근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

Bioengineering

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Sato, K., Choyke, P. L., Hisataka, K. Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique. J. Vis. Exp. (109), e53633, doi:10.3791/53633 (2016).

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Abstract

Introduction

다른 세포에 손상을주지 않고 특정 세포를 제거하는 것은 특히 설립 조직에서는 매우 곤란하며, 조직 공학 분야에서 세포 제거 방법이 절실히 요구되고있다. 3 - 현재 재생 의학 분야에서, 배아 줄기 세포 (ES), 다 능성 줄기 세포 (PSC를) 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPS)를 이용하여 조직 배양 유망한 재료 1이다.

이러한 조직 재생 유망하지만, 원치 않는 세포 오염의 주요 관심사이다. 또한, 이식 4,5 후 종양 유발의 안전 우려가있다. 많은 연구는 이러한 문제에 집중하고 있지만, 특히 재생 의료 6, 특정 세포를 제거 - (8) 실제적인 방법이 개발되지 않았다.

근적외선 photoimmunotherapy (NIR-PIT)는 항체 - photoabsorber의 conjugat에 따라 치료E (APC). APC는 세포 특이 단일 클론 항체 (단클론 항체)와 photoabsorber, IR700로 구성되어 있습니다. IR700은 친수성 실리카 - 프탈로시아닌 유도체이며, 자체 9 광독성을 유발하지 않습니다. IR700는 공유 라이신 분자의 측쇄상의 아미드 잔기를 통해 항체에 접합된다. APC는 세포막을 표적 분자에 결합하고 690 nm에서 NIR 광에 노출 후 거의 즉각적으로 세포 괴사를 유도한다. 14 - NIR 광, 세포 사멸 (9)에 이르는 세포 멤브레인 파열로 노광시. 21 - NIR-PIT는 항 EGFR, 항 HER2, PSMA 방지, 항 CD25, 항 mesothelin, 항 GPC3 및 안티 CEA (15)를 포함한 다수의 항체 또는 항체 단편으로 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, NIR-PIT는 표적 분자의 다양한 대해 사용될 수있다. 또한, NIR-PIT은 NIR-조명 관리를 제한하여 특정 지역의 선택적 치료를 할 수있는 잘 조절 치료입니다t 조사 18, 22.

여기서는 3D 혼합 배양에서 NIR-PIT를 사용하여 특정 세포를 제거하는 방법을 제시한다.

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Protocol

참고 : 다음 프로토콜은 NIR-PIT를 사용하여 특정 세포를 제거하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 컨트롤 및 NIR-PIT 및 세포 생존에 대한 기타 세부 사항은 다른 곳에서 18 찾을 수 있습니다.

단일 클론 항체에 IR700 1. 활용 (단클론 항체)

  1. 2-5 밀리그램 / 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.6) 용액 ㎖의이자의 단클론 항체를 준비합니다.
  2. microcentrifuge 관에 0.1 M 나 2 HPO 4 용액 (PH 8.6)에 10 mM의 IR700의 30.8 nmol의와 단클론 항체의 6.8 nmol의 혼합과 알루미늄 호일로 덮여 1 시간, 실온에서 품어.
  3. 두 번, 15 ml의 PBS와 PD-10 컬럼 (자재 / 장비의 표 참조) 씻으십시오. 단계 1.2에서 샘플을로드합니다.
  4. 제조업체의 지시에 따라 PBS 용출하여 PD-10 컬럼을 통해 정제하여 혼합물.
    참고 : 여기에, 용출 IR700의 밴드 색깔을 따라했다. 300 ㎕의 샘플의 경우, PBS 용출 분획을 4.4 ml를 전형적으로 2.5 ㎖의 사이이다.
  5. 결정분광 광도계 (9) 595 nm에서 흡광도를 측정하여 쿠마시 염색으로 단백질 농도. 각각의 단클론 항체 분자에 접합 형광 분자의 수를 확인하는 689 nm에서의 흡수율 IR700의 농도를 결정한다.
    주 : 분광 한 단클론 항체에 IR700 분자 최적 접합 수를 결정하는 것이 중요하다. 일반적으로, 1 단클론 항체 분자의 3 주위 IR700 분자는 모두 생체 외생체 작업에 최적입니다. HPLC 및 SDS-PAGE 방법은 단클론 항체 및 IR700가 결합 여부를 여부를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
  6. 단백질 농도를 측정 한 후 4 ℃에서 보관하십시오.

혼합 된 3 차원 세포 배양 2. 준비 (회전 타원체 혼합)

  1. 드롭 플레이트 매달려의 판 저수지 섹션에 멸균 수 (약 1 ml)에 적용합니다.
  2. A431-루크-GFP 세포와 3T3-RFP 세포 - 다양한 관심의 세포 유형의 비율을 준비 -배지를 50 μL에 현탁 총 5000 세포를 포함하는 각 샘플.
    참고 : 문화 미디어에 대한 관심의 세포 유형의 비율이 세포 유형에 따라 100, 100, 10 : 100, 25 : 100, 50 (1)을 준비합니다.
  3. 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 가습 된 배양기에서 96 웰 플레이트에 매달려 드롭 5-7 일간 인큐베이션 믹스. 매 2 일 문화 매체를 변경합니다. 참고 : 세포를 포함하는 상품으로, 3D 정밀하게 회전 타원체 수 있도록 부드럽게 판을 처리하기 위해 3 차원 형상을 형성하기 전에 쉽게 떨어져.
  4. 40X 배율 - 10 배에서 반전 시야 현미경을 사용하여 회전 타원체의 형태와 크기를 관찰한다. 참고 : 세포 유형과 매달려 드롭의 크기에 따라 다르지만, 구형의 직경도 감소 플레이트 매달려 96 7 일간 배양 한 후, 약 400 내지 600 ㎛의 것을 보장한다.

혼합 된 3 차원 세포 배양을위한 체외 NIR-PIT 3.

  1. 헥타르의 미디어 변경10 μg의 / ㎖ 항체 photoabsorber 복합체 (APC)를 포함하는 미디어 드롭 플레이트 플 레이어, 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 가습 된 배양기에서 6 시간 동안 배양한다.
  2. 6 시간 배양 한 후, 신선한 문화 매체 (페놀 레드 무료)로 두 번 회전 타원체를 씻는다. 끝이 절단 부드럽게 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 100 ㎕의 신선한 페놀 레드 무료 문화 매체와 유리 바닥 50mm 접시에 회전 타원체를 전송합니다. 각각의 접시에 한 회전 타원체를 놓습니다.
  3. 형태의 변화를 검출하는 반전 시야 현미경 타원체를 관찰한다. 다음 필터 설정을 형광 현미경을 사용하여 광 기자 (예 : GFP 및 RFP)를 관찰 : GFP - 469 nm의 여기 필터, 525 nm의 방출 필터; RFP - 559 nm의 여기 필터, 630 nm의 방출 필터.
  4. 사출 용 유리 - 바닥 접시 위에 발광 다이오드 (LED)를 배치했다.
    주 : 타원체는 NIR에 노출 될 수있다현미경 또는 층류 후드에 하나 켜집니다.
    1. 광 파워 미터 (9) 근적외선 광의 파워 밀도를 측정한다. 본 측정에 따르면, 2 J / cm 2에서의 670 내지 710의 파장에서 광을 방출하는 발광 다이오드 (LED)를 통해 근적외선 광을 조사한다.
      참고 : LED 조명은 약 5 인치 최대 깊이 침투 할 수 있습니다. NIR-PIT의 세포 독성 효과에 관계없이 전력 밀도와 노출 23 시간 만 주어진 에너지에 의존한다.
  5. 조사 후, 신선한 배지를 50 μL로 새로운 매달아 놓기 플레이트에 회전 타원체를 전송하고 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 가습 된 배양기에서 하루 동안 배양한다.
  6. 조심스럽게 잘라 끝 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 신선한 문화 매체 (페놀 레드 무료) 100 ㎕와 유리 바닥 접시에 회전 타원체를 전송합니다. NIR-PIT 사용 Fi를 한 후 형광 현미경 일일으로 회전 타원체를 관찰LTER 설정 단계 3.3에 기재된.
    1. 또는 형광 현미경 (도 2B)를 이용하여 세포질 14,18,22 GFP 형광의 감소에 의해 2 μg / ML의 최종 농도에서 미디어 프로피 듐 요오다 이드를 첨가함으로써 사균을 검출한다.
  7. 표적 세포가 완전히 제거되지 않은 경우 반복 3.1-3.6 단계를 반복합니다.

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Representative Results

광학 EGFR 과발현 NIR-PIT, A431 세포주의 효과를 모니터링하기 위해 유전자 또한 GFP와 루시 페라 제 (A431 뤽-GFP)을 표현하기 위해 수정되었습니다. NIR-PIT의 비 표적으로의 Balb / 3T3 세포주 광학적 RFP (3T3-RFP)를 표현하기 위해 변경되었다. APC, panitumumab-IR700 (팬-IR700)를 합성 하였다. 세포 (A431 뤽-GFP 및 3T3-RFP)의 다양한 비율로 구성 된 혼합 타원체는이 프로토콜 (그림 1)에 따라 제조 하였다. 반복 NIR-PIT는 팬 IR700 (도 2a에 처방 참조)와 인큐베이션 하였다. 이 혼합 3D 배양에서 표적 세포의 제거는 달성 형광 루시퍼 활동 (도 2B, C)로 모니터링 하였다. 반면에, 비 표적 세포는 성장을 계속했다.

그림 1
16에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
3D 세포 타원체 그림 2. 대상 셀 제거 (A431 뤽-GFP 및 3T3-RFP 세포의 혼합 회전 타원체). (A) NIR-PIT (2 J / cm 2)식이 요법이 표시됩니다. NIR-PIT 반복 (B)는 완전히 혼합 3D 회전 타원체에, 비 표적 세포 (3T3-RFP)없이 해와 표적 세포 (A431 뤽-GFP)을 제거. 바 = 200 μm의. 루시퍼 활동 (C) 정량 (RLU 비)표적 세포 (N = 10, 각 그룹의 회전 타원체)의 완전한 제거를 보여 주었다. 이 그림은 18에서 수정되었습니다. 데이터는 ± SEM는 의미로 표현 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 NIR-PIT를 사용하여 비 - 표적 세포의 손상없이 혼합 3D 세포 배양으로부터 특정 세포를 제거하는 방법을 보여준다. 지금까지 실제적인 세포 제거 방법 조직이 설립되면 또는 이식 후가 없습니다. 따라서, NIR-PIT이 작업을 수행 할 수있는 유망한 방법이다. 장갑차는 단클론 항체 자체와 유사한 약물 동태를 보여 때문에이 기술은도 18, 22 생체 내에서 이용 될 수있다. 표적 세포 형은 다양한 APC로 구성 될 수있다. 21 - 항 EGFR, 안티 PSMA, 안티 mesothelin, 안티 CEA 등 다양한 항체 또는 항체 단편은 이미 장갑차 (15)을 사용 하였다. 또한, NIR-조사의 영역을 변경하면 치료 영역을 최소화 할 수 있습니다. 여기서, 표적 세포에서 루시퍼 라제 활성의 정량 형광 특정 세포의 완전한 제거가 확인되었다.

NIR-PIT 따라서 중요한 점은 t이며, 광 기반 치료입니다빛 에너지와 역 제곱 법칙 (단계 3.4)에 따라, 따라서 세포 괴사 감소 이후 NIR 빛 소스와 대상 사이 그는 거리. 3D 정밀 플레이트가 처리되어야하며, 가능한 한 부드럽게 배양 회전 타원체 확인하십시오. 방울 포함하는 세포는 쉽게 파괴 또는 3D 형상을 형성하기 전에 약간의 충격에 의해 떨어져있다.

NIR-PIT는 몇 가지 독특한 장점이 있습니다. 첫째, NIR-PIT 장갑차 인해 세포와 최소한의 비 표적 축적을 대상으로 바인딩 매우 구체적인 이어질 IR700의 친수성 ​​특성에 부모의 비공 항체와 유사한 정맥 주사 약물 동태를 보여줍니다. 따라서, 심지어 조직 이식 후, NIR-PIT는 NIR 관심 영역의 노광 하였다 APC의 정맥 내 주사를 통해 표적 세포를 치료할 수있다. 둘째, NIR - 빛이 자외선이나 가시 광선보다 조직에 더 깊이 침투 할 수 있으므로, NIR-PIT 표면뿐만 아니라 enti뿐만 아니라 치료를 할 수표면 NIR을 조사함으로써 이식 조직의 두께를 재. 마지막으로, NIR-PIT 반복 제한없이 표적 세포를 제거하는데 사용될 수있다. 표적 세포가 세포 표면 (18)상의 표적 분자의 충분한 복사 표현할 때이 방법은 유용하다.

그러나,이 기술에 대한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이 큰 분자이기 때문에 먼저, APC의 투과성이 제한된다. 이 문제를 극복하기 위해, NIR-PIT 처리 또는 항체 단편은 18,19,22 악용 될 수 반복했다. 또 다른 한계는 빛이 침투합니다. NIR 광이 제대로 체외 배양 등 타깃 영역에 가까운 광원을 이동하는 광통신로 소화 내시경, 기관지 또는 직접 흉강경 같은 적응 방식을 필요로 생체 내 치료에 역 침투 수 있지만.

NIR-PIT의 또 다른 적응 지역 및 사양 모두이 방법의 사용을 허용합니다26 - 이러한 면역 또는 종양 미세 환경 (24) 등 많은 분야에서 IFIC 세포 제거.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

이 연구는 암 연구를위한 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램, 국립 암 연구소, 센터에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) HDP1096-8
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100
LED: L690-66-60 Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) L690-66-60
Vectibix (panitumumab) Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm Cellvis (Mountain View, CA, USA) D35-10-0-N

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