू / 2 सेमी पर 670 710 एनएम के तरंग दैर्ध्य में प्रकाश का उत्सर्जन के माध्यम से चमकाना NIR-प्रकाश।
      नोट: एलईडी प्रकाश लगभग 5 इंच की अधिकतम गहराई घुसना कर सकते हैं। NIR गड्ढे की साइटोटोक्सिक प्रभाव ऊर्जा घनत्व और जोखिम 23 वर्ष की अवधि की परवाह किए बिना ही दिया ऊर्जा पर निर्भर है।
  5. विकिरण के बाद, ताजा संस्कृति मीडिया के 50 μl के साथ एक नया फांसी ड्रॉप थाली में अंडाकार आकृति हस्तांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर एक humidified इनक्यूबेटर में 1 दिन के लिए सेते हैं।
  6. धीरे ताजा संस्कृति मीडिया (फिनोल लाल मुक्त) टिप काट के साथ एक बाँझ 200 μl विंदुक टिप का उपयोग कर के 100 μl के साथ एक गिलास तली डिश के लिए अंडाकार आकृति हस्तांतरण। फाई का उपयोग करने NIR गड्ढे के बाद एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी 1 दिन के साथ अंडाकार आकृति को ध्यान से देखेंlter सेटिंग्स कदम 3.3 में वर्णित है।
    1. , या एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 2 बी) का उपयोग कर 14,18,22 cytoplasmic GFP प्रतिदीप्ति के नुकसान से 2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में मीडिया को propidium आयोडाइड जोड़कर मृत कोशिकाओं का पता लगाने।
  7. दोहराएँ 3.1-3.6 कदम अगर लक्ष्य कोशिकाओं को पूरी तरह से समाप्त नहीं कर रहे हैं।

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Representative Results

ऑप्टिकली NIR गड्ढे, A431 सेल लाइन है, जो EGFR overexpresses के प्रभाव पर नजर रखने के लिए, आनुवंशिक रूप से भी GFP और luciferase (A431 ल्यूक GFP) व्यक्त करने के लिए संशोधित किया गया था। NIR गड्ढे के एक गैर लक्ष्य के रूप में, / Balb 3T3 सेल लाइन ऑप्टिकली आरएफपी (3T3 आरएफपी) को व्यक्त करने के लिए संशोधित किया गया था। एपीसी, panitumumab-IR700 (पैन-IR700), संश्लेषित किया गया था। मिश्रित spheroids है, जो कोशिकाओं (A431 ल्यूक GFP और 3T3 आरएफपी) के विभिन्न अनुपातों से बना रहे थे इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1) के अनुसार गढ़े गए थे। दोहराया NIR गड्ढे अखिल IR700 (चित्रा 2A में आहार देखें) के ऊष्मायन के साथ प्रदर्शन किया गया था। इस 3 डी मिश्रित संस्कृति से लक्ष्य सेल उन्मूलन हासिल की और प्रतिदीप्ति और luciferase गतिविधियों (चित्रा 2 बी, सी) के साथ नजर रखी थी। दूसरी ओर, गैर लक्ष्य कोशिकाओं को विकसित करने के लिए जारी रखा।

आकृति 1
16 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
3 डी सेल spheroids में चित्रा 2. लक्ष्य सेल उन्मूलन (A431 ल्यूक GFP और 3T3 आरएफपी कोशिकाओं के मिश्रित spheroids)। (ए) NIR गड्ढे (2 जम्मू / 2 सेमी) आहार दिखाया गया है। (बी) दोहराया NIR गड्ढे पूरी तरह से गैर लक्ष्य कोशिकाओं (3T3 आरएफपी) को कोई नुकसान के साथ लक्ष्य कोशिकाओं (A431 ल्यूक GFP) का सफाया कर एक मिश्रित 3 डी अंडाकार आकृति में। बार = 200 माइक्रोन। (सी) luciferase गतिविधियों की मात्रा (RLU अनुपात)लक्ष्य कोशिकाओं (एन = प्रत्येक समूह में 10 spheroids) के पूर्ण उन्मूलन का प्रदर्शन किया। यह आंकड़ा 18 से संशोधित किया गया है। डेटा के रूप में व्यक्त कर रहे हैं इसका मतलब ± SEM यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम NIR गड्ढे का उपयोग करके गैर लक्ष्य कोशिकाओं को नुकसान के बिना एक मिश्रित 3 डी सेल संस्कृति से विशेष सेल समाप्त करने की विधि का प्रदर्शन। अब तक, वहाँ सेल उन्मूलन का कोई व्यावहारिक तरीका एक बार ऊतक की स्थापना की है या प्रत्यारोपण के बाद है। इस प्रकार, NIR-पिट एक आशाजनक तरीका यह पूरा करने के लिए है। इस तकनीक को भी, विवो 18,22 में उपयोग किया जा सकता है क्योंकि APCs एमएबी के रूप में ही समान फार्माकोकाइनेटिक्स दिखा। लक्ष्य सेल प्रकार विभिन्न एपीसी के साथ अनुकूलित किया जा सकता है। 21 - विभिन्न एंटीबॉडी या एंटीबॉडी टुकड़े, विरोधी EGFR, विरोधी PSMA, विरोधी मेसोथेलाइन, और विरोधी सीईए सहित पहले से ही APCs 15 के रूप में इस्तेमाल किया गया। इसके अतिरिक्त, NIR विकिरण के क्षेत्र बदलते क्षेत्र में इलाज को कम कर सकते हैं। इधर, लक्ष्य कोशिकाओं पर luciferase गतिविधि की मात्रा का ठहराव और प्रतिदीप्ति के साथ, विशिष्ट कोशिकाओं के पूर्ण उन्मूलन की पुष्टि की थी।

NIR गड्ढे, एक प्रकाश आधारित थेरेपी है, इस प्रकार एक महत्वपूर्ण बिंदु टी हैवह NIR प्रकाश स्रोत और लक्ष्य के बीच की दूरी, प्रकाश ऊर्जा और इसलिए सेल गल जाना एक उलटा-वर्ग कानून (3.4 कदम) के अनुसार कमी के बाद से। 3 डी ठीक, प्लेट इलाज किया जाना चाहिए अंडाकार आकृति और संभव के रूप में के रूप में धीरे incubated बनाने के लिए। बूंदों से युक्त कोशिकाओं को आसानी से नष्ट कर दिया या 3 डी आकार के गठन से पहले एक छोटे से सदमे से गिर रहे हैं।

NIR गड्ढे कई अद्वितीय फायदे हैं। सबसे पहले, NIR गड्ढे APCs पैतृक गैर संयुग्मित एंटीबॉडी के समान नसों में फार्माकोकाइनेटिक्स, IR700 की हाइड्रोफिलिक विशेषताओं, कि अत्यधिक विशिष्ट बंधन के लिए नेतृत्व की कोशिकाओं और कम से कम गैर लक्ष्य संचय को निशाना बनाने के कारण प्रदर्शित करता है। इस प्रकार, ऊतक के प्रत्यारोपण के बाद भी, NIR गड्ढे लक्ष्य कोशिकाओं एपीसी NIR के लिए ब्याज की क्षेत्र के जोखिम के द्वारा पीछा की नसों में इंजेक्शन के माध्यम से इलाज कर सकते हैं। दूसरा, NIR प्रकाश यूवी या दृश्य प्रकाश से ऊतक में बहुत गहरी पैठ कर सकते हैं, इसलिए, NIR गड्ढे न केवल सतह लेकिन यह भी Enti इलाज कर सकता हैसतह पर NIR के लिए जोखिम के प्रतिरोपित ऊतकों की मोटाई रहे हैं। अंत में, NIR गड्ढे को बार-बार बिना किसी सीमा के लक्ष्य कोशिकाओं को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जब लक्ष्य कोशिकाओं कोशिका की सतह पर 18 लक्ष्य अणुओं की पर्याप्त प्रतियां एक्सप्रेस इस विधि उपयोगी है।

हालांकि, इस तकनीक के लिए कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, एपीसी की पारगम्यता सीमित है, क्योंकि यह एक बड़ा अणु है। इस समस्या को दूर करने के लिए, दोहराया NIR गड्ढे उपचार या एंटीबॉडी टुकड़े 18,19,22 शोषण किया जा सकता है। एक और सीमा प्रकाश पैठ है। NIR प्रकाश ठीक से इन विट्रो संस्कृति, विवो उपचार ऐसे पाचन एंडोस्कोपी, ब्रोंकोस्कोपी, या सीधे थोरैकोस्कोपी fiberoptics साथ लक्ष्य क्षेत्र के करीब प्रकाश स्रोत के रूप में रूपांतरित करने के लिए कदम दृष्टिकोण की आवश्यकता होगी करने के लिए अनुवाद घुसना कर सकते हैं हालांकि।

NIR गड्ढे के आगे रूपांतरों दोनों को स्थानीय और कल्पना में इस पद्धति के उपयोग के लिए अनुमति देगा26 - इस तरह के immunomodulation या ट्यूमर microenvironments 24 के रूप में कई क्षेत्रों में ific सेल उन्मूलन।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

इस शोध के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, कैंसर रिसर्च के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) HDP1096-8
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100
LED: L690-66-60 Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) L690-66-60
Vectibix (panitumumab) Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm Cellvis (Mountain View, CA, USA) D35-10-0-N

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