בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota
Published 1/25/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Benck, C. J., Martinov, T., Fife, B. T., Chatterjea, D. Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation. J. Vis. Exp. (107), e53638, doi:10.3791/53638 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

בעיות עור הנעים בין דלקת עור ממגע, אקזמה, פסוריאזיס, צלוליטיס, זיהומים פטרייתיים ומורסות לסרטן העור שאינו מלנום נמצאו להיות בין 50 המחלות הנפוצות ביותר בעולם, והסיבה הרביעית המובילה העולמית של מחלות שאינן קטלניות בשנת 2010 1. בהתאם לכך, החקירה של מנגנונים מולקולריים ותאיים שבבסיס מחלות עור שונים הוא אזור חיוני ופעיל של מחקר. מודלים של מכרסמים היו להפליא שימושיים בהבנה של מצבי עור דלקתיים כגון אטופיק דרמטיטיס 2, 3 פסוריאזיס, או זיהום Staphylococcus aureus 4. פרוטוקולים זולים, יעילים, ופשוט לעיכול אנזימטי של רקמת עור עכבר יכולים לספק הכנות של תאים שיכולים לשמש למגוון רחב של יישומים במורד הזרם להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות עור טוב יותר. הנה, שיטה פשוטה וחסכונית מתוארת להאנזימטית תקציר של עור עכבררקמה ובידוד של לויקוציטים הסתננות עור שיכול לשמש לתרבית תאים, in vivo העברת מאמצת, ניתוח תזרים cytometric ומיון או מחקרי ביטוי גנים. המטרה הכללית של הליך זה היא להכין השעיה תא בודדת של כדוריות דם לבנות-הסתננות עור עם כדאיות תא גבוהות תוך מזעור עלויות הקשורות בדרך ערכות מגיב מותאם אישית וdissociators המכני.

שיטות ניתוק רקמת עור קיימות 05-07 מאי לגרום לשלמות סמן כדאיות תא ומשטח נמוכה, או לדרוש ערכות אנזים מותאמות אישית ומכונות דיסוציאציה הרקמה יקרה 8-11. בעוד העיכול של רקמת עור אוזן עכבר הוא נפוץ למדי 12-13, לעכל רקמת עור keratinized מאוד (למשל מהאגף) יכול לגרום להכנות תא מזוהמות בכמויות גדולות של פסולת בלתי תאית. במחקר שנערך לאחרונה, זייד ועמיתים מתעכלים עור אגף עכבר על 90 דקות ב2.5 מ"ג / מיליליטר dispase, folloנישא ב -45 דק 'ב 3 מ"ג collagenase / מיליליטר 7. במחקר אחר, חוקרים אלה משמשים incubations מרובה עם עיכול שילוב של 2.5 שעות, כוללים השימוש בטריפסין / EDTA, collagenase III, וdispase 5. השימוש בטריפסין אינו מומלץ לעיכול עור האנזימטית, כטיפול עם טריפסין מיצרנים שונים הוכח להשפיע מדידה השלמות של חלבונים בתא שטח בתאי יונקים 14-15. בנוסף, dispase יכולה להיות השפעה משמעותית על יכולות שגשוג של תאי CD4 וCD8α T ולהשפיע שפע פני השטח של לפחות 20 מולקולות, כולל סמני הפעלת תא T הנפוץ כגון CD62L 16. פרוטוקולים אחרים משתמשים RPMI 1640 במדיום העיכול 6. עם זאת, הנוכחות של Mg 2 + Ca 2 + בRPMI יכולה לגרום לתא נרחב צבירה 17.

פרוטוקול אידיאלי לניתוק רקמה צריך לשאוף לכדאיויות תא גבוהות, נמוכותהרמות של צבירת תא, ונזק מינימאלי לתא חלבוני פני השטח. הכנות תא סטרומה הבלוטה לימפה באיכות גבוהה שהושגו עם פרוטוקולים המשתמשים incubations אנזים קצר יותר, 2 + תקשורת חופשית Ca 2 + וMg, ולהימנע מטריפסין וdispase 18. עם זאת, פרוטוקולים מסוג זה לא נקבעו לניתוק של עור עכבר כולו.

כאן, פרוטוקול מתואר לנתק, לבודד, ולהעשיר את כדוריות דם לבנות-הסתננות עור מעור אגף עכבר-תיגר אלרגן. בקצרה, עור נכרת הוא-מודגרות מראש במאוזן מלח הפתרון של האנק (HBSS) עם 10% בסרום שור עוברי עבור שעה 1 כדי לרכך את הרקמה לעיכול ולהסיר את כל רקמת עור או שומן עודף מת. זה ואחריו צעד עיכול אנזימטי 30 דקות עם 0.7 מ"ג / מ"ל collagenase ד Collagenase D יש השפעות מינימליות על צפיפות של סמנים פני תא, ואין כל השפעה על התפשטות תאי T במבחנה 16,18, שהופך אותומתאים מאוד ליישומים הכוללים אפיון של חלבוני פני השטח. בעקבות עיכול אנזימטי, צנטריפוגה שיפוע צפיפות רציפה הייתה משמשת להסרת תאי אפיתל ופסולת מהשעית התא הבודד ולהעשיר לתאי hematopoietic. חשוב לציין, בהליך זה ימנע ריאגנטים יקרים מבוסס עמודת תא מגנטי הפרדה וניתוק מכונות רקמה 8-11, וניתן לבצע עם ציוד וחומרים הנמצא במעבדת מחקר ביו-רפואית בסיסית. הנה פרוטוקול זה שימש כדי לבודד לויקוציטים מעור אגף פעמים תיגר שלוש עם oxazolone hapten (השור) בעכברי ND4 השוויצריים רגישים בעבר (המותאם מ 19). תאים נותחו באמצעות cytometry זרימה רב-פרמטרית. טכניקה זו הניבה השעיה תא עם מינימאלית פסולת ו> כדאיות 95% של לימפוציטים המבודד שנותחו על ידי זרימה רבת-פרמטרית cytometry למדוד את החדירה של לימפוציטים מסוג T ונויטרופילים לsk המושפעב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: נקבות עכברים ישנות 8-12 שבוע ND4 השוויצרי וובסטר, כמקובל שוכנו עם גישה חופשית למזון ומים, שמשו למחקרים אלה פרוטוקול הניסוי בשימוש (B13S1) אושר על ידי IACUC של מקאליסטר המכללה..

1. רגישות ואתגר עם Oxazolone

  1. יום 0
    1. הכן תא הרדמה על ידי הוספת 3 מיליליטר isoflurane למגבות סופגים ממוקמות מתחת רשת בתחתית צנצנת זכוכית עפעפי 4 L. לנקבות עכברי ND4 משמשים כאן, זמן בחדר הוא 30-60 שניות עד שהנושא הוא הרדים כראוי; לייעל ממשל הרדמה לשימוש בלחצן העכבר.
    2. לגלח בחזרה של כל עכבר הרדים ולאגף באמצעות גוזם שיער בעלי חיים.
  2. יום 1
    1. הפוך פתרון 2% של 4 ethoxymethylene-2-פניל-2-oxazolin-5-אחד (שור) לתוך אתנול מוחלט, ולדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על צלחת מסתובבת בחממה.
    2. בקצרה להרדיםעכברים בהרדמה isoflurane כמתואר ב1.1.1 ולהחיל של 2% שור 100 μl למגולח בחזרה במספר יישומים הסידוריים של כ -20 μl כל אחד. חכה 5-10 שניות בין יישומים הסידוריים לפתרון לייבוש.
    3. לטפל כדי למנוע שפיכת 2% פתרון השור באזורים אחרים מאשר הגב, ולחכות לפתרון לייבוש בין יישומים.
  3. הימים 5-7
    1. הפוך פתרון 1% מ( שור) באתנול מוחלט, ולדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על צלחת מסתובבת בחממה.
    2. בעדינות אך בתקיפות לשתק את העכבר בעורפו של בסיס הצוואר וזנב עם בטן כלפי מעלה וצוואר מעט מוטה כלפי מטה (בדומה לאחיזה לזריקת intraperitoneal) ולהחיל של 1% שור 100 μl לאגף המגולח במספר יישומים סידוריים ולקחת את הזמן כדי לייבש את העור לאחר מכן כפי שתואר לעיל.
    3. לעכברי שליטה, תחול רכב אתנול מוחלט 100 μl לפלאן המגולחk.

2. עור הצלע קציר

  1. להרדים עכברים באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני, ובלו האזור הרצוי של עור אגף (~ 25 מ"מ x 25 מ"מ של עור) עם מספריים כירורגיות 10 סנטימטרים בזהירות.
  2. באמצעות סכין נקי, חד כירורגית, לגרד ממנו את עודפי השומן ורקמת חיבור של עור האגף.
  3. מניחים 3 חתיכות של עור אגף מן 3 עכברים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר RT HBSS [עם פנול אדום, ללא סידן או מגנזיום, 5 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 10 מ"מ 4 (2-hydroxyethyl) -1- חומצת piperazineethanesulfonic (HEPES), ו -10% בסרום שור עוברי (FBS)].

כביסה רקמות 3. טרום עיכול

  1. צינור מקום המכיל שברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס.
  2. וורטקס במרץ במשך 10 שניות בסוף תקופת הדגירה.
  3. מסננים את התוכן של הצינור באמצעות מיקרומטר 70מסננת כדי לבטל את החיץ לשטוף ולאסוף את הרקמה. מסננת אחת ניתן לעשות שימוש חוזר בכל ההליך כולו בתוך קבוצת טיפול ביולוגית.
  4. בעזרת זוג המלקחיים, להעביר את עור האגף מן המסננת לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש המכיל 10 מיליליטר של תקשורת טרי, RT HBSS (המכיל EDTA, HEPES, וFBS כפי שתואר לעיל).
  5. עם זוג 12.5 סנטימטר של מספריים לנתח ניתוח השקוע לתוך הצינור, ברר בכל פיסת עור אגף כך שפיסת הרקמה הממוצעת היא כ 2.2 מ"מ x 2.2 מ"מ באזור.
  6. צינור מקום המכיל שברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס.
  7. וורטקס במרץ במשך 10 שניות בסוף הדגירה

4. Collagenase עיכול של עור

  1. מסננים את התוכן של הצינור דרך מסננת 70 מיקרומטר, לאסוף ולהעביר את חתיכות עור אגף לתוך צינור חדש 50 מיליליטר חרוטי המכיל 10 מיליליטר fresh, תקשורת RT HBSS בתוספת 0.7 מ"ג / מיליליטר collagenase ד
  2. צינור מקום מכיל בינוני עיכול ושברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס.
  3. תוכן מערבולת של צינור במרץ במשך 10 שניות בסוף הדגירה.
  4. תוכן מסנן של צינור דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש; לשמור על הזרימה דרך מכיל רקמה מתעכל וזורקים את המסננת ולאגף עור פסולת.
  5. לשטוף את הזרימה דרך 50 מיליליטר של תקשורת HBSS, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 גרם, ולמזוג supernatant.

צנטריפוגה שיפוע 5. צפיפות

  1. בעזרת פיפטה סרולוגיות, להוסיף 3 מיליליטר 67% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות RT במלח 1X פוספט (PBS) לתוך צינור חרוטי חדש 15 מיליליטר עבור כל דגימה.
  2. Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר RT 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות בHBSS עם פנול אדום.
  3. ג'ֶנטֶלמֶןשכבת ly 5 מיליליטר של 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות המכילה את התאים על גבי 67% מדגם תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות בעזרת פיפטה סרולוגיות. הקפד להגדיר pipettor למהירות האיטית ביותר, ולמקם את פיפטה לאורך הקיר של צינור חרוטי. היזהר שלא ללחוץ, לשבש, או להפוך את השיפוע.
  4. ההאצה נקבע להגדרה הנמוכה ביותר, להתנתק הבלם, ו צנטריפוגות השיפוע ב931 XG במשך 20 דקות ב RT ולוודא כי צנטריפוגות היא מאוזנת.
  5. לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את השיפוע מצנטריפוגות, ועדינות להעביר לספסל המעבדה מחזיק הצינור זקוף. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק 5 מיליליטר, להסיר את שכבת התאים בממשק של תקשורת 44% ו 67% שיפוע צפיפות צנטריפוגה והעברת צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש. אם הממשק הוא לא נראה לעין, פשוט להסיר על 2 מיליליטר של נוזל בגבול 67% -44%.
  6. מלא את צינור חרוטי המכיל תאים מinterface עם 2% FBS בPBS קר כקרח 1X, תאי צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 XG, ולמזוג supernatant.
    הערה: זו הפעם הראשונה שיכולים להיות מקוררים התאים / שמרה קרה מאז צעדי עיכול הם על 37 מעלות צלזיוס וצעדי תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות הם ב RT. ניתן להשיג דילול 1 Trypan כחול ורוזנים ומידע כדאיות בנקודה זו: ניתן resuspended תאים ב1.

6. חסימה ומכתים לניתוח תזרים cytometric

  1. בלוק FcγRII / קולטנים שלישי בתאים כדי למנוע הכתמת נוגדן שאינו ספציפית. לניסויים שתוארו כאן, לעשות תערובות אדון הנוגדן בPBS עם 2% FBS המכיל 1: 100 דילול של נוגדן unconjugated נגד CD16 / 32 (2.4G2) כדי לאגד ולחסום קולטני FcγRII / III.
  2. דגירה תאים חסומים בתערובות אדון מתאימות של נוגדנים נגד CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), וLy-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), כמו גם כתם מבריק ויולט 510 חי / מת לזהות תאים מתים. להשתמש בכל הנוגדנים או בדילול מומלץ על ידי יצרנים או בעבר מותאם על ידי חוקרים. לניסויים שתוארו כאן, להשתמש בכל הנוגדנים בשעת 1: 100 דילול.
  3. לשטוף את תאים וגלולים בμl 50 חיץ מכתים 1X PBS עם 2% FBS. שמור על קרח עד שניתן לרכוש נתוני הקרינה על cytometer זרימה.
    הערה: חשוב לי פרמטרים פיצוי מראש מותאמים עם רקמת הלימפה ואנטיגן שטח פני תא משותף (כמו CD4 או CD8) לפני הרכישה של נתוני הקרינה.
  4. כדי להגדיל את מספר התאים לזרימה במורד הזרם cytometry ניתוח, לרכוש נתונים מדגימות כל תאים מוכתמים.

7. ניתוח cytometry זרימת נתונים תוך שימוש בשיטות רגילה כדי להשיג את הצעדים המפורטים להלן

  1. ראשית, שער באזור הלימפוציטים של הפיזור קדימה(אזור) על ידי צד פיזור עלילה (אזור).
  2. לאחר מכן, בחר תאים בודדים באמצעות הפיזור קדימה (רוחב) על ידי צד פיזור (רוחב), כדי להימנע מניתוח כפילויות. זה גם יכול להיות מושלם עם גובה פיזור קדימה על ידי עלילת גובה פיזור צד.
  3. לאחר מכן, שער על שושלת (CD11b, CD11c, וCD45R / B220) -שלילי וCD3 חיובי אירועים, להוציא מקרופאגים, תאים דנדריטים, ותאי B, בהתאמה, ולתחום ניתוחים לתא תא T, אם המטרה היא, כפי שהוא כאן, על מנת להעריך חדירת תאי T.
  4. לאחר מכן, שער על תאי חיים שלא לכלול את הכתם החי / מת.
  5. לבסוף, שער על אוכלוסיית התא של עניין (ראה סעיף תוצאות נציג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Collagenase D טופל splenocytes מראה רמות דומות של α CD4 ו CD8 על תאי T בהשוואה לקבוצת ביקורת שטופלה בתקשורת
ראשית, כל השפעות פוטנציאליות של collagenase D בשפע התדירות ופני שטח של סמני שושלת והפעלה בתת תא T הוערכו באמצעות רקמת הלימפה משנית כביקורת. השעיה של splenocytes התקבלה מעכברי ND4 ורחצה עבור שעה 1 עם תקשורת HBSS. לאחר מכן, מחצית התאים נתון של 0.7 מ"ג / מיליליטר Collagenase D (כמתואר בסעיף 4 לעיל). התאים הנותרים היו resuspended במדיום HBSS שליטה. בשלב הבא, שני שברי splenocyte עובדו באמצעות שיפוע צנטריפוגה צפיפות כפי שתואר בסעיף 5 לעיל. תאים אז היו מוכתמים בנוגדנים נגדן CD4 וCD8α, ונותחו על cytometer הזרימה. אחת, לחיות, CD45 +, שושלת שאינו T - (B220 - CD11b -CD11c -), CD3ɛ + תאים היו מגודר לניתוח, שלא לכלול תאי B, מקרופאגים, תאים דנדריטיים. חלבוני CD4 וCD8α התגלו באותה מידה על פני השטח של splenocytes שהיה נתון לcollagenase עיכול D ואלה שלא נחשפו לאנזים עם כ -60% מסוג CD4 + CD8α - תאים ו -30% CD4 - CD8α + תאים מזוהים גם עם טיפול ( איור 1 א). לכן, collagenase D לעכל לא השפיע על השכיחות היחסית של CD4 וCD8α. העוצמות שלהן CD4 ויחידות הקרינה ממוצעת גיאומטרי CD8α (gMFI) בתת אלה היו גם להשוות בין שני הטיפולים; ערכי gMFI לCD4 היו 2,271 לבהתאמה טופל אנזים ו2,243 לsplenocytes שליטה, וערכי gMFI לCD8α היו 536 לטופלו אנזים ולsplenocytes 520 שליטה. טיפול אנזימתי גם לא היה השפעה על הצפיפות של הפעלת תא T משטח סמני CD44 או CD62L על תאי CD4 + T (איור 1). ערכי עוצמת הקרינה ממוצעים גיאומטריים לCD44 היו 669 לטופל אנזים ולsplenocytes 654 שליטה; ערכי gMFI לCD62L היו 1,523 לטופל אנזים ו1,517 לsplenocytes שליטה. כעיכול Collagenase D שומר על השלמות של חלבוני פני השטח בתאים מבודדים, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש בביטחון לזרימה במורד הזרם cytometry ניתוח.

עיכול אנזים וטיהור שיפוע של תוצאות תאי עור אגף בכדאיות סלולרית גבוהה
תשואת תא וכדאיות אחוזים מהשעית התא השיגה מעל הוערכו באמצעות הדרת צבע Trypan הכחול 20. פרוטוקול הפרדת עיכול ושיפוע זה הניב כ -250 תאי קיימא חיסוניים למ"מ 2 של רקמת אגף בעכברי תיגר-שור ועל 4 תאים חיסוניים קיימא למ"מ 2 של רקמה בעכברים-תיגר רכב שרגיש בעבר עם שור (טבלה 1).

עיכול אנזים וטיהור שיפוע של תוצאות תאי עור אגף בהתאוששות חזקה של תאי מערכת חיסון
בשלב הבא, במידה של חדירת חיסון בעור נקבעה על ידי ניתוח השפע של חלבוני פני השטח CD45 על תאים מבודדים מהאגף של שור-תיגר ועכברים שליטה להעריך התאוששות של תאים חיסוניים-הסתננות עור באמצעות השיטות שתוארו כאן. CD45 הוא סמן שושלת פאן-hematopoietic 21. 95% מנמוכים קדימה וצד-פיזור, תאים בודדים (gating לא מוצג) בעכברי תיגר-שור ו -71% של תאים אלה בבקרה-תיגר רכב היו CD45 + תאי חיים (איור 2). גידול של פי 67 ~ בתאי CD45 + חיסוני חדירה זוהה בעור האגף הבא 3 אתגרי שור יומיים באמצעות ההליך המתואר במסמך (טבלת 1).

s = "jove_content" FO: לשמור-together.within-page => שלושה אתגרי שור אגף "1" לגרום לחדירה בולטת של תאי T ונויטרופילים
הטכניקה שלנו הניבה אוכלוסיית תאים מעור אגף שיכול לשמש כדי לזהות מגוון של מיאלואידית ותת תא הלימפה כמו-1 + Gr נויטרופילים 22, תאי CD4 T ותאי T CD8α. אנו נצפו ~ פי 6, 7 ~ פי, ו~ עליות 73 פי בנויטרופילים, תאי CD4 T, ותאי T CD8α, בהתאמה, לאחר 3 אתגרים יומיומיים שור (טבלת 1). חישבנו עליות אלה על ידי הכפלת המספר הכולל של תאי קיימא שהושגו (נספר באמצעות הרחקת trypan כחולה) על ידי אחוז של בר תא החיסון ניתנו מחוץ לשער תאי קיימא במהלך ניתוח התזרים cytometric. לאחר מכן, חילקו את מספר התאים חיסוניים הכולל קיימא, Gr-1 +, מסוג CD4 +, או CD8α + תאים בעכברים שטופלו על ידי שור המספרים המקביל לעכברי שליטה ברכב, שנתן לנולקפל עלייה בתת הלימפוציטים. GR-1 + נויטרופילים היוו 42% מCD45 היחיד, חי + B220 - CD11b - CD11c - תאים בעכברים שטופלו-שור ו -10% מאוכלוסייה זו בעכברים שטופלו EtOH (איור 2). בעכברים שטופלו-שור, ~ 52% של תאי CD3 + T מגודרות היו CD8α + ו~ 34% היו מסוג CD4 +, ואילו בפקדי רכב, ~ 9% מתאי T היו CD8α + ו -57% היו מסוג CD4 + (איור 2 ג) . לכן, עם הטכניקה שתוארה כאן, עור אגף אלרגי ולא אלרגי יכול להיות מעובד להניב השעיות תא בודדות מתאימות לאפיון התזרים cytometric ברזולוציה גבוהה של חדירה תת תא חיסון.

תאים תת עור מאגף העכבר שור / שור (3) השור / EtOH (3) מקפלים הרחבה (שור / Ethanol)
למ"מ 2 רקמות
מספר כולל של תאים 262.7 5.3 49.3
תאי CD45 + חיסוני 250.7 3.8 66.7
CD4 + CD8 - תאים 6.5 0.9 7.2
CD4 - CD8 + תאים 10.6 0.1 72.9
נויטרופילים 8.6 1.5 5.6

טבלת 1. תשואות ניידים מעור אלרגי אגף בנקבות עכברי ND4. תאי קיימא מבודדים מעור האגף נספרו באמצעות הרחקת Trypan הכחולה, ומנורמלים לתאים / מ"מ 2 רקמות המבוססות על השטח של העור מבודד ומספר העכברים ונקווה לTISלתבוע הכנה. חישבנו כוללת תשואת תא חיסון המבוסס על זיהוי של CD45 hematopoietic אנטיגן על פני התא, ותשואות משנה הלימפוציטים המבוססים על סמני משטח שושלת ספציפית. לאחר מכן, חילקו את מספר התאים בעכברים שטופלו על ידי שור המספרים לעכברי שליטה ברכב, נותן לנו לקפל עלייה בתת הלימפוציטים. הנתונים שמוצגים לייצג נתונים ונקווה 2-3 עכברים בכל טיפול, ומייצגים שני ניסויים בלתי תלויים.

איור 1
איור 1. טיהור מערכת עיכול ואנזימי שיפוע של splenocytes לשמר תת הלימפוציטים וסמני הפעלת תא. Splenocytes שטף עבור שעה 1 עם תקשורת HBSS, הודגרו עם או D collagenase או תקשורת HBSS לבד ומטוהר באמצעות שיפוע צפיפות כדי להסיר שאריות ותאי דם אדומים. תאי T זוהו כחי, CD45 +, שושלת (B220, CD11b, CD11c) <sup> -, וCD3ɛ +. התדר של CD4 ותאי T CD8α לא השתנה לאחר עיכול אנזימטי (). צפיפות שטח של CD44 וCD62L על תאי CD4 + T לא השתנתה בעקבות עיכול אנזימטי (B). הנתונים המוצגים מייצגים אספו נתונים 2-3 עכברים לטיפול מניסוי בודד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. עיכול האנזים וטיהור שיפוע של תאי עור לחשוף חדירה חיסונית מובהקת בשליטה לעומת עור אגף עכבר-תיגר אלרגן. שלושה אתגרי שור האגף לייצר גידול ~ 67 של פי תאים חיסוניים-הסתננות עור בעכברי ND4 השוויצרי רגישים בעבר ( ). שלושה אתגרי שור גם provאישור מאיזה עלייה ~ פי 6 בGr-1 + נויטרופילים (ב '), ו~ 73- ועלייה של 7 פי ~ של תאי CD8α + CD4 + T ו, בהתאמה (C). CD45 חי + תאים חיסוניים הם מגודרת מתאי פיזור יחידים, נמוכים קדימה וצד; נויטרופילים ותאי T מגודר מB220 - CD11b - CD11c - תאים בודדים חיים. ספירה בוצעה באמצעות דילול 1: כחול Trypan 1 הבא הפרדת צפיפות שיפוע. הנתונים שמוצגים מייצג אספו נתונים 2-3 עכברים בכל קבוצת טיפול, ומייצגים שני ניסויים בלתי תלויים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אפיון שינויים בכדוריות דם לבנות עור-תושב במודלים של מכרסמים של מחלות עור כגון אטופיק דרמטיטיס או פסוריאזיס הוא חשוב להבנת קשרים בין מכניסטית זרם תא הדלקתי ופתולוגיה מחלה. כאן אנו מתארים טכניקה חסכונית לבודד את כדוריות דם לבנות מרקמת עור עם ציוד בסיסי שנמצא ברוב מעבדות מחקר ביו-רפואיות. טכניקה מהירה יחסית זה תמנע את השימוש במכונות רקמה יקרה ניתוק וצינורות מותאמים אישית וריאגנטים, עוזרת לשמר משאבים תוך מזעור ידיים על זמן על ספסל המעבדה. האנזימטית עדין לעכל והפרדת שיפוע רציפה להסיר את רוב תאי האפיתל ופסולת, והתאים המבודדים יכול לשמש למגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים ניתוח התזרים cytometric, מיון תא, העברה, תרבית תאים ובמבחני גירוי חוץ גופית. יש אנזימתי לעכל עם Collagenase D אין כל השפעה על שלמות T פני תא סמן, וpreserכדאיות תא Ves. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות לעבד עור מאזורים אחרים מאשר האגף.

השלבים הקריטיים ביותר בהליך זה הם 1) הסרת יסודיות כל שומן ורקמת חיבור בעת קצירת העור, 2) טיפול ועיבוד רקמות במהירות כדי למקסם את חדירת תשואת תא תוך מזעור מוות של תאים, 3) בעדינות שכבות הצבע, ו- 4) בזהירות חילוץ הממשק של השיפוע. לפני תחילת ניסוי בקנה מידה גדולה, חשוב לתרגל שכבות תקשורת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות והסרת ממשק. אפשר לתרגל תאי קציר משיפוע צפיפות רציף על ידי ריסוק טחול עכברי כל דרך מסננת 70 מיקרומטר למאגר מכתים 1X PBS וביצוע שיפוע הצפיפות כפי שתואר לעיל בשלב 5. זה הרבה יותר קל לראות ולחלץ את הממשק בין תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות 44% ובתקשורת 67% צנטריפוגה שיפוע צפיפות באמצעות splenocytes, בשל המספר הגדול של תאים חיסוניים הנוכחיים.

כאשר עובדים עם מילויים צפיפות, יש להימנע בועות תוך pipetting, וצריכים להיות ממוזערים שיבושי שיפוע. צינור חרוטי המכיל את השיפוע צריך להיות מטופלים בעדינות והחזיק אנכי בכל העת. פתרונות תקשורת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות תמיד צריכים להיות ב RT, pipettors סרולוגיות להגדיר למהירות האיטית ביותר האפשרית השחרור, צנטריפוגות שמרה על RT, מוגדרת נמוכה ההאצה עם הבלם התנתק, וזהירות מאוזנת לפני ספינינג. כאשר עובדים עם הכנות עור שתנבנה מספרים קטנים של לויקוציטים הסתננות, תאים לא תמיד נראים לעין בממשק השיפוע. לפיכך, חשוב לעשות 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות עם HBSS המכיל פנול אדום כך שניתן דמיין את הממשק בקלות גם כאשר שכבה של תאים לא ניתן להבחין. בנוסף, חשוב להיות עדין אבל מהיר כאשר חילוץ, כביסהועיבוד רקמות עור כדי למנוע מוות של תאים לפני העור ממוקם בתקשורת HBSS.

אם כדאיות תא או טוהר הוא נמוכות, פעמים עיכול קצר יותר (~ 20 דקות), ריכוזים נמוכים מעט של D collagenase (~ 0.5 מ"ג / מיליליטר), או לטחון את הרקמה יותר דק עשויות להיות מועילות. בגלל עשוי לתרום על-עיכול ופירוק של רקמה למוות של תאים, חוקרים יצטרכו לייעל את זמן עיכול המינימלי המספק גודל מספיק גדול מדגם תא 17. התהליך צפוי לדרוש כמה סיבובים של אופטימיזציה בידיהם של חוקרים פרטיים כדי לתקן את הטכניקה. רמת פעילות D Collagenase עשויה גם להשתנות בין המון ייצור והתאמות לזמן עיכול תצטרך להתבצע לכל מנה של אנזים בשימוש. במהלך אופטימיזציה, חשוב השעיות התייחסות כתם תא (למשל טחול) מטוהרות עם ובלי האנזימטית לעכל צעד עם כתם מת אמין חי / כמו גם תא חיסון ליןסמני eage (למשל CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, וכו ') כדי לוודא שאוכלוסיות תאים וסמנים של עניין משטח נשמרים בתהליך עיכול רקמה. במידת האפשר, כדאי לבצע אופטימיזציות על cytometer זרימה שיכולה למדוד קדימה ורוחב צד פיזור או גובה, כמו גם אזור, להוציא אגרגטים תא. לבסוף, יש לבחון השעיות התא תחת מיקרוסקופ האור להערכה חזותית של כדאיות ומורפולוגיה תאית כללית. ניתן לספור את התאים באופן ידני באמצעות 0.4% הדרת צבע Trypan הכחול תחת מיקרוסקופ אור או על cytometer זרימה באמצעות חרוזים ספירה. ללימודים שדורשים כימות מחמיר יותר של סוגי תאים מסוימים ברקמה הניכרת, חוקרים יכולים לשקול או למדוד את עוצמת הקול של שברי רקמה לפני ואחרי עיכול, ולהשתמש במידת העיכול להעריך בצורה מדויקת יותר מספרים של תת תא הנוכחיים ביצור הרקמה מְנוּתָח.

מגבלה אחת של זהפרוטוקול הוא שהוא מותאם במיוחד לטיהור של תאי מערכת חיסון. אם מישהו מעוניין בבידוד, טיהור, וניתוח של אוכלוסייה אחרת סלולרית (למשל עור תאי אפיתל), הגדרת שיפוע צפיפות והאנזימטית לעכל פרוטוקול שניהם סביר צריך להיות שונה ומותאם לבודד הטוב ביותר התאים של עניין. עם זאת, פרוטוקול זה מאפשר בידוד וטיהור של שני תת תא הלימפה ומיאלואידית ולכן יכול להיות מותאם ליישומים החיסוניים ביותר. מגבלה נוספת היא שפרוטוקול זה אינו יכול לשמש להבחנה בין אוכלוסיות תאים שחדרו דרמיס לעומת האפידרמיס של העור. כדי להשיג רמה זו של בידול, פרוטוקול זה היה צריך להיות מותאם נוסף בצעדים נוספים על מנת להפריד בין אנזימי הדרמיס והאפידרמיס לפני או במקום הצעדים המפורטים כאן. כאן, דגימות נאספו מ~ 3 עכברים כדי להקל על ניתוח התזרים cytometric רב פרמטר ולכן קשהלזהות השתנות בין משכפל ביולוגי. עם זאת, בהתאם ליישום במורד הזרם של בחירה, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות להניב ודוגמאות שימוש מנושאים בודדים. לבסוף, הפרוטוקול מובא כאן לצעירים, נקבות עכברי ND4 ייתכן שיהיו הצורך לשנות לעכברים בגילים שונים, מין או זנים בהתאם לצרכים של חוקרים.

לסיכום, השילוב הזה של האנזימטית עדין לעכל והפרדת שיפוע רציפה מספקת שיטה פשוטה, יעילה וחסכונית של טיהור תאים חיסוניים מנגעים בעור דלקתיים בעכברים. ניתן להשתמש בו ומותאם באופן רחב על פני מגוון רחב של מודלים של מכרסמים של פתולוגיות עור ככלי נוח להערכת חדירה חיסונית ולבודד אוכלוסייה טהורה, בת-קיימא של לויקוציטים ליישומים במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש הסופרים לא כספיים או אחרים אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

המכונים הלאומי לבריאות (NIH R15 NS067536-01A1 לDC), הלאומי וולוודיניה אגודה (הפרס לDC), ומקאליסטר המכללה תמכו ביצירה זו. CB קיבל מלגה מהתכנית בקמן חוקרי מקאליסטר המכללה, ממומנת על ידי ארנולד ומייבל בקמן הקרן. BTF וTM נתמכים על ידי JDRF 2-2011-662. אנו מודים לד"ר ג'ייסון Schenkel וד"ר יוליאנה לואיס לייעוץ טכני, וכל החברים הנוכחיים ולשעבר המעבדה Chatterjea לעזרה והתמיכה שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid Sigma Aldrich 55021C Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma Aldrich H3375
EDTA disodium salt solution Sigma Aldrich E7889 Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select MidSci S01520HI Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) Sigma Aldrich P1644 Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201  Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one Sigma Aldrich E0753-10G Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) Tonbo Biosciences 70-0161 Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) Becton Dickinson 564378 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) eBioscience 47-0042-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8α-BV785 (53-6.7) BioLegend 100749 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) eBioscience 48-0112-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418) eBioscience 48-0114-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7) Becton Dickinson 563971 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11) Tonbo Biosciences 35-0451-U025 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) eBioscience 48-0452-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) BioLegend 104431 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) BioLegend 108407 Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510 Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa Becton Dickinson N/A Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum Roche Applied Science 11088858001 Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice Harlan 0-32 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134, (6), 1-8 (2013).
  2. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133, (2), 303-315 (2013).
  3. Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127, (6), 1292-1308 (2007).
  4. Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
  5. Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
  6. Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199, (9), 1265-1275 (2004).
  7. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, (14), 5307-5312 (2014).
  8. Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132, (7), 1869-1876 (2012).
  9. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
  10. Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
  11. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  12. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, (6), 973-984 (2011).
  13. Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35, (4), 562-571 (2011).
  14. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (36), (2010).
  15. Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6, (1), 10-20 (2014).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
  18. Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
  19. Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8, (10), e78673 (2013).
  20. Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40, (9), 557-560 (2009).
  21. Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9, (10), 320-326 (1988).
  22. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83, (1), 64-70 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats