효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota
Published 1/25/2016
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Immunology and Infection

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Benck, C. J., Martinov, T., Fife, B. T., Chatterjea, D. Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation. J. Vis. Exp. (107), e53638, doi:10.3791/53638 (2016).

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Abstract

Introduction

접촉 성 피부염, 습진, 건선, 봉와직염, 비 흑색 종 피부암에 곰팡이 감염 및 농양에 이르기까지 피부 상태는 전세계 50 가장 널리 퍼진 질병들로 발견되었고 2010 1 치명적 질병의 네 번째 선도적 인 글로벌 원인. 따라서, 다양한 피부 병변을 기본 분자 및 세포 메커니즘의 조사 연구에 필요한 활성 영역입니다. 설치류 모델은 아토피 성 피부염 (2), (3), 건선, 또는 포도상 구균 감염 4 같은 염증성 피부 질환의 이해에 도움이 현저하게되어왔다. 마우스 피부 조직의 효소 적 소화, 저렴하고 효율적이며 간단한 프로토콜 나은 피부 질환의 병태 생리를 이해 하류 다양한 용도에 사용할 수있는 세포의 제제를 제공 할 수있다. 여기서, 간단하고 경제적 인 방법은 마우스 피부 효소에 대해 기재되어 다이제스트조직 및 세포 배양, 생체 대체 전송에 사용할 수있는 피부 침투 백혈구의 분리, 유세포 분석 및 분류 또는 유전자 발현 연구를 흐른다. 이 절차의 목적은 통상적으로 전체적인 맞춤 시약 키트 및 기계적 dissociators와 연관된 비용을 최소화하면서 높은 세포 생존율과 피부 백혈구 침윤의 단일 세포 현탁액을 제조하는 공정이다.

기존의 피부 조직 해리 방법 5-7 낮은 세포 생존 및 표면 마커의 무결성 결과, 또는 사용자 정의 효소 키트와 고가의 조직 해리 기계 8-11 필요할 수 있습니다. 마우스 귀 피부 조직의 소화가 합리적으로, 12 ~ 13 유행 높은 각화 피부 조직을 소화하는 동안 (예를 들면 측면에서) 비 세포 파편 많은 양의 오염 된 세포 준비가 발생할 수 있습니다. 최근의 연구에서, 자이드와 동료가 2.5 mg을 90 분 동안 마우스 측면 피부를 소화 / ㎖ 디스 파제, FOLLO3 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 (7)에 의해 45 분 결혼. 또 다른 연구에서, 이들 연구자들은 트립신 / EDTA, 콜라겐 III의 사용을 포함하는, 2.5 시간의 조합으로 여러 소화 배양을 사용하고, (5) 디스 파제. 다른 제조업체의 트립신으로 처리 잴 포유 동물 세포에서 14-15 세포 표면 단백질의 무결성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 트립신의 사용은 피부 효소 소화에 권장되지 않는다. 또한, 디스 파제는 CD4 및 CD8α T 세포의 증식 능력에 심각한 영향을 미칠 수 및 CD62L (16)와 같은 일반적인 T 세포 활성화 마커를 포함, 최소 20 분자의 표면 풍요 로움에 영향을 미칩니다. 다른 프로토콜은 소화 매체 (6)에 RPMI 1640을 사용합니다. 그러나, RPMI에 Mg2 +, Ca2 + 등의 존재는 광범위한 세포 응집 (17)가 발생할 수있다.

조직 분리를위한 이상적인 프로토콜은 높은 세포 생존 능력, 낮은 목표로한다세포 응집, 최소한의 손상의 수준은 표면 단백질을 세포합니다. 고품질 림프절 간질 세포 제제는 짧은 효소 배양, 칼슘 및 마그네슘이없는 배지 2+ 프로토콜을 사용하여 수행하고, 트립신을 피하고 18 디스 파제되었다. 그러나, 이러한 유형의 프로토콜은 전체 마우스 피부의 해리에 대해 확립되지 않았다.

여기에서, 프로토콜은, 해리 분리 및 알레르겐 - 도전 마우스 옆구리 피부에서 피부 백혈구 침윤을 풍부하게 기재되어있다. 간략하게, 절제된 피부 소화 조직을 연화 초과 각질이나 지방 조직을 제거하기 위해 1 시간 동안 10 % 소 태아 혈청 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)로 미리 배양된다. 이것은 0.7 mg을 함께 30 분간 효소 분해 단계 뒤에 / ㎖의 콜라게나 D. 콜라게나 D 그것을 만드는 최소 세포 표면 마커의 농도에 대한 영향, 및 시험관 (16, 18)에서 T 세포 증식에는 영향을주지표면 단백질의 특성을 포함하는 애플리케이션에 매우 적합하다. 효소 분해 후, 불연속 밀도 구배 원심 분리는 단일 세포 현탁액으로부터 상피 세포 및 잔해를 제거하고, 조혈 세포 농축 하였다. 중요한 것은,이 절차는 비싼 열 기반 자기 세포 분리 시약 및 티슈 기계 8-11 해리를 방지하고 기본 생의학 연구소에 위치한 재료 및 장비로 수행 될 수있다. 여기에서이 프로토콜 (19 각색) 이전에 감응 ND4 스위스 쥐 합텐 옥사 졸론 (황소)와 측면 피부에서 도전 세번 백혈구를 분리하는데 사용 하였다. 세포는 파라 메트릭 멀티 - 유동 세포 계측법을 사용하여 분석 하였다. 이 기술은 최소한의 파편과 계측법 영향 SK에 T 림프구와 호중구의 침윤을 측정하기 위해 파라 메트릭 다중 흐름으로 분석 하였다 격리 림프구의> 95 %의 생존율을 가진 세포 현탁액을 수득에서.

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Protocol

주 : 통상적으로 음식과 물을 무료로 이용할 수와 보관 8~12주 세 여자 ND4 스위스 웹스터 마우스는, 이러한 연구에 사용 하였다 (B13S1)에 사용되는 실험 프로토콜은 매 켈리 스터 대학교의 IACUC에 의해 승인되었다..

옥사 졸론 1. 과민성 및 도전

  1. 날 0
    1. 4 L 뚜껑 유리 항아리의 하단에 메쉬 아래에 배치 흡수성 수건에 3 ㎖ 이소 플루 란을 추가하여 마취 챔버를 준비합니다. 피사체가 충분히 마취 때까지 여기에서 사용 ND4 암컷 마우스를 들어, 챔버 내의 시간은 30 ~ 60 초이고; 마우스 변형이 사용을위한 마취 관리를 최적화 할 수 있습니다.
    2. 각 마취 마우스의 뒷면을 면도하고 동물 머리 트리머를 사용하여 측면에.
  2. 1 일
    1. 무수 에탄올로 -4-에 톡시 -2- 페닐 -2- 옥사 졸린 -5- 온 (옥스)의 2 % 용액을 제조하고, 인큐베이터에서 회전판에 15 분 동안 50 ℃에서 배양한다.
    2. 간단히 마취1.1.1에서 설명하고 약 20 μL 각의 여러 직렬 응용 프로그램에서 다시 면도 2 % 황소의 100 μl를 적용 할 이소 플루 란 마취를 사용하여 마우스. 건조 할 수있는 솔루션을 직렬 응용 프로그램 사이에 5 ~ 10 초를 기다립니다.
    3. 다시 이외의 지역에 2 % 황소 솔루션을 유출 방지 및 응용 프로그램 사이에 건조 할 수있는 솔루션을 기다려야주의하십시오.
  3. 일 5-7
    1. 절대 에탄올 (황소)의 1 % 용액을 제조하고, 인큐베이터에서 회전판에 15 분 동안 50 ℃에서 배양한다.
    2. 부드럽지만 확실히 위를 향하도록 복부와 목, 꼬리베이스의 목덜미에 마우스를 고정하고 목은 약간 (복강 내 주사에 대한 파악과 유사) 아래로 기울어 여러 직렬 응용 프로그램에서 면도 측면에 1 % 황소의 100 μl를 적용 상술 한 바와 같이 시간을 복용 후 피부를 건조.
    3. 대조군 마우스를 들어, 면도 플랜에 무수 에탄올 차량의 100 μL를 적용케이.

2. 옆구리 피부 수확

  1. 이산화탄소 흡입을 사용하여 쥐를 안락사, 조심스럽게 10cm 수술 용 가위로 측면 피부 (~ 피부의 25mm X 25mm)의 원하는 영역을 절제.
  2. 깨끗한, 날카로운 칼날을 사용하여 수술, 플랭크 피부에서 과다 지방 및 결합 조직을 얻어 긁어.
  3. 칼슘 또는 마그네슘, 5mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA),없이, 페놀 레드 10 ㎖ RT HBSS를 [함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 3 마우스의 옆구리 피부의 3 개 배치 된 10 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)].

3. 사전 소화 조직 세탁기

  1. 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 피부 절편을 함유하는 장소 튜브.
  2. 인큐베이션 기간의 끝에서 10 초 동안 격렬하게 소용돌이.
  3. 70 μm의 통하여 튜브의 내용을 변형여과기는 세척 버퍼를 무시하고 조직을 수집합니다. 단일 여과기는 생물 처리 그룹 내 전체 과정에 걸쳐 재사용 할 수있다.
  4. 집게의 쌍을 사용하여, (전술 한 바와 같이 EDTA, HEPES, 및 FBS 함유) 신선 RT HBSS 매체 10 ㎖를 함유하는 새로운 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 여과기에서 플랭크 피부 옮긴다.
  5. 조직 조각이 평균 면적의 약 2.2 mm X 2.2 mm가되도록 튜브 내로 침지 외과 해부 위 12.5 cm 쌍과, 플랭크 피부의 각 부분을 말하다.
  6. 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 피부 절편을 함유하는 장소 튜브.
  7. 배양의 마지막에 10 초 동안 격렬하게 소용돌이

피부 4. 콜라게나 소화

  1. , 70 ㎛의 여과기를 통하여 튜브의 내용물을 걸러 모아 새로운 50 ml를 함유하는 원뿔형 튜브에 10 ㎖ FRE 플랭크 피부 편을 전송할SH, RT HBSS 미디어가 0.7 mg을 보충 / 디를 콜라게나 ㎖로
  2. 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 소화 매체 피부 절편을 함유하는 장소 튜브.
  3. 배양의 말에 적극적으로 10 초 동안 튜브의 소용돌이 내용.
  4. 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 70 μm의 여과기를 통해 튜브의 필터 내용; 소화 조직을 함유하는 관류를 유지하고 스트레이너 버리고 피부 파편의 측면.
  5. 350g에서 5 분간 HBSS 매체 원심 50ml에 플로우 스루를 세척하고 상등액을 가만히 따르다.

5. 밀도 구배 원심 분리

  1. 혈청 피펫을 사용하여, 각각의 샘플에 대한 새로운 15ml의 원뿔형 튜브로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 3 ㎖ RT 67 % 밀도 구배 원심 분리 배지를 추가한다.
  2. 페놀 레드와 HBSS에 5 ml의 RT 44 % 밀도 기울기 원심 분리 미디어 세포 펠렛을 Resuspend.
  3. 신사LY 층 혈청 피펫을 사용하여 67 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 샘플의 상부에 세포를 포함하는 44 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 5 ㎖. 가장 느린 속도에 피펫을 설정하고, 원뿔 튜브의 벽을 따라 피펫을 배치해야합니다. , 동요하지 않도록주의 중단, 또는 기울기를 반전.
  4. 가장 낮은 설정으로 설정 가속, 원심 분리기 균형있는 것을 확인하고, 실온에서 20 분 동안 931 XG에 그라데이션을 브레이크를 해제하고, 원심 분리기.
  5. 원심 분리 후, 조심스럽게 원심 분리기에서 그라디언트를 제거하고 부드럽게 똑바로 튜브를 들고 실험실 벤치에 운반 할 것. 5 ㎖ 플라스틱 전달 피펫을 사용하여, 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 44 % 및 67 %의 밀도 구배 원심 분리 및 전송 매체의 계면에 전지 층을 제거한다. 인터페이스가 표시되지 않는 경우, 단순히 67 % -44 %의 경계에서 액체의 약 2 mL를 제거합니다.
  6. INTE으로부터 세포를 함유하는 원뿔형 튜브를 채우기2 % 1X 빙냉 PBS에서 FBS, 350 XG에서 5 분 동안 원심 분리 세포 및 상등액을 가만히 따르다와 rface.
    주 : 소화 단계가 37 ℃이며, 밀도 구배 원심 분리 배지를 RT 단계에 있기 때문에 이것은 세포가 냉각 될 수 있음은 처음 / 감기 있었다. 셀 (1)에 재현 탁 될 수있다 : 1 트리 판 블루 희석 수 및 생존력 정보이 시점에서 얻을 수있다.

6. 차단 및 염색 유세포 분석

  1. 블록 FcγRII / 비특이적 항체 염색을 방지하기 위해 세포상의 수용체 III. 접합 결합하는 CD16 / 32 (2.4G2)에 대한 항체와 블록 FcγRII / III 수용체의 100 희석 : 여기에 설명 된 실험을 위해, 1을 포함하는 2 % FBS와 PBS에 항체 마스터 믹스를 확인합니다.
  2. CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b를 (M1 / 70)의 CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 (대한 항체의 적절한 마스터 믹스와 차단 된 세포를 품어 30-F11) CD45R(RA3-6B2), CD62L는 (MEL-14), 및 LY-6G / LY-6C (GR-1) (RB6-8C5)뿐만 아니라 화려한 바이올렛 (510) 라이브 / 죽은 얼룩은 죽은 세포를 식별합니다. 희석 제조업체에서 권장하거나 이전에 연구자들에 의해 최적화 된 모든 항체를 사용합니다. (100) 희석 : 여기에 설명 된 실험을 위해, (1) 모든 항체를 사용합니다.
  3. 2 % FBS와 50 μL 1X PBS 염색 버퍼에 세포에 resuspend을 씻으십시오. 형광 데이터는 유세포에 취득 될 때까지 얼음 상에 유지한다.
    주 : 보정 파라미터 형광 데이터의 취득 전에 림프 조직 및 (CD4 또는 CD8과 같은) 공통의 세포 표면 항원에 미리 최적화하는 것이 중요하다.
  4. 분석 계측법 하류 흐름 세포의 수를 증가 염색 된 세포의 전체 샘플들로부터 데이터를 수집한다.

7. 다음과 같은 단계를 수행하는 표준 방법을 사용하여 유동 세포 계측법 데이터 분석

  1. 앞으로 분산의 림프구 지역에 우선, 게이트측면 산란 (지역) 음모에 의해 (지역).
  2. 그런 다음, 이중선을 분석 방지하기 위해 측면 분산 (폭)에 의해 전방 산란 (폭)를 사용하여 하나의 셀을 선택합니다. 이것은 또한 사이드 산란 플롯에 의해 가로 전방 산란 높이로 달성 될 수있다.
  3. 이어서, 혈통 게이트 (는 CD11b, CD11c 양성 및 CD45R / B220) -negative 및 CD3 양성 이벤트 제외하는 대 식세포, 수지상 세포와 B 세포를 각각과 목표인지를 한정은 T 세포 구획 분석 이 여기로, T 세포에 침투 평가한다.
  4. 다음, 라이브 / 죽은 얼룩을 제외 살아있는 세포에 문입니다.
  5. 마지막으로, 관심의 세포 인구에 게이트 (대표 결과 섹션 참조).

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Representative Results

콜라게나 D 미디어 처리 대조군과 비교시 비장 세포는 T 세포상의 CD4 및 CD8 α 비슷한 수준의 치료를 보여
먼저, T 세포의 서브 세트에 리니지 및 활성화 마커의 주파수 및 풍부 표면에 콜라게나 D의 잠재적 효과는 대조군으로 차 림프 조직을 사용하여 평가 하였다. 비장 세포 현탁액 ND4 마우스로부터 얻어진 HBSS 미디어와 함께 1 시간 동안 세척 하였다. (위의 섹션 4에 기술 된 바와 같이) 다음에, 반 세포 / ㎖의 콜라게나 D 0.7 mg의 실시. 잔여 세포를 HBSS 제어 매질에 재현 탁 하였다. 이어서, 비장 세포 모두 분획 섹션 5에서 전술 한 바와 같이 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 처리 하였다. 이어서 세포 표면 CD4 및 CD8α에 대한 항체로 염색하고 유동 세포 계수기에서 분석 하였다. 싱글, 살고, CD45 +, 비 T 계보 - (B220 - CD11b를 -중 CD11c는 -), CD3ɛ + 세포는 B 세포, 대 식세포, 수지상 세포를 제외, 분석을 위해 문이되었다. 세포와 30 % CD4 - - CD4 및 CD8α 단백질은 동일하게 개발 소화 콜라의 대상이되었던 그이 약 60 % CD4 + CD8α과 효소에 노출되지 않은 비장 세포의 표면에서 발견 된 CD8α + 세포 중 하나를 처리 검출 ( 도 1a). 따라서, 콜라게나 D 다이제스트는 CD4 및 CD8α의 상대적인 주파수에 영향을 미치지 않았다. 이 부분 집합에 표면 CD4 및 CD8α 기하 평균 형광 단위 (gMFI)의 강도는 두 치료 사이에 차이가 없었다; CD4에 대한 gMFI 값은 제어 비장 세포에 대한 효소 처리 및 2243 각각에 대해 2271을했고, CD8α에 대한 gMFI 값은 536이었다 효소 처리 및 제어 비장 세포에 대한 (520). 효소 처리는 T 세포 활성화의 표면 밀도에 영향 C 마커 없었다CD4 + T 세포 (그림 1B)에 D44 또는 CD62L. CD44에 대한 기하 평균 형광 강도 값이 669이었다위한 제어 비장위한 효소 처리하고, 654; CD62L에 대한 gMFI 값에 대해 1523했다 제어 비장 세포에 대한 효소 처리 및 1517. 콜라게나 제 소화 D가 분리 된 세포의 표면 단백질의 무결성을 보존 된 바와 같이, 여기에 설명 된 프로토콜을 하류 유동 세포 계측법 분석 용 안심하고 사용할 수있다.

효소 소화와 높은 세포 생존율 플랭크 피부 세포 결과 구배 정제
상기에서 얻은 세포 현탁액의 세포 퍼센트 수율 및 생존력은 트립 판 블루 염색 배제 (20)를 사용하여 평가 하였다. 이 소화 및 그라데이션 분리 프로토콜은 황소 도전 생쥐의 측면 조직의 mm 2 당 약 250 가능한 면역 세포 및 차량 도전 생쥐에서 조직의 mm 2 당 약 4 가능한 면역 세포를 산출그 이전에 황소 (표 1)에 민감했다.

효소 소화와 면역 세포의 강력한 회복 측면의 피부 세포 결과의 그라데이션 정화
다음에, 피부 면역 침윤의 정도는 황소 도전 여기에 기술 된 방법을 사용하여 피부 침투 면역 세포의 회복을 평가 대조군 마우스의 측면으로부터 분리 된 세포에서 CD45 표면 단백질 풍부 분석에 의해 결정 하였다. CD45는 팬 조혈 계통 마커 (21)이다. 앞으로 저와 사이드 분산, 단일 세포의 95 % 황소 도전 마우스 (도시하지 게이팅)과 차량 도전 컨트롤에서 이러한 세포의 71 %는 라이브 CD45 + 세포 (그림 2)이었다. 침윤 CD45 + 세포에서 면역 ~ 67 배 증가가 본원에 기재된 방법 (표 1)을 사용하여 3 일 황소 과제를 다음 플랭크 피부에서 검출되었다.

세 가지 측면의 황소 문제는 T 세포와 호중구의 발음 침투 결과
우리의 기술은 GR-1 + 22 호중구, CD4 T 세포 및 CD8α T 세포로서 골수 및 림프 세포 아형의 다양성을 검출하는데 사용될 수있는 측면 피부에서 세포 집단을 수득 하였다. 우리는 7 배 ~ 6 배, ~을 관찰하고, 호중구 ~ 73 배 증가, CD4 T 세포 및 T 세포 CD8α 각각 3 일간 황소 과제 (표 1) 다음. 우리가 얻어진 생존 세포의 수를 곱함으로써 계산이 증가 유세포 분석 중에 생세포 게이트로부터 주어진 면역 세포 단편의 퍼센트 (트립 판 블루 배제를 이용하여 계산). 우리는 우리에게주고, 차량 제어 쥐에 대한 상응하는 숫자로 황소 처리 된 마우스에서의 면역 가능한 총 셀의 개수, GR-1 +, CD4 + 또는 CD8α + 세포를 분할림프구의 부분 집합의 증가를 접습니다. CD11b를 - - 중 CD11c - 황소 처리 된 생쥐의 세포와 EtOH로 처리 한 쥐에서이 인구의 10 % GR-1 + 호중구 싱글, 라이브 CD45 + B220의 42 %를 차지 (그림 2B). 옥스 - 처리 된 마우스에서, ~ 게이트 된 CD3 + T 세포의 52 %는 CD8α + 및 ~이었다 34 %이었다 CD4 +, 차량 제어에, ~ T 세포의 9 %가 CD8α +이었고 57 %이었던 반면 CD4 + (도 2C) . 여기에 설명 된 기술에 따라서, 알레르기 성 및 비 - 알레르기 성 피부 플랭크는 면역 세포 침윤을 서브 세트의 고해상도 유세포 특성에 적합한 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 처리 될 수있다.

마우스 측면 피부의 세포 부분 집합 황소 / 황소 (3) 황소 / EtOH를 (3) 확장을 접어 (황소 / Ethanol)
MM 2 조직 당
세포의 총 수 262.7 5.3 49.3
CD45 + 면역 세포 250.7 3.8 66.7
CD4 + CD8 - 세포 6.5 0.9 7.2
CD4 - CD8 + 세포는 10.6 0.1 72.9
호중구 8.6 1.5 5.6

표 ND4 여성 쥐에서 알레르기 성 측면 피부 1. 세포 수율. 플랭크 피부로부터 분리 가능한 세포는 TIS 당 풀링 세포 격리 피부 영역과 마우스의 수에 기초하여 / mm 2 조직을 트립 판 블루 배제를 이용하여 계수하고, 정규화 된준비를 고소. 우리는 계통 특정 표면 마커에 기초하여 조혈 세포 표면 항원 CD45, 및 림프구 서브 세트 수율의 검출에 기초하여 총 면역 세포의 수율을 계산 하였다. 우리는 우리가 림프구 아형의 증가를 접어주는 차량 제어 쥐 황소 번호로 처리 된 마우스에서의 셀의 수를 분할. 도시 된 데이터 처리 2-3 마우스로부터 풀링 된 데이터를 나타내고, 두개의 독립된 실험의 대표 값이다.

그림 1
비장 세포도 1 효소 절단 및 구배 정제 림프구 서브 세트와 세포 활성화 마커를 보존. 비장 세포는 콜라게나 D 또는 HBSS 매체 단독 파편과 적혈구를 제거하는 밀도 구배를 사용하여 정제하여 두 배양 HBSS 매체와 함께 1 시간 동안 세척 하였다. T 세포 (B220,는 CD11b, CD11c 양성), CD45 +, 실시간으로 확인 하였다 리니지 <SUP> -, 및 CD3ɛ +. CD4 및 CD8α T 세포의 주파수 효소 소화 (A) 후 변경되지 않았습니다. CD4 + T 세포상의 CD44과 CD62L의 표면 밀도는 소화 효소 (B) 다음 변하지 않았다. 표시된 데이터는 하나의 실험에서 치료 2-3 마우스에서 데이터를 풀링 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 효소의 소화와 피부 세포의 그라데이션 정화는 알레르겐 도전 마우스 측면 피부 대 제어에 별개의 면역 침투를 알 수있다. 세 가지 측면 황소 문제 이전에 민감 ND4 스위스 마우스의 피부 침투 면역 세포 (에 ~ 67 배 증가를 생산 A). 세 황소 문제는 잠GR-1 + 호중구 (B)에서 ~ 6 배 증가 oked 및 ~ 73- 및 CD8α + 및 CD4 + T 세포를 각각 (C)의 ~ 7 배 증가. 라이브 CD45 + 면역 세포는 단일 앞으로 낮은 측 분산 세포에서 문이있다; CD11b를 - - 중 CD11c - B220에서 게이트 호중구 및 T 세포 살아있는 단일 세포. 밀도 구배 분리 한 다음 트리 판 블루 희석 : 카운트가 1을 사용하여 수행 하였다. 표시된 데이터는 각 치료 그룹에 2-3 마우스에서 데이터를 풀링, 2 개의 독립적 인 실험의 대표 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이러한 아토피 성 피부염이나 건선과 같은 피부 질환의 설치류 모델에서 피부에 상주하는 백혈구의 변화를 특성화하는 염증 세포의 유입과 질병 병리 사이의 기계적 연결을 이해하는데 중요하다. 여기에서 우리는 대부분의 생물 의학 연구 실험실에서 발견되는 기본 장비로 피부 조직에서 백혈구를 분리하는 경제적 인 방법을 설명합니다. 이 상대적으로 빠른 기술은 실험실 벤치에서 시간에 손을-최소화하면서 자원을 보존하는 데 도움 비싼 조직 해리 기계 및 사용자 정의 튜브 및 시약의 사용을 방지 할 수 있습니다. 부드러운 효소 소화 및 불연속 구배 분리는 상피 세포와 파편, 및 분리 된 세포의 대부분은 유세포 분석, 세포 분류, 전송, 세포 배양 물 및 생체 외 자극 분석법에 포함 하류 다양한 용도에 사용될 수 제거. 콜라게나 제 효소와 D 다이제스트 T 세포 표면 마커 무결성 및 preser에 영향을주지VES의 세포 생존. 이 프로토콜은 쉽게 측면 이외의 영역들로부터 피부를 처리하기 위해 수정 될 수있다.

피부를 수확하는 동안이 과정에서 가장 중요한 단계는 1) 철저하게 지방과 결합 조직을 제거, 2) 취급 및 처리 조직을 빠른 속도로 조심스럽게), 세포 사멸을 최소화 3) 부드럽게 그라데이션을 적층하는 동안 세포 수율을 침투 극대화하고, 4 구배의 인터페이스를 추출하는 단계를 포함한다. 큰 규모의 실험을 시작하기 전에 그 밀도 구배 원심 분리 배지 레이어링 및 인터페이스의 삭제를 연습하는 것이 중요하다. 하나는 볼과의 계면을 추출하기 훨씬 쉽다 1X PBS 염색 버퍼로 70 ㎛의 여과기를 통하여 전체 뮤린 비장을 분쇄 및 5 단계에서 전술 한 바와 같은 농도 구배를 수행하여 불연속 밀도 구배에서 수확 세포를 연습 할 44 % 밀도 구배 원심 분리 배지와 SP를 이용한 67 % 밀도 구배 원심 분리 배지본 의한 면역 세포의 수가 많기 lenocytes.

밀도 구배로 작업 할 때, 거품 동안 피펫을 피해야한다, 및 그라데이션 중단은 최소화되어야한다. 그라디언트를 포함하는 원뿔 튜브 부드럽게 처리하고 항상 수직으로 유지해야합니다. 밀도 구배 원심 분리 미디어 솔루션이 항상 RT에 있어야 신중 해제 브레이크 낮은 가속도로 설정 가능한 느린 방출 속도 RT 유지 원심 분리기로 설정하고, 혈청 피펫은 방적 전에 균형. 침투 백혈구의 작은 숫자를 산출 피부 준비 작업 할 때, 세포는 항상 그라데이션 인터페이스에 표시되지 않습니다. 따라서, 인터페이스를 쉽게 세포의 층이 식별 될 수없는 경우에도 가시화 될 수 있도록 HBSS은 페놀 레드를 함유하는 44 %의 밀도 구배 원심 분리 배지를 확인하는 것이 중요하다. 또한, 부드러운하지만 추출 할 때 빠른 세척하는 것이 중요합니다피부 HBSS 매체에 저장되기 전에 피부 조직을 처리하는 세포 사멸을 방지한다.

세포 생존 또는 순도가 낮은 경우에는, 더 짧은 (~ 20 분) 소화 시간은 더 미세 조직을 콜라게나 닦지 D (~ 0.5 ㎎ / ㎖), 또는 약간 낮은 농도가 도움이 될 것이다. 오버 소화 조직의 열화 세포사에 기여할 수 있기 때문에 연구자들은 충분히 큰 세포 샘플 크기 (17)를 제공 최소 소화 시간을 최적화해야한다. 이 과정은 가능성이 기술을 표준화하는 개별 연구자의 ​​손에 최적화 차례이 필요합니다. 콜라게나 D 활동 수준도 사용할 효소의 각 로트 위해 만든되어야 할 것이다 제조 많이 소화 시간 조정에 따라 다를 수 있습니다. 최적화 동안, 면역 세포 LIN뿐만 아니라 신뢰성있는 실시간 / 죽은 얼룩 단계 다이제스트와 효소 정제없이 얼룩 기준 세포 현탁액 (예, 비장)에 중요eage 마커 (예를 들어, CD45, CD3ɛ, CD11b를, 중 CD11c 등) 세포 집단과 관심의 표면 마커는 조직의 소화 과정을 통해 보존되어 있는지 확인합니다. 가능하다면, 그 전방 측 및 측정 할 수 분산 폭 또는 높이뿐만 아니라 영역, 세포 응집체를 제외하는 유세포에 최적화를 수행하는 것이 도움이된다. 마지막으로, 세포 현탁액은 생존의 시각적 평가와 일반 세포 형태의 광학 현미경으로 관찰해야한다. 세포는 광학 현미경 또는 카운트 비드를 사용하여 유세포 0.4 % 트립 판 블루 염색 배제를 사용하여 수동으로 계산 될 수있다. 적출 된 조직의 특정 세포 유형의 더 엄격한 정량을 필요 연구에 연구자들은 무게 또는 전과 소화 후에 조직 절편의 부피를 측정하고,보다 정확하게 조직의 존재에 본 셀 서브 세트들의 수를 추정하기 위해 분해의 정도를 사용할 수있다 분석 하였다.

이 중 하나는 제한프로토콜은 특별히 면역 세포의 정제에 적용된다는 것이다. 하나의 분리, 정제, 및 다른 세포 집단 (예를 들면, 피부 상피 세포)의 분석에 관심이있는 경우, 밀도 구배 설정 및 효소 프로토콜 가능성 필요성이 모두 변성과 가장 관심있는 세포를 분리하기 위해 최적화 될 것이다 다이제스트. 그러나,이 프로토콜은 두 림프 및 골수 세포 아형의 단리 및 정제 할 수 있으며, 따라서 대부분의 면역 학적 응용에 적용 할 수있다. 또 다른 한계는이 프로토콜은 진피 대 피부의 표피를 침윤 세포 집단 구별하는데 사용될 수 없다는 것이다. 분화의 수준을 달성하기 위해,이 프로토콜은 상기 효소 적 진피를 분리하는 추가 단계를 적용 할 필요가 이전에 또는 그 대신에 여기에 설명 된 단계 표피 것이다. 여기서, 샘플을 어렵게 다중 파라미터 유세포 분석을 용이하게하기 위해 3 ~ 마우스로부터 풀링생물 복제 사이의 변화를 감지합니다. 그러나, 선택의 하류 어플리케이션에 따라,이 프로토콜은 쉽게 수득 및 사용 시료 단일 주체로부터하도록 변형 될 수있다. 마지막으로, 프로토콜이 여기에 젊은 제시, ND4 여성 마우스는 연구자의 필요에 따라 다양한 연령, 성별 또는 균주의 마우스에 맞게 수정해야 할 수도 있습니다.

요약하면, 부드러운 효소의 조합 다이제스트 불연속 구배 분리는 마우스에서 염증성 피부 병변에서 면역 세포를 정제하는 간단하고 효율적이고 경제적 인 방법을 제공한다. 이는 사용 및 면역 침윤을 평가 및 하류 어플리케이션에 백혈구의 순수 가능한 모집단을 분리하는 편리한 도구로 피부 병변의 설치류 모델의 다양한 범위에 걸쳐 광범위하게 적용될 수있다.

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Disclosures

저자는 공개 재정적 또는 기타 관심 회원이 없습니다.

Acknowledgements

국립 보건원 (DC에 NIH R15 NS067536-01A1), 국립 Vulvodynia 협회 (DC에 수상), 그리고 매 켈리 스터 대학교는이 작업을 지원했다. 인증 기관은 아놀드와 로벨 베크 재단 자금 매 켈리 스터 대학교 베크 학자 프로그램에서 교제를 받았다. BTF 및 TM은 JDRF 2-2011-662 지원합니다. 우리는 기술적 조언 박사 제이슨 Schenkel 박사 줄리아 루이스 감사, 그들의 도움과 지원에 대한 Chatterjea 랩의 모든 현재의 전 멤버.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid Sigma Aldrich 55021C Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma Aldrich H3375
EDTA disodium salt solution Sigma Aldrich E7889 Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select MidSci S01520HI Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) Sigma Aldrich P1644 Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201  Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one Sigma Aldrich E0753-10G Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) Tonbo Biosciences 70-0161 Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) Becton Dickinson 564378 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) eBioscience 47-0042-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8α-BV785 (53-6.7) BioLegend 100749 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) eBioscience 48-0112-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418) eBioscience 48-0114-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7) Becton Dickinson 563971 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11) Tonbo Biosciences 35-0451-U025 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) eBioscience 48-0452-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) BioLegend 104431 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) BioLegend 108407 Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510 Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa Becton Dickinson N/A Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum Roche Applied Science 11088858001 Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice Harlan 0-32 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. 

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References

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