Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

Immunology and Infection

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Benck, C. J., Martinov, T., Fife, B. T., Chatterjea, D. Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation. J. Vis. Exp. (107), e53638, doi:10.3791/53638 (2016).

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Abstract

Introduction

No se encontraron enfermedades de la piel que van desde dermatitis de contacto, eczema, psoriasis, celulitis, infecciones por hongos y abscesos a los cánceres de piel no melanoma de estar entre las 50 enfermedades más prevalentes en todo el mundo, y la cuarta causa mundial de enfermedades no mortales en 2010 1. Por consiguiente, la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a diversas patologías de la piel es un área necesaria y activa de investigación. Modelos de roedores han sido notablemente útil en la comprensión de las condiciones inflamatorias de la piel tales como dermatitis atópica 2, 3 psoriasis, o infección Staphylococcus aureus 4. Protocolos de bajo costo, eficientes y simples para la digestión enzimática de tejido de la piel del ratón pueden proporcionar preparaciones de células que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones posteriores para entender mejor la fisiopatología de enfermedades de la piel. Aquí, un método sencillo y económico se describe, por digestión enzimática de la piel del ratónel tejido de la piel y el aislamiento de leucocitos infiltrantes que puede ser utilizado para el cultivo celular, la transferencia adoptiva in vivo, análisis citométrico de flujo y clasificación o estudios de expresión génica. El objetivo general de este procedimiento consiste en preparar una suspensión de células de leucocitos infiltrantes de piel con la viabilidad celular alta y reducir al mínimo los costos normalmente asociados con kits de reactivos de encargo y disociadores mecánicos.

Métodos de disociación del tejido de la piel existentes 5-7 pueden resultar en una baja viabilidad celular y la superficie de la integridad marcador, o requerir kits enzimáticos personalizados y costosas máquinas de disociación de tejidos 8-11. Mientras que la digestión de los tejidos de la piel de oreja de ratón es razonablemente frecuente 12-13 de la digestión de tejidos de la piel altamente queratinizado (por ejemplo, desde el flanco) puede resultar en preparaciones de células contaminadas con grandes cantidades de escombros no celular. En un estudio reciente, Zaid y colegas digeridos ratón piel flanco durante 90 minutos en 2,5 mg / ml de dispasa, Folloconducido por 45 min en 3 mg / ml de colagenasa 7. En otro estudio, estos investigadores utilizaron múltiples incubaciones con una digestión combinada de 2,5 hr, incluyendo el uso de tripsina / EDTA, colagenasa III, y dispasa 5. No se recomienda el uso de tripsina durante la digestión enzimática de la piel, como se ha demostrado que el tratamiento con tripsina de diferentes fabricantes para afectar apreciablemente la integridad de las proteínas de la superficie celular en células de mamífero 14-15. Además, dispasa puede tener efectos significativos sobre las capacidades proliferativas de células CD4 y CD8a T y afectar a la abundancia de superficie de al menos 20 moléculas, incluyendo T común marcadores de activación celular, tales como CD62L 16. Otros protocolos utilizan RPMI 1640 en el medio de la digestión 6. Sin embargo, la presencia de Mg2 + y Ca2 + en medio RPMI puede causar la agregación extensa celular 17.

Un protocolo ideal para la disociación del tejido debe aspirar a la viabilidad celular alta, bajaniveles de agregación celular, y un daño mínimo a proteínas de la superficie celular. Preparaciones de células del estroma de los ganglios linfáticos de alta calidad se han cumplido con los protocolos que utilizan incubaciones enzimáticas más cortos, Ca 2+ y Mg 2+ medios de comunicación libres, y evitar la tripsina y Dispasa 18. Sin embargo, los protocolos de este tipo no se han establecido para la disociación de la piel entera de ratón.

Aquí, un protocolo se describe a disociar, aislar y enriquecer los leucocitos infiltrantes de la piel de la piel del flanco del ratón alergeno-desafió. Brevemente, piel extirpada se pre-incubó en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con suero bovino fetal al 10% durante 1 hora para suavizar el tejido para la digestión y eliminar cualquier exceso de piel o tejido graso muerto. Esto es seguido por una etapa de digestión enzimática 30 min con 0,7 mg / ml de colagenasa D. colagenasa D tiene efectos mínimos sobre la densidad de marcadores de superficie celular, y ningún efecto sobre la proliferación de células T in vitro 16,18, por lo que esmuy adecuado para aplicaciones que implican la caracterización de proteínas de la superficie. Después de la digestión enzimática, se utilizó centrifugación en gradiente de densidad discontinuo para eliminar las células epiteliales y los restos de la suspensión de una sola célula y enriquecer para las células hematopoyéticas. Es importante destacar que este procedimiento evita costosos reactivos separación celular magnética basada en la columna de disociación y máquinas de tejido 8-11, y se puede realizar con el equipo y los materiales encontrados en un laboratorio de investigación básica biomédica. Aquí se utiliza este protocolo para aislar los leucocitos de la piel flanco desafiado tres veces con la oxazolona hapteno (buey) en ratones ND4 suizos previamente sensibilizados (adaptado de 19). Las células se analizaron mediante citometría de flujo multiparamétrica. Esta técnica produjo una suspensión de células con los desechos mínimo y> 95% de viabilidad de los linfocitos aislados que fueron analizados por el flujo multi-paramétrico citometría para medir la infiltración de linfocitos y neutrófilos T en el sk afectadaen.

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Protocol

Nota: los ratones 8-12 semanas de edad Hembra ND4 Swiss Webster, convencionalmente alojados con libre acceso a los alimentos y el agua, fueron utilizados para estos estudios El protocolo experimental utilizado (B13S1) fue aprobado por IACUC de Macalester College..

1. Sensibilización y Desafío con oxazolona

  1. Día 0
    1. Preparar cámara de anestesia mediante la adición de 3 ml de isoflurano a las toallas absorbentes colocados debajo de la malla en la parte inferior de un 4 L frasco de vidrio con tapa. Para los ratones hembra ND4 utiliza aquí, el tiempo en la cámara es de 30-60 seg hasta que el sujeto es anestesiado adecuadamente; optimizar la administración de anestesia se utiliza para la cepa de ratón.
    2. Afeitarse la espalda de cada ratón anestesiado y flanquear usando un cortador de pelo animal.
  2. Día 1
    1. Hacer una solución 2% de 4-etoximetilen-2-fenil-2-oxazolin-5-ona (Ox) en etanol absoluto, y se incuba a 50 ° C durante 15 min en un plato giratorio en una incubadora.
    2. Brevemente anestesiarratones utilizando anestesia con isoflurano como se describe en 1.1.1 y aplique 100 l de 2% de buey a la afeitada de vuelta en varias aplicaciones de serie de unos 20 l cada uno. Espere 5-10 segundos entre las aplicaciones de serie de la solución a secar.
    3. Tenga cuidado de no derramar la solución Buey 2% en regiones distintas de la parte posterior, y esperar a que la solución se seque entre aplicaciones.
  3. Días 5-7
    1. Hacer una solución 1% de (Ox) en etanol absoluto, y se incuba a 50 ° C durante 15 min en un plato giratorio en una incubadora.
    2. Suavemente pero con firmeza inmovilizar el ratón en el pescuezo de la base del cuello y la cola con el abdomen hacia arriba y el cuello ligeramente inclinada hacia abajo (similar a una retención para una inyección intraperitoneal) y aplicar 100 l de 1% Ox al flanco afeitado en varias aplicaciones de serie y tomarse el tiempo para secar la piel después como se ha descrito anteriormente.
    3. Para los ratones de control, aplicar 100 l de vehículo absoluta etanol para el flan afeitadok.

2. Flanco Piel Cosecha

  1. La eutanasia ratones utilizando la inhalación de dióxido de carbono, y extirpar con cuidado el área deseada de la piel del flanco (~ 25 mm x 25mm de la piel) con 10 cm tijeras quirúrgicas.
  2. Usando una cuchilla quirúrgica limpia, nítida, raspar el exceso de grasa y tejido conectivo de la piel flanco.
  3. Coloque 3 piezas de piel flanco de 3 ratones en un tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de HBSS RT [con rojo de fenol, sin calcio o magnesio, 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 10 mM 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazinetanosulfónico (HEPES), y suero bovino fetal al 10% (FBS)].

3. Pre-digestión del tejido Lavadora

  1. Colocar el tubo que contiene fragmentos de piel en una placa giratoria para 30 min en una incubadora no gaseados seco mantenido a 37 ° C.
  2. Vortex vigorosamente durante 10 segundos al final del periodo de incubación.
  3. Cuele el contenido del tubo a través de un m 70colador para desechar el tampón de lavado y recoger el tejido. Un único tamiz puede ser reutilizado durante todo el procedimiento dentro de un grupo de tratamiento biológico.
  4. El uso de un par de fórceps, transferir la piel flanco desde el colador en un nuevo tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de fresco, medios de comunicación RT HBSS (que contienen EDTA, HEPES, FBS y como se describe anteriormente).
  5. Con un par 12.5 cm de tijeras de disección quirúrgicos inmersos en el tubo, pelos en cada pieza de piel del flanco de manera que la pieza media del tejido es de aproximadamente 2,2 mm x 2,2 mm en la zona.
  6. Colocar el tubo que contiene fragmentos de piel en una placa giratoria para 30 min en una incubadora no gaseados seco mantenido a 37 ° C.
  7. Vortex vigorosamente durante 10 segundos al final de la incubación

4. La digestión de colagenasa de la piel

  1. Cuele el contenido del tubo a través de un colador de 70 micras, recoger y transferir las piezas de piel flanco en un nuevo tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml fresh, medios RT HBSS suplementado con 0,7 mg / ml de colagenasa D.
  2. Colocar el tubo que contiene medio de la digestión y fragmentos de piel en una placa giratoria para 30 min en una incubadora no gaseados seco mantenido a 37 ° C.
  3. Contenidos vórtice de tubo vigorosamente durante 10 segundos al final de la incubación.
  4. Filtrar contenido del tubo a través de un colador de 70 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml; mantener el flujo a través que contiene el tejido digerido y deseche el filtro y el flanco restos de piel.
  5. Lavar el flujo a través en 50 ml de HBSS medios de comunicación, centrifugar durante 5 min a 350 g y decantar el sobrenadante.

5. Densidad centrifugación en gradiente

  1. Utilizando una pipeta serológica, añadir 3 ml RT 67% centrifugación en gradiente de densidad media en 1X tampón fosfato salino (PBS) en un nuevo tubo cónico de 15 ml para cada muestra.
  2. Resuspender el sedimento celular en 5 ml RT 44% de densidad de centrifugación en gradiente de medios de comunicación en HBSS con rojo fenol.
  3. CaballeroLy capa de 5 ml de los medios de centrifugación en gradiente de densidad 44% que contiene las células en la parte superior del gradiente de densidad de centrifugación de la muestra los medios de comunicación 67% usando una pipeta serológica. Asegúrese de ajustar la pipeta a la velocidad más baja y coloque la pipeta a lo largo de la pared del tubo cónico. Tenga cuidado de no mover, alterar, o invertir el gradiente.
  4. Aceleración de Ajuste a la posición más baja, desenganchar el freno, y centrifugar el gradiente a 931 xg durante 20 minutos a temperatura ambiente asegurándose de que la centrífuga es equilibrada.
  5. Después de la centrifugación, retire con cuidado el gradiente de la centrífuga, y transportar suavemente a la mesa de laboratorio sostiene el tubo en posición vertical. Usando una pipeta de transferencia de plástico de 5 ml, retire la capa de células en la interfase de los 44% y 67% de gradiente de densidad media de centrifugación y la transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Si la interfaz no está visible, simplemente quite unos 2 ml de líquido en el 67% -44% del límite.
  6. Llene el tubo cónico que contiene células de la interface con 2% de FBS en 1X PBS enfriado en hielo, las células de centrifugación durante 5 minutos a 350 xg, y decantar el sobrenadante.
    Nota: Esta es la primera vez que las células se pueden enfriar / mantenidos en frío, ya pasos de digestión son a 37 ° C y los pasos de los medios de gradiente de densidad de centrifugación son a RT. Las células pueden ser resuspendidas en un 1: 1 Trypan azul de dilución y el recuento de viabilidad y la información se puede obtener en este punto.

6. Bloqueo y tinción para el Análisis de citometría de flujo

  1. Bloquear RII / III receptores en las células para prevenir la tinción de anticuerpos no específicos. Para los experimentos descritos aquí, hacer mezclas de reacción de anticuerpos en PBS con 2% de FBS que contiene 1: 100 dilución de anticuerpo no conjugado contra CD16 / 32 (2.4G2) para atar y bloquean los receptores RII / III.
  2. Se incuban las células bloqueadas con mezclas de reacción adecuados de anticuerpos contra CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), y Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), así como Brilliant Violet 510 mancha en vivo / muerto para identificar las células muertas. Utilice todos los anticuerpos ya sea a la dilución recomendada por los fabricantes o previamente optimizado por los investigadores. Para los experimentos descritos aquí, utilizar todos los anticuerpos a 1: 100 dilución.
  3. Lavar las células y resuspender en 50 l de PBS 1X tampón de tinción con 2% de FBS. Mantenga en hielo hasta que los datos de fluorescencia se pueden adquirir en un citómetro de flujo.
    Nota: Es importante tener parámetros de compensación pre-optimizados con un tejido linfoide y un antígeno de superficie celular común (como CD4 o CD8) antes de la adquisición de los datos de fluorescencia.
  4. Para aumentar el número de células para análisis de citometría de flujo aguas abajo, adquirir datos de las muestras enteras de células teñidas.

7. Analizar citometría de flujo de datos mediante los métodos estándar para lograr los pasos descritos a continuación

  1. En primer lugar, la puerta en la región de linfocitos de la dispersión frontal(área) por dispersión lateral (área) trama.
  2. A continuación, seleccione las células individuales utilizando el dispersión frontal (ancho) por dispersión lateral (ancho), para evitar el análisis de dobletes. Esto también se puede lograr con una altura de dispersión hacia adelante por la altura dispersión lateral trama.
  3. Entonces, la puerta en el linaje (CD11b, CD11c y CD45R / B220) -negativo y CD3 positivos acontecimientos, para excluir a los macrófagos, las células células dendríticas, y B, respectivamente, y confine analiza al compartimento de células T, si el objetivo es, como en este caso, para evaluar la infiltración de células T.
  4. A continuación, la puerta en las células vivas que excluyen la mancha en vivo / muerto.
  5. Por último, la puerta en la población celular de interés (ver sección de resultados representativos).

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Representative Results

La colagenasa D tratada esplenocitos muestran niveles similares de CD4 y CD8 α en las células T en comparación con los controles tratados con los medios
En primer lugar, cualquier efecto potencial de colagenasa D sobre la frecuencia y la superficie abundancia de linaje y activación marcadores en subconjuntos de células T se evaluaron utilizando el tejido linfoide secundario como un control. Una suspensión de esplenocitos se obtuvo de ratones ND4 y se lavó durante 1 hora con los medios de comunicación HBSS. A continuación, la mitad de las células sometidas a 0,7 mg / ml de colagenasa D (como se describe en la Sección 4 más arriba). Las células restantes se resuspendieron en medio de control HBSS. A continuación, ambas fracciones de esplenocitos se procesaron utilizando un gradiente de centrifugación de densidad como se describe en la Sección 5 más arriba. Las células fueron teñidas con anticuerpos contra la superficie CD4 y CD8a, y se analizaron en el citómetro de flujo. Soltero, vive, CD45 +, no T linaje - (B220 - CD11b -CD11c -), las células CD3ɛ + fueron cerrada para el análisis, para excluir las células B, macrófagos, células dendríticas. Proteínas CD4 y CD8a se detectaron igualmente en la superficie de los esplenocitos que había sido sometido a digestión con colagenasa D y los que no habían sido expuestos a la enzima con aproximadamente 60% ​​CD4 + CD8a - células y 30% CD4 - células CD8a + detectada con cualquiera de los tratamientos ( Figura 1A). Por lo tanto, la colagenasa D digest no afectó a la frecuencia relativa de CD4 y CD8a. Las intensidades de superficie CD4 y CD8a unidades medias geométricas de fluorescencia (gMFI) en estos subconjuntos también fueron comparables entre los dos tratamientos; valores gMFI para CD4 fueron 2,271 para tratado con enzimas y 2243 para los esplenocitos de control respectivamente, y los valores gMFI para CD8a eran 536 para tratado con enzimas y 520 para los esplenocitos de control. El tratamiento enzimático también tuvo ningún efecto sobre la densidad superficial de los marcadores de activación de células T CD44 o CD62L en las células T CD4 + (Figura 1B). Valores de intensidad de fluorescencia media geométrica para CD44 eran 669 para tratado con enzimas y 654 para los esplenocitos de control; valores gMFI para CD62L fueron 1,523 por tratado con enzimas y 1.517 para los esplenocitos control. Como digestión con colagenasa D preserva la integridad de las proteínas de superficie en las células aisladas, el protocolo descrito aquí puede ser utilizado con confianza para el flujo aguas abajo citometría de análisis.

Digestión enzimática y purificación de gradiente de piel flanco células resulta en una alta viabilidad celular
Rendimiento celular y el porcentaje de viabilidad de la suspensión celular obtenida anteriormente se evaluaron utilizando exclusión del colorante azul de tripano 20. Este protocolo de separación de la digestión y el gradiente produjo alrededor de 250 células inmunes viables por mm2 de tejido flanco en ratones expuestos-Ox y cerca de 4 células inmunes viables por mm2 de tejido en ratones con vehículo desafiadoque fueron sensibilizados previamente con Ox (Tabla 1).

Digestión enzimática y purificación en gradiente de piel flanco células resultados en la recuperación robusta de las células inmunes
A continuación, el grado de infiltración inmune en la piel se determinó mediante el análisis de la abundancia de proteínas de superficie CD45 sobre las células aisladas a partir del flanco de Ox-desafiado y los ratones de control para evaluar la recuperación de las células inmunes infiltrantes de la piel usando los métodos descritos aquí. CD45 es un marcador de linaje hematopoyético pan-21. 95% de baja primero y la cara de dispersión, las células individuales (gating no se muestra) en ratones expuestos-Ox y el 71% de estas células en los controles del vehículo-desafió eran células CD45 + en vivo (Figura 2). Se detectó un aumento de ~ 67 veces en la infiltración de células CD45 + inmunes en la piel flanco siguiente 3 retos buey diarias utilizando el procedimiento descrito en el presente documento (Tabla 1).

Tres retos buey flanco lugar a la infiltración pronunciada de las células T y neutrófilos
Nuestra técnica produjo una población de células de la piel flanco que podría ser utilizado para detectar una variedad de mieloide y subconjuntos de células linfoides tales como GR-1 + 22 neutrófilos, células T y las células CD4 T CD8a. Hemos observado ~ 6 veces, ~ 7 veces, y ~ aumenta 73 veces en los neutrófilos, las células T CD4, y células T CD8a, respectivamente, después de 3 retos buey diarias (Tabla 1). Se calcularon estos aumentos multiplicando el número total de células viables obtenidas (contaron usando exclusión de azul de tripano) por el porcentaje del fragmento de célula inmune dada fuera de la puerta células viables durante el análisis de citometría de flujo. A continuación, divide el número de células inmunes totales viables, las células CD8a + Gr-1 +, CD4 +, o en los ratones tratados-Ox por los números correspondientes para los ratones de control del vehículo, que nos dadoblar los aumentos en los subgrupos de linfocitos. Gr-1 + neutrófilos representaban el 42% de los solteros, CD45 en vivo + B220 - CD11b - CD11c - células en ratones tratados con el buey y el 10% de esta población en los ratones tratados con EtOH (Figura 2B). En los ratones tratados-Ox, ~ 52% de células T CD3 + cerradas eran CD8a + y ~ 34% eran CD4 +, mientras que en los controles del vehículo, ~ 9% de las células T se CD8a + y 57% eran CD4 + (Figura 2C) . Por lo tanto, con la técnica descrita aquí, la piel alérgica y no alérgica flanco puede ser procesada para producir suspensiones de células individuales adecuados para la caracterización de alta resolución de citometría de flujo de infiltrarse en subconjuntos de células inmunes.

Células subconjuntos de la piel del flanco del ratón Ox / Ox (3) Ox / EtOH (3) Dobla Expansión (Ox / ETHANOL)
por mm 2 de tejido
Número total de células 262.7 5.3 49.3
Células CD45 + inmunes 250.7 3.8 66.7
CD4 + CD8 - células sesenta y cinco 0.9 7.2
Células CD8 + - CD4 10.6 0.1 72.9
Los neutrófilos 8.6 15 5.6

Tabla 1. Los rendimientos celulares de la piel flanco alérgica en ratones hembra ND4. Las células viables aisladas de la piel flanco se contaron usando exclusión de azul de tripano, y se normalizó a las células / mm 2 de tejido basado en el área de piel aislado y el número de ratones agrupados por tisdemandar a la preparación. Se calculó el rendimiento total de células inmunes basado en la detección del antígeno CD45 hematopoyéticas en la superficie celular, y los rendimientos de subconjuntos de linfocitos basada en marcadores de superficie específicos de linaje. Luego nos dividimos el número de células en los ratones tratados con buey por los números para los ratones de control del vehículo, dando nos plegamos aumentos en los subgrupos de linfocitos. Los datos mostrados representan datos agrupados 2-3 ratones por tratamiento, y son representativos de dos experimentos independientes.

Figura 1
Figura 1. Digestión enzimática y el gradiente de purificación de esplenocitos a preservar los subgrupos de linfocitos y marcadores de activación de células. Los esplenocitos se lavaron durante 1 hora con los medios de comunicación HBSS, se incubaron ya sea con colagenasa D o medio HBSS solo y se purificó usando un gradiente de densidad para eliminar los residuos y las células rojas de la sangre. Las células T fueron identificados como vivo, CD45 +, el linaje (B220, CD11b, CD11c) <sup> - y CD3ɛ +. Frecuencia de CD4 y las células T CD8a no cambió después de la digestión enzimática (A). Densidad superficial de CD44 y CD62L en las células T CD4 + no cambió después de la digestión enzimática (B). Los datos mostrados representan agruparon los datos 2-3 ratones por tratamiento de un solo experimento. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. digestión con enzimas y purificación en gradiente de células de la piel revelan la infiltración inmune distinta en el control vs. piel flanco del ratón alergeno-desafió. Tres retos buey flanco producen un aumento de ~ 67 veces en las células inmunes infiltrantes de la piel en ratones suizos ND4 previamente sensibilizados ( A). Tres retos Buey también PROVoked un aumento ~ 6 veces en Gr-1 + neutrófilos (B), y 73- ~ y ~ 7 veces aumento de las células CD8a + y T CD4 +, respectivamente (C). Células inmunes CD45 + en vivo son cerradas a partir de células individuales, bajas hacia adelante y laterales de dispersión; neutrófilos y linfocitos T cerradas desde B220 - CD11b - CD11c - células individuales en vivo. Los conteos se realizaron con un 1: 1 Trypan azul de dilución después de la separación en gradiente de densidad. Los datos mostrados representa agruparon los datos 2-3 ratones en cada grupo de tratamiento, y son representativos de dos experimentos independientes. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La caracterización de los cambios en los leucocitos de la piel-residente en modelos de roedores de enfermedades de la piel tales como dermatitis atópica o psoriasis es importante para la comprensión de las conexiones mecánicas entre la afluencia de células inflamatorias y patología de la enfermedad. Aquí se describe una técnica económica para aislar leucocitos de tejidos de la piel con el equipo básico que se encuentra en la mayoría de los laboratorios de investigación biomédica. Esta relativamente rápida técnica evita el uso de máquinas de disociación de tejidos caros y tubos personalizados y reactivos, lo que ayuda a conservar los recursos y reducir al mínimo manos a tiempo en el banco de laboratorio. Gentle enzimática digerir y separación en gradiente discontinuo eliminar la mayoría de las células y los restos epiteliales y las células aisladas se puede utilizar para una variedad de aplicaciones posteriores, incluyendo el análisis de citometría de flujo, clasificación de células, la transferencia, el cultivo celular y en los ensayos de estimulación in vitro. Digestión enzimática con colagenasa D no tiene efecto sobre la integridad de la superficie celular T marcador, y preserla viabilidad celular Ves. Este protocolo se puede modificar fácilmente para procesar la piel de regiones distintas del flanco.

Los pasos más críticos en este procedimiento son: 1) la eliminación de fondo cualquier adiposo y tejido conectivo, mientras que la cosecha de la piel, 2) la manipulación y el tejido de procesamiento rápido para maximizar la infiltración de rendimiento celular y reducir al mínimo la muerte celular, 3) capas suavemente el gradiente, y 4) con cuidado la extracción de la interfaz del gradiente. Antes de comenzar un experimento a gran escala es importante para practicar centrifugación en gradiente de densidad de estratificación medios de comunicación y la eliminación de interfaz. Se puede practicar células de cosecha de un gradiente de densidad discontinua por aplastamiento todo un bazo murino través de un colador 70 micras en tampón de tinción 1X PBS y realizar el gradiente de densidad como se describe anteriormente en el paso 5. Es mucho más fácil ver y extraer la interfaz entre el 44% de medios de gradiente de densidad de centrifugación y los medios de comunicación el 67% de centrifugación en gradiente de densidad utilizando splenocytes, debido al gran número de células inmunes presentes.

Cuando se trabaja con gradientes de densidad, las burbujas deben ser evitados mientras pipeteo, y las interrupciones de gradiente debe ser minimizado. El tubo cónico que contiene el gradiente debe ser manejado con cuidado y se mantiene vertical en todo momento. Soluciones de medios de centrifugación en gradiente de densidad deben estar siempre a temperatura ambiente, pipetas serológicas establecidos a la velocidad más baja posible liberación, la centrífuga se mantiene a RT, ajuste a la baja de aceleración con el freno desenganchado, y cuidadosamente equilibradas antes de girar. Cuando se trabaja con productos para la piel que producen pequeñas cantidades de leucocitos infiltrantes, las células no siempre son visibles en la superficie de la pendiente. Por lo tanto, es importante para hacer que la densidad de los medios de comunicación centrifugación en gradiente de 44% con HBSS que contiene rojo de fenol de manera que la interfaz se puede visualizar fácilmente, incluso cuando una capa de células no puede ser discernida. Además, es importante ser suave pero rápida al extraer, lavadoy el procesamiento de tejido de la piel para evitar la muerte celular antes de la piel se coloca en los medios de HBSS.

Si la viabilidad celular o la pureza es baja, más corto (~ 20 min) tiempos de digestión, las concentraciones ligeramente más bajos de colagenasa D (~ 0,5 mg / ml), o picar el tejido más fino podría ser útil. Debido a que el exceso de la digestión y degradación del tejido puede contribuir a la muerte celular, los investigadores necesitan para optimizar el tiempo de digestión mínima que proporciona una suficiente gran tamaño muestra de células 17. El proceso probablemente requerirá varias rondas de optimización en las manos de los investigadores individuales para estandarizar la técnica. La colagenasa nivel de actividad D también puede variar entre los lotes de fabricación y los ajustes a tiempo de digestión deberá ser realizado para cada lote de enzima utilizada. Durante la optimización, es importante para las suspensiones de células de referencia (por ejemplo, tinción de bazo) purificadas con y sin un digerido enzimático paso con una mancha en vivo / muerto fiable, así como de células inmunes linmarcadores EAGE (por ejemplo, CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, etc.) para asegurarse de que las poblaciones de células y marcadores de superficie de interés se conservan a través del proceso de la digestión de los tejidos. Si es posible, es útil para llevar a cabo optimizaciones en un citómetro de flujo que puede medir hacia adelante y la anchura o la altura de dispersión lateral, así como área, para excluir los agregados de células. Por último, las suspensiones celulares deben ser examinados bajo el microscopio óptico para la evaluación visual de viabilidad y morfología celular general. Las células pueden contarse manualmente utilizando 0,4% exclusión del colorante azul de tripano bajo un microscopio de luz o en un citómetro de flujo utilizando contar bolas. Para los estudios que requieran una cuantificación más estrictas de tipos de células específicas en el tejido extirpado, los investigadores pueden pesar o medir el volumen de los fragmentos de tejido antes y después de la digestión, y el uso de la extensión de la digestión para estimar con mayor precisión el número de subconjuntos de células presentes en el ser tejido analizado.

Una limitación de esteprotocolo es que está adaptado específicamente para la purificación de las células inmunes. Si uno está interesado en el aislamiento, purificación y análisis de otra población celular (por ejemplo, la piel las células epiteliales), el gradiente de densidad de puesta a punto y la digestión enzimática protocolo tanto probable necesidad de ser modificado y optimizado para mejor aislar las células de interés. Sin embargo, este protocolo permite el aislamiento y la purificación de los dos subconjuntos de células linfoides y mieloides y por lo tanto se puede adaptar a aplicaciones más inmunológicos. Otra limitación es que este protocolo no puede ser usado para diferenciar entre las poblaciones de células que infiltran la dermis frente a la epidermis de la piel. Para lograr este nivel de diferenciación, este protocolo tendría que adaptarse aún más con medidas adicionales para separar enzimáticamente la dermis y epidermis antes o en lugar de los pasos descritos aquí. Aquí, las muestras se agruparon de ~ 3 ratones para facilitar multi-parámetro de análisis de citometría de flujo por lo que es difícil dedetectar la variabilidad entre repeticiones biológicos. Sin embargo, dependiendo de la aplicación aguas abajo de elección, este protocolo puede modificarse fácilmente para producir muestras y uso de los sujetos individuales. Por último, el protocolo presentado aquí por jóvenes, pueden necesitar ser modificado para ratones de diferentes edades, sexo o cepas de acuerdo a las necesidades de los investigadores ratones hembra ND4.

En resumen, esta combinación de digerir enzimática suave y separación gradiente discontinuo proporciona un método simple, eficaz y económica de purificar las células inmunes de las lesiones inflamatorias de la piel en ratones. Puede ser utilizado y adaptado ampliamente a través de una amplia gama de modelos de roedores de patologías de la piel como una herramienta conveniente para evaluar la infiltración inmune y aislar una población pura, viable de los leucocitos para las aplicaciones posteriores.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses financieros o de otro tipo para revelar.

Acknowledgements

Los Institutos Nacionales de Salud (NIH R15 NS067536-01A1 a DC), la Asociación Nacional de vulvodinia (premio a DC), y Macalester College apoyaron este trabajo. CB recibió una beca del Programa de Beckman estudiosos Macalester College, financiado por la Fundación Mabel Beckman Arnold y. BTF y TM son compatibles con JDRF 2-2011-662. Agradecemos al Dr. Jason Schenkel y el Dr. Juliana Lewis para el asesoramiento técnico, y todos los miembros actuales y anteriores del laboratorio Chatterjea por su ayuda y apoyo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid Sigma Aldrich 55021C Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma Aldrich H3375
EDTA disodium salt solution Sigma Aldrich E7889 Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select MidSci S01520HI Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) Sigma Aldrich P1644 Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201  Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one Sigma Aldrich E0753-10G Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) Tonbo Biosciences 70-0161 Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) Becton Dickinson 564378 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) eBioscience 47-0042-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8α-BV785 (53-6.7) BioLegend 100749 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) eBioscience 48-0112-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418) eBioscience 48-0114-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7) Becton Dickinson 563971 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11) Tonbo Biosciences 35-0451-U025 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) eBioscience 48-0452-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) BioLegend 104431 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) BioLegend 108407 Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510 Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa Becton Dickinson N/A Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum Roche Applied Science 11088858001 Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice Harlan 0-32 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. 

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References

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