Selektiv Cell Eliminering från Mixed 3D kultur med hjälp av en Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sato, K., Choyke, P. L., Hisataka, K. Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique. J. Vis. Exp. (109), e53633, doi:10.3791/53633 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Eliminera specifika celler utan att skada andra celler är extremt svårt, särskilt i etablerade vävnad, och det finns ett brådskande behov av en eliminering cellmetod i tissue engineering fältet. Nuförtiden inom området regenerativ medicin, vävnadskulturer med användning av embryonala stamceller (ES), pluripotenta stamceller (PSC) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPS) är lovande material 1 - 3.

Även om denna vävnadsregenerering är lovande, är kontaminering med oönskade celler ett stort problem. Dessutom finns det en oro för säkerheten av tumörbildning efter transplantation 4,5. Även om många studier har fokuserat på dessa frågor för att eliminera specifika celler, särskilt inom regenerativ medicin 6-8, har ingen praktisk metod utvecklats.

Nära infraröd photoimmunotherapy (NIR-PIT) är en metod som bygger på en antikropp-photoabsorber conjugate (APC). En APC består av en cellspecifik monoklonal antikropp (mAb) och en photoabsorber, IR700. IR700 är en hydrofil kiseldioxid-ftalocyanin-derivat och inducerar inte fototoxicitet i sig nio. IR700 är kovalent konjugerad till antikroppen via amid-rester på sidokedjan i lysin-molekyler. APC binder målmolekyler på cellmembranet och sedan inducerar nästan omedelbar cellnekros efter exponering för NIR-ljus vid 690 nm. Under exponering för NIR-ljus, det cellulära membranet brister som leder till celldöd 9-14. NIR-PIT har visat sig vara effektivt med flera antikroppar eller antikroppsfragment, inklusive anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesotelin, anti-GPC3, och anti-CEA 15-21. Därför kan NIR-PIT användas mot ett stort antal olika målmolekyler. Dessutom är NIR-PIT en väl kontrollerad behandling som tillåter selektiv behandling av specifika regioner genom att begränsa NIR-light bestrålning 18,22.

Här presenterar vi en metod för specifik cell eliminering med hjälp av NIR-PIT från blandade 3D kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Följande protokoll beskriver de åtgärder som krävs för att undanröja specifika celler med hjälp av NIR-PIT. Kontroller och andra detaljer om NIR-PIT och cellviabilitet kan hittas någon annanstans 18.

1. Konjugering av IR700 till monoklonala antikroppar (mAb)

  1. Förbered mAb av intresse vid 2-5 mg / ml i 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) lösning.
  2. Blanda 6,8 nmol av mAb med 30,8 nmol 10 mM IR700 i 0,1 M Na 2 HPO 4-lösning (pH 8,6) i ett mikrocentrifugrör och inkubera vid RT i 1 h, täckt med aluminiumfolie.
  3. Tvätta PD-10-kolonn (se tabell av material / utrustning) med 15 ml PBS, två gånger. Ladda provet från steg 1,2.
  4. Rena blandningen via PD-10-kolonn med PBS eluering enligt tillverkarens anvisningar.
    Obs: Här var elueringen längs bandet färg IR700. Ett exempel 300 pl, är PBS elueringsfraktionen typiskt mellan 2,5 ml till 4,4 ml.
  5. bestämmaproteinkoncentration med Coomassie-färgning genom mätning av absorptionen vid 595 nm med en spektrofotometer 9. Bestäm koncentrationen av IR700 med absorption vid 689 nm för att bekräfta antalet fluorofor molekyler konjugerade till varje mAb molekyl 9.
    Obs: Det är viktigt att bestämma en optimal konjugering antal IR700 molekyler i en mAb med en spektrofotometer. I allmänhet, är optimal för både in vitro och in vivo arbete kring tre IR700 molekyler i en mAb-molekylen. HPLC och SDS-PAGE-metoder kan användas för att bekräfta om mAb och IR700 är bundna eller inte.
  6. Förvara vid 4 ° C efter att bestämma proteinkoncentrationen.

2. Beredning av blandad 3D Cell Culture (Mixed Spheroid)

  1. Tillämpa sterilt vatten (cirka 1 ml) i plattan reservoarsektionen av hängande fallplåtarna.
  2. Förbered olika förhållanden av celltyper av intresse - A431-luc-GFP celler och 3T3-RFP celler -med varje prov innehöll 5000 celler totalt, suspenderade i 50 fil av odlingsmedier.
    Beakta: Bered ett: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, etc. förhållanden av celltyper av intresse i odlingsmedia beroende på celltyp.
  3. Inkubera blandningen under 5-7 dagar i 96 väl hängande droppe platta i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% koldioxid. Ändra odlingsmedia var 2 dagar. Obs: För att göra 3D sfäroid exakt hantera plattan försiktigt, som droppar innehållande celler lossna lätt innan bilda 3D-former.
  4. Observera morfologin och storleken av sfäroiderna med användning av ett inverterat bright mikroskop vid 10X - 40X förstoring. Obs: Även om det beror på celltyper och storleken av hängande-droppe, se till att diametern på sfäroid är cirka 400-600 um efter 7 dagars inkubation i 96 väl droppe platta.

3. In vitro NIR-PIT för Blandade 3D ​​Cell Culture

  1. Ändra media hand-nging fallplåtarna till 10 | ig / ml antikropps photoabsorber konjugat (APC) som innehåller medier, och inkubera i 6 h i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% koldioxid.
  2. Efter 6 timmars inkubation, tvätta sfäroid två gånger med färskt odlingsmedium (fenolröttfritt). Försiktigt överföra sfäroid till en glasbottnad 50 mm skål med 100 pl färsk fenolrött fritt odlingsmedium med en steril 200 mikroliter pipettspets med spetsen avskuren. Placera en sfäroid i varje skål.
  3. Observera sfäroid med ett inverterat bright mikroskop för att upptäcka förändringen av morfologin. För att observera de optiska reportrar (t ex GFP och RFP) använder fluorescensmikroskop med följande filterinställningar: GFP - 469 nm excitationsfilter och 525 nm emissionsfilter; RFP - 559 nm excitationsfilter och 630 nm emissionsfilter.
  4. Placera den ljusavgivande diod (LED) över glasbottnade skålen för bestrålning.
    Note: sfäroider kan utsättas för NIRljus antingen på mikroskop eller i laminärt huva.
    1. Mät effekttäthet NIR-ljus med en optisk effektmätare 9. Enligt denna mätning, bestråla NIR-ljus via lysdioder (LED) som emitterar ljus vid våglängder av 670-710 nm vid 2 J / cm 2.
      Obs: LED-ljus kan tränga igenom maximalt djup av ca 5 inches. Cytotoxiska effekterna av NIR-PIT är beroende enbart given energi oberoende av effekttäthet och varaktighet av exponering 23.
  5. Efter bestrålning, överföra sfäroid i en ny droppe platta med 50 | il av färsk odlingsmedia och inkubera i 1 dag i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% koldioxid.
  6. Försiktigt överföra sfäroid till en glasbottnad skål med 100 pl av färskt odlingsmedium (fenolrött fritt) med användning av en steril 200 mikroliter pipettspets med spetsen avskuren. Observera sfäroid med ett fluorescensmikroskop en dag efter NIR-PIT använder fiLTER inställningar beskrivs i steg 3,3.
    1. Detektera döda celler genom att tillsätta propidiumjodid till medierna vid en slutkoncentration av 2 | ig / ml, eller genom förlust av cytoplasmisk GFP-fluorescens med användning av ett fluorescensmikroskop (figur 2B) 14,18,22.
  7. Upprepa steg 3,1-3,6 om målceller inte helt elimineras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att optiskt övervaka effekterna av NIR-PIT, A431 cellinje som överuttrycker EGFR var genetiskt modifierad för att också uttrycka GFP och luciferas (A431-luc-GFP). Som en icke-mål av NIR-PIT, var Balb / 3T3 cellinje optiskt modifierad för att uttrycka RFP (3T3-RFP). APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), syntetiserades. Blandade sfäroider, som består av olika förhållanden mellan celler (A431-luc-GFP och 3T3-RFP) tillverkades enligt detta protokoll (Figur 1). Upprepad NIR-PIT utfördes med inkubation av pan-IR700 (se regim i figur 2A). Målcellen eliminering från detta blandade 3D ​​kultur uppnåddes och övervakas med fluorescens och luciferasaktiviteter (Figur 2B, C). Å andra sidan, icke-målceller fortsatte att växa.

Figur 1
16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Mål cell eliminering i 3D cell sfäroider (blandade sfäroider av A431-luc-GFP och 3T3-RFP celler). (A) NIR-PIT (2 J / cm 2) regim visas. (B) Upprepad NIR-PIT helt elimineras målceller (A431-luc-GFP) utan skada för icke-målceller (3T3-RFP), i en blandad 3D sfäroid. Streck = 200 um. (C) Kvantifiering av luciferas aktiviteter (RLU ratio)demonstrerade fullständig eliminering av målceller (n = 10 sfäroider i varje grupp). Denna siffra har ändrats från 18. Data uttrycks som medelvärden ± sem Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi visar en metod för specifik eliminering cell från en blandad 3D cellkultur utan att skada icke-målceller med hjälp av NIR-PIT. Hittills finns det ingen praktisk metod för eliminering cell när vävnaden är etablerad eller efter transplantation. Sålunda är NIR-PIT en lovande metod för att åstadkomma detta. Denna teknik kan också användas in vivo 18,22, eftersom APC visar liknande farmakokinetik som mAb själv. Typen målcellen kan anpassas med olika APC. Olika antikroppar eller antikroppsfragment, inklusive anti-EGFR, anti-PSMA, anti-mesotelin, och anti-CEA var redan används som APC 15-21. Dessutom kan ändra regionen NIR-bestrålning minimera regionen behandlas. Här, med kvantifiering av luciferasaktivitet och fluorescens på målceller, var fullständigt avskaffande av specifika celler bekräftas.

NIR-PIT är en ljus baserad terapi, alltså en kritisk punkt är than avståndet mellan NIR-ljuskällan och målet, eftersom ljusenergi och därför cellnekros minskning i enlighet med en invers-kvadratlagen (steg 3,4). För att göra 3D sfäroid exakt plattan bör behandlas och inkuberas så försiktigt som möjligt. Dropparna innehållande celler lätt förstörs eller falla bort av en liten chock före formning 3D-former.

NIR-PIT har flera unika fördelar. Först, NIR-PIT APCs demonstrerar liknande intravenösa farmakokinetiken till föräldra icke-konjugerade antikroppar, på grund av de hydrofila egenskaperna hos IR700, som leder till mycket specifik bindning till målceller och minimal icke-mål-ackumulering. Sålunda, även efter transplantation av vävnaden, kan NIR-PIT behandla målceller via intravenös injektion av APC följt av exponering av regionen av intresse för NIR. För det andra, kan NIR-ljus penetrerar mycket djupare in i vävnaden än UV- eller synligt ljus, därför kan NIR-PIT behandla inte bara ytan, utan även den entire tjockleken av den transplanterade vävnaden genom exponering för NIR vid ytan. Slutligen kan NIR-PIT användas upprepade gånger för att eliminera målceller utan begränsning. Denna metod är användbar när målceller uttrycker tillräckliga kopior av målmolekyler på cellytan 18.

Det finns dock några begränsningar för denna teknik. För det första är permeabiliteten hos APC begränsad, eftersom det är en stor molekyl. För att övervinna detta problem, upprepade NIR-PIT behandling eller antikroppsfragment kan utnyttjas 18,19,22. En annan begränsning är ljuspenetrering. Även om NIR-ljus kan väl tränga in vitro-kultur, översättning till behandling in vivo skulle kräva anpassade metoder såsom matsmältnings endoskopi, bronkoskopi, eller direkt thoracoscopy med fiberoptik för att flytta ljuskällan närmare målområdet.

Ytterligare anpassningar av NIR-PIT kommer att möjliggöra användning av denna metod i både lokala och specific cell eliminering inom många områden, såsom immunmodulering eller tumörmikromiljöer 24 - 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Denna forskning stöddes av Intramural forskningsprogram National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) HDP1096-8
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100
LED: L690-66-60 Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) L690-66-60
Vectibix (panitumumab) Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm Cellvis (Mountain View, CA, USA) D35-10-0-N

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, (7381), 295-305 (2012).
  2. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10, (6), 678-684 (2012).
  3. Birchall, M. A., Seifalian, A. M. Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation. Lancet. 6736, (14), 11-12 (2014).
  4. Ben-David, U., Benvenisty, N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat. Rev. Cancer. 11, (4), 268-277 (2011).
  5. Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 143, (4), 508-525 (2010).
  6. Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (35), 3281-3290 (2013).
  7. Miura, K., Okada, Y., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27, (8), 743-745 (2009).
  8. Tang, C., Lee, A. S., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat. Biotechnol. 29, (9), 829-834 (2011).
  9. Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nat. Med. 17, (12), 1685-1691 (2011).
  10. Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy. BMC Cancer. 12, (1), 345 (2012).
  11. Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging. Cancer Res. 72, (18), 4622-4628 (2012).
  12. Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET. J. Nucl. Med. 54, (5), 770-775 (2013).
  13. Sato, K., Watanabe, R., et al. Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Mol. Oncol. 8, (3), 620-632 (2014).
  14. Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Lett. 365, (1), 112-121 (2015).
  15. Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer. Mol. Cancer Ther. 14, (8), 141-150 (2014).
  16. Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PloS one. 9, (11), 113276 (2014).
  17. Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience. Theranostics. 5, (7), 698-709 (2015).
  18. Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine. RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).
  19. Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies. J. Nucl. Med. 56, (1), 140-144 (2014).
  20. Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model. Theranostics. 3, (6), 357-365 (2013).
  21. Shirasu, N., Yamada, H. Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy. Int J Cancer. 135, (11), 1-14 (2014).
  22. Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, (23), 19747-19758 (2015).
  23. Nakajima, T., Sato, K., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC cancer. 14, (1), 389 (2014).
  24. Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 7, (2), 131-142 (2008).
  25. Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 10, (2), 77-88 (2014).
  26. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 12, (4), 252-264 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics