Selectieve Cell Eliminatie van Gemengde 3D Cultuur Met behulp van een Near Infrared Photoimmunotherapy Techniek

1Molecular Imaging Program, National Cancer Institute
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sato, K., Choyke, P. L., Hisataka, K. Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique. J. Vis. Exp. (109), e53633, doi:10.3791/53633 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Elimineren van specifieke cellen zonder schade aan andere cellen is zeer moeilijk, vooral in gevestigde weefsel en er dringend behoefte aan een cel eliminatiemethode in het veld van tissue engineering. Tegenwoordig is op het gebied van regeneratieve geneeskunde, weefselculturen met embryonale stamcellen (ES), pluripotente stamcellen (PSC), of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) zijn veelbelovende materialen 1-3.

Hoewel dit weefselregeneratie is veelbelovend, verontreiniging met ongewenste cellen is een grote zorg. Bovendien is er geen gevaar van tumorvorming na transplantatie 4,5. Hoewel veel studies gericht op deze kwesties specifieke cellen te elimineren, vooral in regeneratieve geneeskunde 6-8, heeft geen praktische methode ontwikkeld.

Nabij-infrarood photoimmunotherapy (NIR-PIT) is een behandeling op basis van een antilichaam-photoabsorber conjugate (APC). Een APC bestaat uit een cel-specifiek monoklonaal antilichaam (mAb) en een photoabsorber, IR700. IR700 is een hydrofiel silica-ftalocyanine derivaat en heeft fototoxiciteit niet induceert op zichzelf 9. IR700 covalent geconjugeerd met het antilichaam via amide resten op de zijketen van lysine moleculen. De APC bindt doelmoleculen op de celmembraan en induceert bijna onmiddellijk celnecrose na blootstelling aan NIR licht bij 690 nm. Tijdens de blootstelling aan NIR-licht, het cellulaire membraan scheurt leidend tot celdood 9-14. NIR-PIT heeft bewezen effectief met meerdere antilichamen of antilichaamfragmenten, waaronder anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesothelin, anti-GPC3 en anti-CEA 15 zijn - 21. Daarom kan NIR-PIT worden gebruikt tegen diverse doelmoleculen. Bovendien NIR-PIT is een goed gecontroleerde behandeling die selectieve behandeling van specifieke regio maakt door het op de NIR-light bestraling 18,22.

Hier presenteren we een methode specifieke cel eliminatie middels NIR-PIT van gemengde 3D kweken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Het volgende protocol beschrijft de nodige stappen om specifieke cellen met behulp van NIR-PIT elimineren. Controles en andere details over NIR-PIT en de levensvatbaarheid van de cellen kunnen elders 18 worden gevonden.

1. Conjugatie van IR700 om monoklonale antilichamen (mAb)

  1. Bereid mAb plaats bij 2-5 mg / ml in 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) oplossing.
  2. Meng 6,8 nmol mAb met 30,8 nmol van 10 mM IR700 in 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) in een microcentrifugebuis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, afgedekt met aluminiumfolie.
  3. Was de PD-10-kolom (zie tabel of Materials / Equipment) met 15 ml PBS, twee keer. Laad het monster van stap 1.2.
  4. Zuiver het mengsel via de kolom PD-10 door elutie PBS volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Hier, de elutie was langs de band kleur van IR700. Voor een 300 pi monster PBS elutiefractie ligt typisch tussen 2,5 ml tot 4,4 ml.
  5. Bepaleneiwitconcentratie met Coomassie kleuring door meting van de absorptie bij 595 nm met een spectrofotometer 9. Het gehalte aan IR700 met absorptie bij 689 nm tot het aantal moleculen geconjugeerd fluorofoor elk mAb molecule 9 bevestigen.
    Opmerking: Het is belangrijk om een ​​optimale conjugatie aantal IR700 moleculen bepalen 1 mAb met een spectrofotometer. In het algemeen ongeveer 3 IR700 moleculen in 1 mAb molecule is optimaal voor zowel in vitro als in vivo werken. HPLC en SDS-PAGE werkwijzen kunnen worden gebruikt om te bevestigen of de mAb en IR700 of niet gebonden.
  6. Bewaren bij 4 ° C na het bepalen van de eiwitconcentratie.

2. Voorbereiding van de Gemengde 3D Cell Culture (Mixed Sferoïde)

  1. Breng een steriel water (ongeveer 1 ml) in de plaat reservoir deel van de opknoping druppel platen.
  2. Bereid verschillende verhoudingen van de celtypen plaats - A431-luc-GFP-cellen en 3T3-cellen RFP -met elk monster dat 5.000 cellen in totaal, gesuspendeerd in 50 ul van cultuur media.
    Noot: Bereid 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, enz verhouding van celtypen van interesse in kweekmedia afhankelijk van het celtype.
  3. Incubeer het mengsel gedurende 5-7 dagen in de 96 putjes opknoping valplaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% kooldioxide. Verander het kweekmedium om de 2 dagen. Opmerking: Om de 3D-spheroïde precies, omgaan met de plaat voorzichtig, als druppels bevattende cellen gemakkelijk vallen voor de vorming van 3D-vormen.
  4. Neem de morfologie en de grootte van de sferoïden met een omgekeerde helderveld microscoop bij 10X - 40X vergroting. Noot: Hoewel het afhankelijk celtypen en de grootte van hangende-druppel voor dat de diameter van de bolvormige ongeveer 400-600 urn na 7 dagen incubatie in de 96 putjes opknoping valplaat.

3. In Vitro NIR-PIT voor Gemengde 3D ​​Cell Culture

  1. Wijzig de media van de hanging druppel platen 10 ug / ml antilichaam-conjugaat photoabsorber (APC) bevattende media en incubeer gedurende 6 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% kooldioxide.
  2. Na 6 uur incubatie, was de bolvormige tweemaal met vers kweekmedium (fenolrood gratis). Voorzichtig de sferoïde te dragen aan een glazen bodem 50 mm schotel met 100 pl vers fenolrood vrije cultuur media met behulp van een steriele 200 ul pipet met de tip afgesneden. Plaats een sferoïde in elk gerecht.
  3. Observeer de sferoïde met een omgekeerde helderveld microscoop om de verandering van de morfologie detecteren. Om de optische reporters (bijvoorbeeld GFP en RFP) te observeren gebruiken fluorescentiemicroscoop met de volgende filter instellingen: GFP - 469 nm excitatie filter, en 525 nm emissie filter; RFP - 559 nm excitatie filter, en 630 nm emissie filter.
  4. Plaats de light-emitting diode (LED) boven de glazen bodem schotel voor bestraling.
    Noot: sferoïden kunnen worden blootgesteld aan NIRlicht hetzij op de microscoop of de laminaire kap.
    1. Meet de vermogensdichtheid van de NIR-licht met een optische vermogensmeter 9. Volgens deze meting bestralen NIR-licht via light-emitting diodes (LED's) die licht uitzenden bij golflengten van 670-710 nm bij 2 J / cm2.
      Let op: LED-licht kan een maximale diepte van ongeveer 5 inch dringen. Cytotoxische effecten van NIR-PIT alleen afhankelijk is gegeven energie ongeacht vermogensdichtheid en de blootstellingsduur 23.
  5. Na bestraling overdracht van de sferoïde in een hangende druppel nieuwe plaat met 50 ul van vers kweekmedium en incubeer gedurende 1 dag in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% kooldioxide.
  6. Voorzichtig de sferoïde te dragen aan een glazen bodem schaal met 100 pl vers kweekmedium (fenolrood gratis) met behulp van een steriele 200 ul pipet met de tip afgesneden. Let op de sferoïde met een fluorescentiemicroscoop 1 dag na de NIR-PIT met behulp van filter instellingen beschreven in stap 3.3.
    1. Detecteren dode cellen door toevoeging van propidiumjodide aan de media tot een eindconcentratie van 2 ug / ml, of door het verlies van cytoplasmatische GFP-fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop (figuur 2B) 14,18,22.
  7. Herhaal stappen 3.1-3.6 als doelcellen niet volledig geëlimineerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optisch bewaken van het effect van NIR-PIT, de A431-cellijn, die EGFR tot overexpressie werd genetisch gemodificeerd om ook GFP en luciferase (A431-luc-GFP) uit te drukken. Als niet-doelwit van NIR-PIT, werd de Balb / 3T3-cellijn optisch aangepast om RFP (3T3-RFP) uit te drukken. De APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), werd gesynthetiseerd. Gemengde sferoïden, die zijn samengesteld uit verschillende verhoudingen van cellen (A431-luc-GFP en 3T3-RFP) werden vervaardigd volgens dit protocol (figuur 1). Herhaalde NIR-PIT werd uitgevoerd met de incubatietijd van pan-IR700 (zie schema in figuur 2A). Doelwitcel eliminatie van deze gemengde 3D ​​kweek werd bereikt en bewaakt met fluorescentie en luciferase activiteiten (Figuur 2B, C). Anderzijds, niet-doelwitcellen bleef groeien.

Figuur 1
16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. Doelcel eliminatie in 3D cel sferoïden (bolvormige deeltjes van gemengde A431-luc-GFP en RFP 3T3-cellen). (A) NIR-PIT (2 J / cm2) schema weergegeven. (B) Herhaalde NIR-PIT volledig geëlimineerd doelcellen (A431-luc-GFP) met geen schade aan non-target cellen (3T3-RFP), in een gemengde 3D ​​sferoïde. Bar = 200 urn. (C) Kwantificering van luciferase activiteiten (RLU ratio)toonde volledige eliminatie van doelcellen (n = 10 sferoïden in elke groep). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 18. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden ± sem Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We tonen een methode om specifieke cel eliminatie uit een gemengde 3D celkweek zonder schade aan non-target cellen door het gebruik van NIR-PIT. Tot nu toe is er geen praktische methode cel elimineren wanneer het weefsel wordt gevestigd of na transplantatie. Aldus NIR-PIT is een veelbelovende methode om dit te bereiken. Deze techniek kan ook worden gebruikt in vivo 18,22, omdat APC's vertonen gelijkaardige farmacokinetiek mAb zelf. Het type doelcel kan worden aangepast met diverse APC. Verschillende antilichamen of antilichaamfragmenten, waaronder anti-EGFR, anti-PSMA, anti-mesothelin en anti-CEA reeds gebruikt als APC's 15-21. Bovendien verandert regio NIR-bestraling regio behandeld minimaliseren. Hier, met kwantificering van luciferaseactiviteit en fluorescentie op doelcellen, volledige verwijdering van specifieke cellen werd bevestigd.

NIR-PIT is een licht gebaseerde therapie, dus een kritisch punt is tHij afstand tussen de NIR-lichtbron en het doel, aangezien lichtenergie en derhalve celnecrose vermindering volgens een omgekeerde kwadratenwet (stap 3,4). Om de 3D sferoïde precies de plaat moeten worden behandeld en geïncubeerd zo voorzichtig mogelijk. De druppels bevattende cellen gemakkelijk worden vernietigd of vallen door een kleine schok voor de vorming van 3D-vormen.

NIR-PIT heeft een aantal unieke voordelen. Ten eerste NIR-PIT APC's tonen soortgelijke intraveneuze farmacokinetiek ouderlijke niet-geconjugeerde antilichamen, door de hydrofiele karakteristieken van IR700, die leiden tot zeer specifieke binding aan cellen en minimale doelsoort accumulatie targeten. Zelfs na transplantatie van het weefsel, NIR-PIT kan doelcellen behandeling via intraveneuze injectie van de APC gevolgd door blootstelling van het gebied van belang NIR. Ten tweede kan NIR-licht veel dieper in het weefsel dan UV of zichtbaar licht door te dringen, dus NIR-PIT kon behandelen niet alleen de oppervlakte, maar ook de entire dikte van het getransplanteerde weefsel door blootstelling aan NIR aan het oppervlak. Tenslotte kan NIR-PIT herhaaldelijk worden gebruikt om doelwitcellen te elimineren zonder beperking. Deze methode is nuttig als doelcellen voldoende afschriften van doelmoleculen op het celoppervlak tot expressie 18.

Er zijn echter een aantal beperkingen aan deze techniek. Ten eerste wordt de doorlaatbaarheid van de APC beperkt omdat het een groot molecuul. Om dit probleem op te lossen, herhaalde NIR-PIT behandeling of antilichaamfragmenten kan worden benut 18,19,22. Een andere beperking is lichtinval. Hoewel de NIR-licht goed kan doordringen in vitro kweek, translatie in vivo behandeling zou aangepast benaderingen zoals spijsvertering endoscopie, bronchoscopie of direct thoracoscopie met vezeloptica de lichtbron dichter bij het ​​doelgebied bewegen vereisen.

Verdere aanpassingen van NIR-PIT zal het gebruik van deze werkwijze in zowel lokale en specific cel eliminatie op vele gebieden, zoals immunomodulatie of tumor microenvironments 24-26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) HDP1096-8
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100
LED: L690-66-60 Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) L690-66-60
Vectibix (panitumumab) Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm Cellvis (Mountain View, CA, USA) D35-10-0-N

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, (7381), 295-305 (2012).
  2. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10, (6), 678-684 (2012).
  3. Birchall, M. A., Seifalian, A. M. Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation. Lancet. 6736, (14), 11-12 (2014).
  4. Ben-David, U., Benvenisty, N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat. Rev. Cancer. 11, (4), 268-277 (2011).
  5. Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 143, (4), 508-525 (2010).
  6. Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (35), 3281-3290 (2013).
  7. Miura, K., Okada, Y., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27, (8), 743-745 (2009).
  8. Tang, C., Lee, A. S., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat. Biotechnol. 29, (9), 829-834 (2011).
  9. Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nat. Med. 17, (12), 1685-1691 (2011).
  10. Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy. BMC Cancer. 12, (1), 345 (2012).
  11. Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging. Cancer Res. 72, (18), 4622-4628 (2012).
  12. Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET. J. Nucl. Med. 54, (5), 770-775 (2013).
  13. Sato, K., Watanabe, R., et al. Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Mol. Oncol. 8, (3), 620-632 (2014).
  14. Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Lett. 365, (1), 112-121 (2015).
  15. Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer. Mol. Cancer Ther. 14, (8), 141-150 (2014).
  16. Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PloS one. 9, (11), 113276 (2014).
  17. Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience. Theranostics. 5, (7), 698-709 (2015).
  18. Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine. RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).
  19. Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies. J. Nucl. Med. 56, (1), 140-144 (2014).
  20. Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model. Theranostics. 3, (6), 357-365 (2013).
  21. Shirasu, N., Yamada, H. Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy. Int J Cancer. 135, (11), 1-14 (2014).
  22. Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, (23), 19747-19758 (2015).
  23. Nakajima, T., Sato, K., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC cancer. 14, (1), 389 (2014).
  24. Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 7, (2), 131-142 (2008).
  25. Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 10, (2), 77-88 (2014).
  26. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 12, (4), 252-264 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics