从混合三维培养使用近红外Photoimmunotherapy技术选择性细胞消除

1Molecular Imaging Program, National Cancer Institute
Bioengineering

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Sato, K., Choyke, P. L., Hisataka, K. Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique. J. Vis. Exp. (109), e53633, doi:10.3791/53633 (2016).

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Abstract

Introduction

消除特定细胞而不损害其他细胞是非常困难的,特别是在建立组织,并且存在用于在组织工程领域中的细胞消除方法的迫切需要。现今在再生医学领域中,使用胚胎干细胞(ES),多能干细胞(的PSCs),或诱导的多能干细胞(IPS)的组织培养物是有前途的材料1 - 3。

虽然这个组织再生是有前途的,具有不需要的细胞污染是一个大问题。此外,有移植4,5-之后致瘤性的安全问题。虽然许多研究都集中在这些问题上,以消除特定细胞,尤其是在再生医学6 - 8,没有实际的方法已被开发出来。

近红外photoimmunotherapy(NIR-PIT)是一种基于抗体 - 光吸收剂conjugat的处理E(APC)。一个APC由细胞特异性单克隆抗体(mAb)和光吸收剂,IR700的。 IR700是亲水性二氧化硅的酞菁衍生物和本身并不9诱发光毒性。 IR700是通过赖氨酸分子的侧链酰胺残基共价结合到抗体上。 APC的结合细胞膜上的靶分子,然后诱导暴露于NIR光在690纳米的近后立即细胞坏死。在暴露于近红外光,细胞膜破裂,导致细胞死亡9 - 14。 NIR-PIT已被证明是具有多个抗体或抗体片段,其中包括抗EGFR,抗HER2,抗PSMA,抗CD25,抗间皮素,抗GPC3,和抗CEA 15有效- 21。因此,近红外PIT可对多种靶分子使用。此外,近红外PIT是良好控制的治疗,通过限制近红外二极管灯允许特定区域的选择性治疗ŧ照射18,22。

这里,我们目前采用NIR-PIT从混合3D文化特异性细胞清除的方法。

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Protocol

注意:以下协议描述必要的步骤来消除使用NIR-PIT特定细胞。控制和有关NIR-PIT和细胞活力等细节可以在其他地方18中找到。

1.共轭IR700,以单克隆抗体(MAB)

  1. 在2-5毫克/毫升的0.1M Na 2 HPO 4(pH为8.6)的溶液制备的兴趣的mAb。
  2. 混合mAb的6.8纳摩尔用10mM IR700 30.8纳摩尔在0.1M Na 2 HPO 4在微量离心管中液(pH 8.6),并在室温孵育1小时,用铝箔覆盖。
  3. 用15ml的PBS洗涤PD-10柱(参见材料/设备的数据表),两次。从步骤1.2装载样品。
  4. 根据制造商的说明通过PBS洗脱纯化经由PD-10柱的混合物。
    注:在这里,洗脱沿IR700的带颜色。对于300微升样品,PBS洗脱分数毫升〜4.4毫升通常为2.5之间。
  5. 确定蛋白质浓度用考马斯染色,通过测量在595nm处的吸收用分光光度计9。确定IR700与吸收的浓度在689纳米到确认缀合每种mAb分子9荧光团分子的数目。
    注意:确定在1单抗IR700分子的最佳偶联次数用分光光度计是很重要的。通常,在1单抗分子约3 IR700分子是最适用于在体外体内的工作。 HPLC和SDS-PAGE方法可以用于确认单抗和IR700是否可能会或没有。
  6. 测定蛋白质浓度后储存于4℃。

2.准备混合3D细胞培养(混合球体)

  1. 应用无菌水(约1ml)中成悬滴板的板储部分。
  2. 制备的细胞类型的利益的各种比例 - A431-LUC-GFP细胞和3T3-RFP细胞 -用含有5,000个细胞总数,悬浮于50μl培养基的每一个样品。
    注意:根据细胞类型的培养基中的细胞类型的兴趣的比率100 :准备1:100,10:100; 25:100,50。
  3. 在37℃和5%二氧化碳孵育在96孔悬滴板5-7天的混合物在加湿培养箱中。改变培养基,每2天。注:为了使3D球体准确,轻拿轻放盘,如含有细胞滴形成3D形状之前,容易脱落。
  4. 40X放大率 - 使用倒置亮视野显微镜在10倍观察球体的形态和尺寸。注意:尽管这取决于细胞类型和悬滴的大小,确保该球体的直径后,在96孵育7天后的孔悬滴板周围400-600微米。

3. 在体外 NIR-PIT混合3D细胞培养

  1. 更改HA媒体nging滴板,以10微克/毫升抗体 - 光吸收剂结合物(APC)含有介质,并且在37℃和5%二氧化碳的潮湿培养箱孵育6小时。
  2. 后6小时温育后,用新鲜的培养基(无酚红)洗球体的两倍。轻轻球体用100微升新鲜无酚红培养基用无菌200微升枪头,转移到玻璃底50毫米菜尖切断。放在每道菜1球体。
  3. 观察球体用倒置明显微镜检测形态的变化。观察光学记者(如 GFP和RFP)使用具有以下过滤器设置荧光显微镜:GFP - 469 nm激发过滤器和525 nm发射滤波器; RFP - 559 nm的激发滤光片和630nm的发射滤光器。
  4. 放置照射玻璃底培养皿上方的发光二极管(LED)。
    注:球体​​可以接触到近红外光无论是在显微镜或在层流罩。
    1. 测量近红外光的功率密度与光功率计9。根据该测定,通过发光二极管(LED),其在在2J / cm 2的670至710纳米的波长的发射光照射近红外光。
      注:LED灯可以穿透大约5英寸最大深度。不管功率密度和曝光23的持续时间的近红外PIT的细胞毒性作用是只依赖于给定的能量。
  5. 照射后,转移球体到一个新的悬滴板用50μl新鲜培养基,并在37℃和5%二氧化碳的潮湿培养箱孵育1天。
  6. 轻轻球体用100微升使用带切断尖端无菌200微升枪头,新鲜培养基(无酚红)的转移到玻璃底菜。观察与NIR-PIT使用网络连接后,荧光显微镜1天球体在步骤3.3说明过滤器设置。
    1. 通过,或通过使用荧光显微镜( 2B)14,18,22细胞质的GFP荧光的损失以2微克/毫升的最终浓度加入碘化丙啶至媒体检测死细胞。
  7. 如果靶细胞没有完全消除重复步骤3.1-3.6。

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Representative Results

以光学监控NIR-PIT中,A431细胞系,其过表达EGFR的效果,被遗传修饰以也表达GFP和荧光素酶(A431-LUC-GFP)。作为近红外PIT的一个非目标,所述的Balb / 3T3细胞系的光学修饰以表达RFP(3T3-RFP)。 APC的,帕尼单抗-IR700(泛IR700),合成。混合球状体,其中分别组成细胞(A431-LUC-GFP和3T3-RFP)的各种比例的是按照此协议( 图1)制成。反复NIR-PIT与泛IR700(参见图2A方案)的孵化执行。从这种混合三维培养靶细胞消除达到与荧光和荧光素酶的活动( 图2B,C)进行监测。另一方面,非靶细胞持续增长。

图1
16修改。 请点击此处查看本图的放大版本。

图2
在三维细胞球体图2.靶细胞消除(A431-LUC-GFP和3T3-RFP细胞混合球体)。(A)的近红外-PIT(2J / cm 2)的方案中示出。 (B)的重复NIR-PIT完全消除,没有损害非靶细胞(3T3-RFP)靶细胞(A431-LUC-GFP)中的混合三维球体。栏= 200微米。荧光素酶的活动(C)定量(RLU比)靶细胞(每组10球体)的证明完全消除。这个数字已经从18修改。数据表示为平均值±SEM 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

我们证明特定细胞消除从混合三维细胞培养物的方法,而不使用近红外-PIT损害对非靶细胞。到目前为止,存在一旦组织被建立或细胞消除无实际方法移植后。因此,NIR-PIT是实现这个很有前途的方法。这种技术也可在体内 18,22利用因为的APCs显示出类似的药代动力学为单克隆抗体本身。靶细胞类型可适于与各种的APC。各种抗体或抗体片段,其中包括抗EGFR,抗PSMA,抗间皮素和抗CEA已经用作的APC 15 - 21。此外,改变NIR照射的区域可以最小化处理的区域。这里,以萤光素酶活性的定量和荧光对靶细胞,特定的细胞完全消除了确认。

NIR-PIT是一种基于光治疗,因而临界点为t他的近红外光源和目标之间的距离,由于光能量并根据一平方反比定律(步骤3.4),因此细胞坏死减少。使三维球体确切地说,板应处理并轻轻孵育越好。含滴细胞很容易被破坏,或形成3D形状面前有点惊世骇俗脱落。

NIR-PIT有一些独特的优势。首先,NIR-PIT的APCs展示出相似静脉内药代动力学给父母的非共轭的抗体,由于IR700的亲水性,导致高度特异性结合到靶细胞和最小非目标累积。因此,即使在组织移植后,NIR-PIT可通过在APC随后感兴趣近红外区域的曝光的静脉注射治疗的靶细胞。第二,近红外光可以穿透更深入组织比紫外线或可见光,因此,近红外PIT可以治疗不仅表面而且ENTI再通过暴露于NIR表面处的移植组织的厚度。最后,近红外PIT可反复使用,以消除靶细胞而没有限制。当靶细胞在细胞表面表达18靶分子足够的副本,此方法非常有用。

不过,也有这种技术有一些限制。首先,在APC的渗透性被限制,因为它是一个大的分子。为了克服这个问题,反复NIR-PIT治疗或抗体片段可以利用18,19,22。另一个限制是光线穿透。虽然近红外光可正确地穿透体外培养,翻译到体内治疗需要适于的方法,如消化内镜,支气管镜,或直接胸腔镜与光导纤维移动光源更靠近目标区域。

NIR-PIT的进一步修改将允许在本地和规范使用这种方法的IFIC细胞消灭在许多领域,如免疫调节或肿瘤微环境中24 - 26。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgements

这项研究是由美国国立卫生研究院院内研究计划,国家癌症研究所,癌症研究中心的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) HDP1096-8
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100
LED: L690-66-60 Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) L690-66-60
Vectibix (panitumumab) Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm Cellvis (Mountain View, CA, USA) D35-10-0-N

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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