Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Bioengineering

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Sato, K., Choyke, P. L., Hisataka, K. Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique. J. Vis. Exp. (109), e53633, doi:10.3791/53633 (2016).

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Abstract

Introduction

Die Beseitigung bestimmter Zellen, ohne dass andere Zellen zu schädigen ist extrem schwierig, vor allem in den etablierten Gewebe, und es besteht ein dringender Bedarf für eine Zelle Eliminationsverfahren im Tissue-Engineering-Bereich. Heute auf dem Gebiet der regenerativen Medizin, Gewebekulturen embryonale Stammzellen (ES), pluripotente Stammzellen (PSCs) oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) sind vielversprechende Materialien 1 unter Verwendung von - 3.

Obwohl diese Geweberegeneration vielversprechend ist, eine Kontamination mit unerwünschten Zellen ist ein wichtiges Anliegen. Darüber hinaus gibt es ein Sicherheitsproblem von tumorigenicity nach der Transplantation 4,5. Obwohl viele Studien zu diesen Themen konzentriert haben spezifische Zellen zu beseitigen, vor allem in der regenerativen Medizin 6 - 8, hat keine praktische Methode entwickelt worden.

Nah-Infrarot-photoimmunotherapy (NIR-PIT) ist eine Behandlung, basierend auf einem Antikörper-Photoabsorptions conjugate (APC). Eine APC besteht aus einem zellspezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) und einem Photoabsorptionsmittel, IR700. IR700 ist ein hydrophiles Derivat Siliciumdioxid-Phthalocyanin und nicht induziert Phototoxizität von selbst 9. IR700 ist kovalent an den Antikörper über Amidreste an der Seitenkette von Lysin-Moleküle konjugiert. Die APC bindet Zielmoleküle auf der Zellmembran und induziert dann fast sofort Zellnekrose nach Einwirkung von NIR-Licht bei 690 nm. Während der Einwirkung von NIR-Licht, die Zellmembran reißt , was zu Zelltod 9-14. NIR-PIT hat sich mit mehreren Antikörpern oder Antikörperfragmente , um wirksam zu sein, einschließlich anti-EGFR, anti-HER2, Anti-PSMA, anti-CD25, anti-Mesothelin, Anti-GPC3 und Anti-CEA 15-21. Daher NIR-PIT kann gegen eine Vielzahl von Zielmolekülen verwendet werden. Darüber hinaus ist NIR-PIT eine gut kontrollierte Behandlung, die durch die Einschränkung der NIR-ligh selektive Behandlung bestimmter Regionen erlaubtt Bestrahlung 18,22.

Hier stellen wir ein Verfahren zur spezifischen Zelleliminierung mittels NIR-PIT aus gemischten 3D-Kulturen.

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Protocol

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte spezifischen Zellen unter Verwendung von NIR-PIT zu beseitigen. Kontrollen und andere Details über NIR-PIT und die Lebensfähigkeit der Zellen kann an anderer Stelle 18 zu finden.

1. Konjugation von IR700 monoklonale Antikörper (mAb)

  1. Bereiten Sie mAb von Interesse bei 2-5 mg / ml in 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) Lösung.
  2. Mischungs 6,8 nmol von mAb mit 30,8 nmol von 10 mM IR700 in 0,1 M Na 2 HPO 4 -Lösung (pH 8,6) in einem Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren bei RT für 1 h, mit einer Aluminiumfolie abgedeckt.
  3. Waschen Sie die PD-10-Säule (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung) mit 15 ml PBS, zweimal. Legen Sie die Probe aus Schritt 1.2.
  4. Man reinige das Gemisch über den PD-10-Säule durch Elution PBS entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Hier wird die Elution entlang der Bandfarbe von IR700 war. Für eine 300 ul Probe Fraktion PBS Elution liegt typischerweise zwischen 2,5 ml bis 4,4 ml.
  5. Bestimmen dieProteinkonzentration mit Coomassie - Färbung durch die Absorption bei 595 nm mit einem Spektrophotometer 9 gemessen wird . Bestimmen Sie die Konzentration von IR700 mit Absorption bei 689 nm , die Anzahl der Fluorophormoleküle zu bestätigen , konjugiert an jedem mAb Molekül 9.
    Hinweis: Es ist wichtig, eine optimale Anzahl von conjugation IR700 Moleküle in 1 mAb mit einem Spektrophotometer bestimmt werden. Im Allgemeinen etwa 3 IR700 Moleküle in 1 mAb - Molekül ist optimal sowohl für in vitro und in vivo arbeiten. HPLC und SDS-PAGE-Methoden können verwendet werden, um zu bestätigen, ob der mAb und IR700 gebunden sind oder nicht.
  6. Lagerung bei 4 ° C nach der Proteinkonzentration zu bestimmen.

2. Herstellung von Misch 3D-Zellkultur (Mixed Sphäroid)

  1. Tragen Sie steriles Wasser (ca. 1 ml) in den Plattenbehälterabschnitt der Platten Tropfen hängen.
  2. Bereiten Sie verschiedene Verhältnisse der Zelltypen von Interesse - A431-luc-GFP-Zellen und 3T3-RFP-Zellen -mit jeder Probe, die 5000 Zellen insgesamt, in 50 ul Kulturmedium suspendiert.
    Anmerkung: Bereiten 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100 etc. Verhältnisse von Zelltypen von Interesse in Kulturmedien je nach Zelltyp.
  3. Inkubieren der Mischung für 5-7 Tage in 96-Well-Fallplatte bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator hängt. Ändern Sie die Kulturmedien alle 2 Tage. Hinweis: Um die 3D-spheroid präzise, ​​handhaben die Platte sanft, als Tropfen machen die Zellen enthalten, fallen leicht vor 3D-Formen zu bilden.
  4. Achten Sie auf die Morphologie und die Größe der Sphäroiden eines invertierten Hell- Mikroskop bei 10X - 40-facher Vergrößerung. Hinweis: Obwohl es von Zelltypen und der Größe des hängenden Tropfen abhängig ist, sicherzustellen, dass der Durchmesser des Sphäroids herum ist 400-600 & mgr; m nach 7 Tagen Inkubation in der 96-Well-Platte hängenden Tropfens.

3. In - vitro - NIR-PIT für 3D gemischten Zellkultur

  1. Ändern Sie die Medien des harn de Tropfenplatten 10 ug / ml Antikörper-Konjugat Photoabsorptionsmittel (APC) enthaltenden Medium und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid für 6 Stunden inkubiert.
  2. Nach 6-stündiger Inkubation, waschen Sie die Sphäroid zweimal mit frischem Kulturmedien (Phenolrot frei). übertragen Sie vorsichtig die Sphäroid mit einem Glasboden-50-mm-Schale mit 100 & mgr; l frisch Phenolrot freien Kulturmedien mit einer sterilen 200 ul Pipettenspitze mit der Spitze abgeschnitten. Legen Sie ein Sphäroid in jedem Gericht.
  3. Beachten Sie die Sphäroid mit einem invertierten Hellfeldmikroskop die Änderung der Morphologie zu erkennen. Zur Beobachtung der optischen Reporter (zB GFP und RFP) verwenden Fluoreszenzmikroskop mit folgenden Filtereinstellungen: GFP - 469 nm Anregungsfilter und 525 nm Emissionsfilter; RFP - 559 nm Anregungsfilter und 630 nm Emissionsfilter.
  4. Setzen Sie die Leuchtdiode (LED) über dem Glasbodenschale für die Bestrahlung.
    Hinweis: Sphäroide können NIR ausgesetzt werdenLicht entweder auf dem Mikroskop oder in der laminaren Abzugshaube.
    1. Messen Sie die Leistungsdichte des NIR-Licht mit einem optischen Leistungsmesser 9. Gemäß dieser Messung bestrahlen NIR-Licht über Leuchtdioden (LEDs) , welche Licht emittieren bei Wellenlängen von 670 bis 710 nm bei 2 J / cm 2.
      Hinweis: LED-Licht kann eine maximale Tiefe von etwa 5 Zoll eindringen. Zytotoxischen Wirkungen von NIR-PIT abhängig ist nur auf bestimmten Energie unabhängig von der Leistungsdichte und Dauer der Exposition 23.
  5. Nach der Bestrahlung übertragen das Sphäroid in eine neue hängenden Tropfens Platte mit 50 ul frischem Kulturmedien und für 1 Tag in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid inkubiert.
  6. übertragen Sie vorsichtig die Sphäroid auf einem Glasbodenschale mit 100 ml frisches Kulturmedien (Phenolrot frei) mit einer sterilen 200 ul Pipettenspitze mit der Spitze abgeschnitten werden. Beachten Sie die Sphäroid mit einem Fluoreszenzmikroskop 1 Tag nach NIR-PIT mit fiFiltereinstellungen in Schritt 3.3 beschrieben.
    1. Erkennen toten Zellen Propidiumiodid auf das Medium in einer Endkonzentration von 2 & mgr; g / ml, oder durch den Verlust von cytoplasmatischen GFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop (2B) durch Zugabe 14,18,22.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,6 wenn Zielzellen nicht vollständig eliminiert.

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Representative Results

Um optisch die Wirkung von NIR-PIT überwachen, die A431-Zelllinie, die EGFR überexprimiert wurde genetisch modifiziert, um auch GFP und Luciferase (A431-luc-GFP) exprimieren. Als Nicht-Ziel von NIR-PIT wurde die Balb / 3T3-Zelllinie optisch modifiziert RFP (3T3-RFP) zum Ausdruck bringen. Die APC, Panitumumab-IR700 (pan-IR700), synthetisiert. Misch Sphäroide, die aus verschiedenen Verhältnissen von Zellen (A431-luc-GFP und 3T3-RFP) zusammengesetzt wurden , wurden gemäß diesem Protokoll (Figur 1) hergestellt. Wiederholte NIR-PIT wurde mit der Inkubation von pan-IR700 (siehe Schema in 2A) durchgeführt. Zielzellelimination aus dieser gemischten 3D - Kultur wurde mit Fluoreszenz und Luciferase - Aktivitäten (2B, C) ​​erreicht und überwacht. Auf der anderen Seite weiterhin Nicht-Zielzellen zu wachsen.

Abbildung 1
16 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Figur 2. Zielzellelimination in 3D - Zell Sphäroide (mixed Sphäroide von A431-luc-GFP und 3T3-RFP - Zellen). (A) NIR-PIT (2 J / cm 2) Schema gezeigt. (B) Wiederholte NIR-PIT vollständig eliminiert Zielzellen (A431-luc-GFP) ohne Schaden für Nicht-Zielzellen (3T3-RFP), in einem gemischten 3D Sphäroid. Bar = 200 & mgr; m. (C) Quantifizierung der Luciferase - Aktivitäten (RLE - Verhältnis)zeigte vollständige Beseitigung von Zielzellen (n = 10 Sphäroide in jeder Gruppe). Diese Zahl wurde von 18 geändert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Wir veranschaulichen ein Verfahren zur spezifischen Zellelimination aus einer gemischten 3D-Zellkultur ohne Schaden an Nicht-Zielzellen durch NIR-PIT verwenden. Bisher gibt es keine praktische Methode der Zellelimination, wenn das Gewebe hergestellt wird oder nach der Transplantation. So NIR-PIT ist eine vielversprechende Methode, dies zu erreichen. Diese Technik könnte auch in vivo 18,22 verwendet werden, da APCs eine ähnliche Pharmakokinetik wie mAb selbst zeigen. Die Zielzelltyp kann mit verschiedenen APC angepasst werden. Verschiedenen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, einschließlich anti-EGFR, anti-PSMA, Anti-Mesothelin - und Anti-CEA wurden bereits als APCs verwendet , 15-21. Zusätzlich kann der Bereich der NIR-Bestrahlung ändert minimieren die behandelte Region. Hier mit Quantifizierung der Luciferase-Aktivität und Fluoreszenz auf Zielzellen, die vollständige Beseitigung von spezifischen Zellen wurde bestätigt.

NIR-PIT ist eine leichte Therapie, damit ein kritischer Punkt ist ter Abstand zwischen der NIR-Lichtquelle und dem Ziel, da die Lichtenergie und damit Verringerung Zellnekrosen gemäß einer inversen Quadratgesetz (Schritt 3.4). Um die 3D genau Sphäroid, sollte die Platte behandelt und so schonend wie möglich inkubiert werden. Die Tropfen enthaltenden Zellen werden leicht zerstört oder durch einen kleinen Schock fallen, bevor 3D-Formen zu bilden.

NIR-PIT verfügt über mehrere einzigartige Vorteile. Zuerst NIR-PIT APCs zeigen ähnliche intravenöse Pharmakokinetik parentalen nicht-konjugierten Antikörper, wegen der hydrophilen Eigenschaften von IR700, die Bindung an Zielzellen und Nichtziel minimal Akkumulation zu hochspezifischen führen. Somit kann, selbst nach der Transplantation des Gewebes, NIR-PIT können Zielzellen durch intravenöse Injektion der durch Belichtung der Region von Interesse NIR gefolgt APC behandeln. Zweitens NIR-Licht viel tiefer in das Gewebe als UV- oder sichtbares Licht durchdringen kann daher NIR-PIT konnte nicht nur an der Oberfläche zu behandeln, sondern auch die entire Dicke des transplantierten Gewebes durch Belichtung an der Oberfläche NIR. Schließlich können NIR-PIT wiederholt Zielzellen verwendet werden, ohne Beschränkung zu beseitigen. Dieses Verfahren ist nützlich , wenn die Zielzellen ausreichend Kopien von Zielmolekülen auf der Zelloberfläche 18 auszudrücken.

Es gibt jedoch einige Einschränkungen dieser Technik. Zunächst wird die Durchlässigkeit der APC begrenzt, da es sich um ein großes Molekül ist. Um dieses Problem zu überwinden, wiederholt NIR-PIT Behandlung oder Antikörperfragmente 18,19,22 ausgenutzt werden kann. Eine weitere Einschränkung ist das Eindringen von Licht. Obwohl das NIR-Licht kann in vitro Kultur, Übersetzung in vivo Behandlung richtig durchdringen würde angepasst Ansätze erfordern , wie beispielsweise Magen - Endoskopie, Bronchoskopie, oder direkte Thorakoskopie mit Faseroptik , die Lichtquelle näher an dem Zielbereich zu bewegen.

Weitere Anpassungen der NIR-PIT wird sowohl für die Anwendung dieser Methode erlauben lokale und specific Zellelimination in vielen Bereichen, wie beispielsweise Immunmodulation oder Tumor - Mikroumgebung 24-26.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde von der Intramural Research Program der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Zentrum für Krebsforschung unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) HDP1096-8
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100
LED: L690-66-60 Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) L690-66-60
Vectibix (panitumumab) Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm Cellvis (Mountain View, CA, USA) D35-10-0-N

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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