Eliminação celular seletiva de Cultura 3D Mixed usando uma técnica de infravermelho próximo Photoimmunotherapy

Bioengineering

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Sato, K., Choyke, P. L., Hisataka, K. Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique. J. Vis. Exp. (109), e53633, doi:10.3791/53633 (2016).

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Abstract

Introduction

A eliminação de células específicas, sem danificar outras células é extremamente difícil, especialmente no tecido estabelecido, e não há uma necessidade urgente de um método de eliminação de células no campo da engenharia de tecidos. Hoje em dia no campo da medicina regenerativa, as culturas de tecido, utilizando células estaminais embrionárias (ES), células estaminais pluripotentes (PSCs), ou induzida por células estaminais pluripotentes (IPS) são materiais promissores 1-3.

Embora esta regeneração de tecidos é promissor, a contaminação com células não desejadas é uma grande preocupação. Além disso, existe uma preocupação de segurança de tumorigenicidade após o transplante 4,5. Embora muitos estudos têm-se centrado sobre estas questões para eliminar as células específicas, especialmente em medicina regenerativa 6-8, nenhum método prático tem sido desenvolvido.

Perto photoimmunotherapy infravermelho (NIR-PIT) é um tratamento baseado em um anticorpo conjugat-fotoabsorventee (APC). Uma APC é constituído por um anticorpo específico de células monoclonais (mAb) e um fotoabsorvente, IR700. IR700 é um derivado de ftalocianina de sílica-hidrofílico e não induz por si só a fototoxicidade 9. IR700 é covalentemente conjugada com o anticorpo através de resíduos de amida na cadeia lateral de moléculas de lisina. A APC liga-se moléculas alvo na membrana celular e, em seguida, induz necrose celular quase imediato após a exposição à luz NIR a 690 nm. Durante a exposição à NIR-luz, as rupturas de membranas celulares que levam à morte celular 9-14. NIR-PIT tem provado ser eficazes com vários anticorpos ou fragmentos de anticorpos, incluindo o anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesotelina, anti-GPC3, e anti-CEA 15-21. Portanto, NIR-poço pode ser usada contra uma ampla variedade de moléculas-alvo. Além disso, NIR-PIT é um tratamento bem controlado que permite tratamento selectivo de regiões específicas, restringindo o NIR-light irradiação 18,22.

Aqui, apresentamos um método de eliminação célula específica usando NIR-PIT a partir de culturas em 3D mistos.

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Protocol

Nota: O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para eliminar as células específicas usando NIR-PIT. Controles e outros detalhes sobre NIR-PIT e viabilidade celular pode ser encontrada em outro lugar 18.

1. Conjugação de IR700 a anticorpos monoclonais (mAb)

  1. Prepare o mAb de interesse a 2-5 mg / ml em solução (pH 8,6) 0,1 M de Na 2 HPO 4.
  2. Misture 6,8 nmol de mAb com 30,8 nmol de IR700 10 mM em Na 2 HPO H 4 solução 0,1 M (pH 8,6) num tubo de microcentrífuga e incubar à TA durante 1 h, coberto com folha de alumínio.
  3. Lavar a coluna PD-10 (ver Tabela de Materiais / Equipamentos) com 15 ml PBS, duas vezes. Coloque a amostra a partir do passo 1.2.
  4. Purifica-se a mistura através da coluna PD-10 por eluição PBS de acordo com as instruções do fabricante.
    Nota: Aqui, a eluição foi ao longo da cor banda de IR700. Para uma amostra de 300 ul, fracção de eluição PBS é tipicamente entre 2,5 ml a 4,4 ml.
  5. Determine oconcentração de proteína com coloração com Coomassie, medindo a absorção a 595 nm com um espectrofotómetro 9. Determinar a concentração de IR700 com absorção a 689 nm para confirmar o número de moléculas de fluoróforo conjugadas a cada molécula de Acm 9.
    Nota: É importante para determinar um número de conjugação óptima de moléculas IR700 em um mAb com um espectrofotómetro. Geralmente, cerca de 3 moléculas de IR700 na molécula um mAb é óptimo para ambas in vitro e in vivo de trabalho. métodos de HPLC e SDS-PAGE pode ser usado para confirmar se o mAb e IR700 são obrigados ou não.
  6. Armazenar a 4 ° C, depois de determinar a concentração de proteína.

2. Preparação de Cultura de Células 3D Misto (Mixed Spheroid)

  1. Aplicar água estéril (cerca de 1 ml) na seção do reservatório placa de pendurar placas gota.
  2. Prepare a várias proporções dos tipos de células de interesse - células A431-Luc-GFP e células 3T3-RFP -com cada amostra contendo 5000 células no total, suspensos em 50 ul de meio de cultura.
    Nota: Preparar 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, etc proporções de tipos de células de interesse em meios de cultura, dependendo do tipo de célula.
  3. Incubar a mistura durante 5-7 dias a 96 em placa bem pendurado gota numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono. Alterar os meios de cultura a cada 2 dias. Nota: Para fazer o 3D esferóides precisamente, lidar com a placa suavemente, como gotas contendo células cair facilmente antes de formar formas 3D.
  4. Observar a morfologia e tamanho dos esferóides utilizando um microscópio de campo claro invertido a 10X - 40X de ampliação. Nota: Embora dependa em tipos de células e o tamanho de gota suspensa de, assegurar que o diâmetro do esferóide é de cerca de 400-600 uM, após 7 dias de incubação em 96 a placa de suspensão bem gota.

3. In Vitro NIR-PIT para Cultura Celular 3D Mixed

  1. Alterar a mídia da hanging placas gota a 10 ug / ml de conjugado anticorpo-fotoabsorvente (APC) meios que contêm, e incuba-se durante 6 h num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono.
  2. Após 6 horas de incubação, lavar o esferóide duas vezes com meio de cultura fresco (vermelho de fenol livre). Gentilmente transferir o esferóide a um prato de fundo de vidro de 50 mm, com 100 ul fresco fenol meios de cultura livre vermelho usando um estéril 200 mL ponta da pipeta com a ponta cortada. Coloque um esferóide em cada prato.
  3. Observar o esferóide com um microscópio de campo claro invertido para detectar a alteração da morfologia. Para observar os repórteres ópticos (por exemplo, GFP e RFP) usam microscópio de fluorescência com as seguintes configurações de filtro: GFP - filtro de excitação 469 nm e filtro de emissão de 525 nm; RFP - 559 nm, filtro de excitação, e um filtro de emissão de 630 nm.
  4. Coloque o diodo emissor de luz (LED) acima do prato com fundo de vidro para irradiação.
    Nota: Os esferóides podem ser expostos a NIRluz quer no microscópio ou na capa laminar.
    1. Medir a densidade de energia da luz NIR com um medidor de potência óptica 9. De acordo com esta medida, irradiar NIR-luz através de diodos emissores de luz (LEDs) que emitem luz em comprimentos de onda de 670 a 710 nm a 2 J / cm 2.
      Nota: diodo emissor de luz pode penetrar profundidade máxima de aproximadamente 5 polegadas. Efeitos citotóxicos de NIR-PIT depende apenas dada energia, independentemente da densidade de potência e duração da exposição 23.
  5. Após a irradiação, a transferência do esferóide para uma nova placa de gota em suspensão com 50 ul de meio de cultura fresco e incubar durante um dia numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono.
  6. Suavemente transferir o esferóide de um prato de vidro de fundo com 100 ul de meio de cultura fresco (sem vermelho de fenol), utilizando uma ponta de pipeta esterilizada de 200 ul com a ponta cortada. Observe o esferóide com um microscópio de fluorescência 1 dia após NIR-PIT usando ficonfigurações PELD descrito no passo 3.3.
    1. Detecção de células mortas através da adição de iodeto de propídio para os meios de comunicação a uma concentração final de 2 ug / mL, ou pela perda de fluorescência citoplasmática GFP-usando um microscópio de fluorescência (Figura 2B) 14,18,22.
  7. Repita os passos de 3,1-3,6 se as células-alvo não são completamente eliminados.

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Representative Results

Para monitorizar o efeito opticamente de NIR-PIT, a linha celular A431, que sobre-expressa EGFR, foi geneticamente modificado para expressar GFP e também de luciferase (Luc-A431-GFP). Como um não-alvo de NIR-PIT, a linha de células Balb / 3T3 foi opticamente modificada para expressar RFP (3T3-RFP). A APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), foi sintetizado. Esferóides mistas, compostas de várias proporções de células (A431-Luc-GFP e 3T3-RFP) foram fabricados de acordo com este protocolo (Figura 1). Repetiu-NIR PIT foi realizada com a incubação de pan-IR700 (ver esquema na Figura 2A). Eliminação de células alvo a partir desta cultura 3D misturada foi alcançado e monitorizada com fluorescência e actividades da luciferase (Figura 2B, C). Por outro lado, as células não-alvo continuou a crescer.

figura 1
16 anos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. eliminação de células alvo em esferóides de células 3D (esferóides mista de células A431-Luc-GFP e 3T3-RFP). (A) NIR-PIT (a 2 J / cm 2) é mostrado regime. (B) repetida NIR-PIT completamente eliminada células alvo (A431-luc-GFP) com nenhum dano às células não-alvo (3T3-RFP), em um esferóide 3D ​​misto. Barra = 200 um. (C) Quantificação de actividade de luciferase (RLU rácio)demonstraram completa eliminação das células alvo (n = 10 em cada grupo de esferóides). Esta figura foi modificada a partir de 18 anos. Os dados são expressos como média ± SEM Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós demonstramos um método de eliminação de células específicas a partir de uma cultura de células mista 3D sem danos para as células não alvo usando NIR-poço. Até agora, não existe nenhum método prático de eliminação da célula uma vez que o tecido é estabelecida ou após o transplante. Assim, NIR-PIT é um método promissor para alcançar este objetivo. Esta técnica também pode ser utilizada in vivo, 18,22, desde APCs mostram farmacocinéticos semelhantes aos do próprio Acm. O tipo de célula alvo pode ser adaptado com diversas APC. Vários anticorpos ou fragmentos de anticorpos, incluindo o anti-EGFR, anti-PSMA, anti-mesotelina, e anti-CEA já foram usadas como APCs 15-21. Além disso, a alteração da região de irradiação NIR pode minimizar a região tratada. Aqui, com a quantificação da actividade da luciferase e a fluorescência em células alvo, completa eliminação de células específicas foi confirmada.

NIR-PIT é uma terapia baseada luz, assim, um ponto crítico é tele distância entre a fonte de luz NIR e o alvo, uma vez que a energia da luz e, portanto, diminuir a necrose de células de acordo com uma lei do inverso do quadrado (Passo 3.4). Para tornar o 3D esferóide precisamente, a placa deve ser tratada e incubada o mais suavemente possível. As células gotas que contêm são facilmente destruídos ou cair por um pequeno choque antes de formar formas 3D.

NIR-PIT tem várias vantagens únicas. Em primeiro lugar, NIR-PIT APCs demonstrar farmacocinética intravenosa semelhantes aos anticorpos não conjugados dos pais, devido às características hidrofílicas de IR700, que levam a ligação altamente específica para as células e acumulação não-alvo mínima alvo. Assim, mesmo após o transplante do tecido, NIR-poço pode tratar células alvo através de injecção intravenosa da APC seguido por exposição da região de interesse para NIR. Em segundo lugar, NIR-luz pode penetrar muito mais fundo no tecido do que UV ou luz visível, portanto, NIR-PIT poderia tratar não apenas a superfície, mas também a entire espessura do tecido transplantado por exposição ao NIR na superfície. Finalmente, NIR-PIT pode ser repetidamente utilizado para eliminar células alvo sem qualquer limitação. Este método é útil quando as células alvo expressam cópias suficientes das moléculas alvo na superfície da célula 18.

No entanto, existem algumas limitações para esta técnica. Em primeiro lugar, a permeabilidade da APC é limitada uma vez que é uma molécula grande. Para ultrapassar este problema, repetiu NIR-pit de tratamento ou de anticorpos fragmentos podem ser exploradas 18,19,22. Outra limitação é a penetração da luz. Embora o NIR-luz pode penetrar adequadamente cultura in vitro, a tradução para o tratamento in vivo exigiria abordagens adaptadas tais como endoscopia digestiva, broncoscopia, ou toracoscopia direto com fibras ópticas para mover a fonte de luz mais perto de região-alvo.

Outras adaptações de NIR-poço vai permitir a utilização do presente método em ambos os locais e especificaçãoeliminação de células ific em muitos campos, como a imunomodulação ou tumorais microambientes 24 - 26.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Investigação Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) HDP1096-8
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100
LED: L690-66-60 Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) L690-66-60
Vectibix (panitumumab) Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm Cellvis (Mountain View, CA, USA) D35-10-0-N

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