मॉडलिंग कीमोथेरेपी प्रतिरोधी लेकिमिया * These authors contributed equally

Medicine

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Slone, W. L., Moses, B. S., Evans, R., Piktel, D., Martin, K. H., Petros, W., Craig, M., Gibson, L. F. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (108), e53645, doi:10.3791/53645 (2016).

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Abstract

Protocol

1. उन्नत तैयारी

  1. dextran G10 कणों की तैयारी।
    1. 10 ग्राम G10 कणों को पीबीएस 1x 50 मिलीलीटर जोड़कर G10 घोल तैयार करें। उलटा द्वारा मिक्स और G10 4 डिग्री सीओ / एन पर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के बाहर समझौता करने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. G10 स्तंभ जुदाई के दिन, बसे G10 कणों से महाप्राण पीबीएस और 50 मिलीलीटर ताजा पीबीएस जोड़ें। उलटा द्वारा मिक्स। दो बार दोहराएँ, 4 डिग्री सेल्सियस पर बसे G10 कणों और स्टोर करने के लिए 50 मिलीलीटर ताजा पीबीएस जोड़ने का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक।
  2. BMSC और ओबी संवर्धन।
    1. 6% सीओ 2 और 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट पर हो में 37 डिग्री सेल्सियस पर दोनों BMSC या ओबी बनाए रखें जब तक 90% confluency तक पहुँच जाता है।
    2. नए 10 सेमी प्लेटों पर 2: Trypsinize BMSC या ओबी कोशिकाओं और विभाजित 1। जब तक लयूकेमिक सह संवर्धन के लिए आवश्यक कोशिकाओं इन मानकों के बड़े हो रहे हैं।

2. स्थापना और सह-संस्कृति को बनाए रखने

  1. 5-20 एक्स 10 6 लयूकेमिक कोशिकाओं जोड़ें रहाn एक 80% -90% मिला हुआ BMSC या ओबी थाली पर ट्यूमर विशिष्ट संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर।
    नोट: हमारी प्रयोगशाला 5% 2 हे में 37 डिग्री सेल्सियस पर सह संस्कृतियों का कहना बेहतर अस्थि मज्जा microenvironment जो 1% से 7% 16-18 के लिए सीमा को दिखाया गया है पुनरावृत्ति करना। बहरहाल, यह ऑक्सीजन तनाव पर सह संस्कृतियों को बनाए रखने के तीन लयूकेमिक उप-जनसंख्या की स्थापना के लिए गंभीर नहीं है और प्रयोगशाला के विवेक पर है।
  2. हर 4 वें दिन सभी लेकिन (निलंबन में leukemic कोशिकाओं सहित) मीडिया के 1 मिलीलीटर हटाने और 9 मिलीलीटर ताजा लयूकेमिक संस्कृति मीडिया के साथ बदलें। जब थाली से मीडिया के 9 मिलीलीटर हटाने, सावधान BMSC या ओबी पक्षपाती परत को परेशान करने के लिए नहीं हो।
    1. प्लेट के कोने में पक्ष और महाप्राण मीडिया के लिए थाली झुकने से मीडिया निकालें। साथ ही, जब ताजा मीडिया जोड़ने, BMSC या ओबी पक्षपाती परत की न्यूनतम विघटन को सुनिश्चित करने के लिए ड्रॉप sidewall के खिलाफ प्लेट के कोने में बुद्धिमान जोड़ने के लिए सुनिश्चित हो।
  3. सह संस्कृति के 12 वें दिन के बाद, और पकवान से संस्कृति मीडिया pipetting नीचे धीरे पकवान पर लगभग 5 से 10 गुना से BMSC या ओबी परत से leukemic कोशिकाओं कुल्ला और फिर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा। नए 80% -90% मिला हुआ BMSC या ओबी थाली पर Reseed 2.1 चरण में वर्णित है।
    नोट: सह संस्कृति की कोमल rinsing 2.3 कदम BMSC या ओबी monolayer बाधा पहुँचा के बिना एस और पंजाब leukemic कोशिकाओं को हटा देगा में वर्णित है। यह केवल ट्यूमर कोशिकाओं अगले सह-संस्कृति की थाली को हस्तांतरित करने की अनुमति देता है। यह 12 दिन के चक्र के रूप में उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर जरूरत के रूप में कई बार दोहराया जा सकता है।

3. तैयारी G10 मनका कॉलम

नोट: बाँझ बहाव के विश्लेषण या संवर्धन G10 स्तंभ जुदाई के बाद आवश्यक है निम्नलिखित कदम बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए और G10 कॉलम एक बाँझ जैविक हुड में सेटअप होना चाहिए।

  1. प्री-वाआरएम सेल संस्कृति मीडिया नहाने के पानी में 37 डिग्री सेल्सियस (~ स्तंभ प्रति 30 मिलीलीटर)। एक 10 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज का प्रयोग, हटाने और सवार त्यागें। सिरिंज के लिए कांच ऊन जोड़ें।
  2. चिमटी का प्रयोग, पतली ढीला किस्में में कांच ऊन अलग खींच। जब तक सिरिंज का 2/3 कांच ऊन से भर जाता है सिरिंज को हल्के से खचाखच भरे कांच ऊन की कई परतों जोड़ें।
    ध्यान दें: कांच ऊन लयूकेमिक सेल संग्रह contaminating से ढीला G10 कणों को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि कांच ऊन G10 कणों का समर्थन करने के लिए पर्याप्त पैक किया जाता है, लेकिन बहुत घनी कॉलम के माध्यम से मीडिया प्रवाह को ब्लॉक करने के लिए पैक नहीं करें।
  3. बंद की स्थिति में सिरिंज की नोक के लिए 1-जिस तरह से पानी निकलने की टोंटी संलग्न।
  4. अंगूठी को दबाना सिरिंज स्तंभ पर्याप्त उच्च खड़े हो तो एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (संग्रह ट्यूब) पानी निकलने की टोंटी के नीचे रखा जा सकता है। सिरिंज कॉलम के तहत संग्रह ट्यूब रखें।
  5. एक 10 मिलीलीटर पिपेट, जोड़, G10 कणों के शीर्ष पर स्तंभ के लिए पीबीएस में resuspended ड्रॉप-वार का उपयोगकांच ऊन। एक ~ 2 मिलीलीटर गोली तक G10 कणों को जोड़ने कांच ऊन के शीर्ष पर G10 कणों रूपों में से (के रूप में सिरिंज पर graduations द्वारा मापा) जारी रखें।
  6. पूर्व गर्म मीडिया के साथ G10 स्तंभ संतुलित करना।
    1. स्तंभ के लिए पूर्व गर्म मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें। ओपन पानी निकलने की टोंटी वाल्व धीरे-धीरे इतना है कि मीडिया स्तंभ के बाहर ड्रॉप के लिहाज से बहती है।
    2. पूर्व गर्म मीडिया के 10 मिलीलीटर की कुल जब तक दोहराएँ कदम 3.6.1 कॉलम भर में भाग गया है।
      नोट: G10 कणों संग्रह ट्यूब के माध्यम से प्रवाह में देखा जाता है, या तो 1) अधिक G10 कणों जोड़ते हैं, तो यकीन है कि कोई अतिरिक्त G10 कणों स्तंभ से भागने बनाने ~ 2 मिलीलीटर गोली बनाए रखने के लिए या 2) एक अप्रयुक्त एक और दोहराने के साथ कॉलम की जगह 3.4-3.6.1 कदम।
    3. स्तंभ से पूर्व गर्म मीडिया नालियों के बाद, पानी निकलने की टोंटी को बंद करने और के माध्यम से प्रवाह के साथ संग्रह ट्यूब त्यागें। स्तंभ के अंतर्गत नया संग्रह ट्यूब जोड़ें। स्तंभ मीडिया + सेल मिश्रण के साथ लोड किया जा करने के लिए तैयार है।
      नोट: कॉलमतुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिए और सूखे के लिए अनुमति नहीं है।

4. सह संस्कृति के भीतर 3 उप-जनसंख्या को अलग

  1. निलंबन (एस) ट्यूमर उप-जनसंख्या का संग्रह।
    1. विंदुक के साथ और धीरे सह-संस्कृति की थाली से महाप्राण मीडिया प्लेट कुल्ला और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में लयूकेमिक कोशिकाओं से युक्त मीडिया इकट्ठा करने के लिए एक ही मीडिया को फिर से लागू होते हैं। लयूकेमिक एकत्र कोशिकाओं एस उप-जनसंख्या कर रहे हैं।
  2. चरण ब्राइट (पंजाब) ट्यूमर उप-जनसंख्या का संग्रह।
    1. 10 मिलीलीटर ताजा मीडिया वापस सह संस्कृति थाली पर जोड़ें। ऊपर और नीचे लगभग 5 गुना जोड़ा मीडिया pipetting पक्षपाती leukemic कोशिकाओं लेकिन मुश्किल पक्षपाती BMSC / ओबी घटक को बेदखल करने के लिए पर्याप्त नहीं दूर करने के लिए सख्ती से कुल्ला।
    2. विंदुक के साथ महाप्राण और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मीडिया इकट्ठा। एकत्र कोशिकाओं पंजाब उप-जनसंख्या कर रहे हैं।
  3. चरण मंद (पीडी) ट्यूमर उप-जनसंख्या का संग्रह।
    1. 1 मिलीलीटर रेम के लिए पीबीएस के साथ कुल्ला प्लेटove शेष मीडिया। 37 5 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 3 मिलीग्राम trypsin और जगह के साथ Trypsinize सह-संस्कृति की थाली।
    2. प्लेट इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और धीरे पक्षपाती BMSC / ओबी को बेदखल करने के लिए थाली के किनारों पर टैप करें।
    3. 1 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पिपेट ऊपर और नीचे 3-5 बार के अलावा बड़े सेल समुच्चय तोड़ने के लिए जोड़ें।
    4. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं के साथ मीडिया लीजिए। इन कोशिकाओं को BMSC / ओबी के साथ unpurified पीडी उप-जनसंख्या के रूप में अच्छी तरह से कर रहे हैं।
  4. अपकेंद्रित्र 3 से 7 मिनट के लिए 400 XG पर पृथक उप-जनसंख्या। महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें तो व्यक्तिगत रूप से 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म मीडिया में छर्रों resuspend। प्रकोष्ठों एक G10 स्तंभ पर लोड करने के लिए तैयार हैं।

5. लोड हो रहा है सह संस्कृति G10 स्तंभ पर प्रकोष्ठों

नोट: सुनिश्चित करें कि पानी निकलने की टोंटी बनाने के लिए पूरी तरह से G10 स्तंभ के लिए मीडिया से युक्त कोशिकाओं को जोड़ने से पहले बंद कर दिया है। इसके अलावा, प्रत्येक उप-जनसंख्या introduc के लिए एक अलग G10 स्तंभ पर भाग जाना चाहिए ताकि नहींबहाव के विश्लेषण में आबादी के बीच किसी भी पूर्वाग्रह ई।

  1. एक 1000 μl विंदुक का प्रयोग, बूंद के लिहाज से एक अलग G10 स्तंभ के लिए पूर्व गर्म मीडिया में प्रत्येक कक्ष के उप-जनसंख्या के 1 मिलीलीटर जोड़ें। सुनिश्चित करें कि मीडिया कोशिकाओं से युक्त शीर्ष पर या G10 गोली के भीतर रहता है। कोशिकाओं आरटी पर 20 मिनट के लिए G10 गोली पर सेते दें।
    नोट: पानी निकलने की टोंटी ऊष्मायन की अवधि के लिए बंद रहता है।

6. G10 स्तंभ से leukemic कोशिकाओं का संग्रह

  1. प्रत्येक स्तंभ के लिए G10 1-3 मिलीलीटर पूर्व गर्म मीडिया जोड़ें। ओपन पानी निकलने की टोंटी वाल्व और मीडिया धीरे-धीरे स्तंभ बूंद के लिहाज से बाहर निकलने के लिए अनुमति देते हैं।
    नोट: यह स्तंभ या G10 BMSC / ओबी युक्त स्तंभ के बाहर धोने और पृथक leukemic कोशिकाओं को दूषित कर सकते हैं गोली से एक धीमी गति से प्रवाह की दर को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. 15 से 20 मिलीलीटर की कुल तक G10 स्तंभ के लिए छोटे वेतन वृद्धि (1-2 मिलीलीटर) में पूर्व गर्म मीडिया जोड़ने के लिए जारी कॉलम के माध्यम से चला गया है और एकत्र किया गया है। बंद पानी निकलने की टोंटी VALVE और टोपी संग्रह ट्यूब।
    नोट: एक G10 कण गोली संग्रह ट्यूब के नीचे देखा जाता है, तो धीरे ट्यूब G10 कण गोली अबाधित और नया ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण छोड़ने से मीडिया को दूर।
  3. अपकेंद्रित्र आरटी पर 7 मिनट के लिए 400 XG पर मीडिया एकत्र। तैरनेवाला निकालें और बफर बहाव के आवेदन के लिए उपयुक्त में सेल गोली resuspend।
  4. कोशिकाओं को अब लयूकेमिक BMSC या ओबी प्रदूषण से मुक्त कोशिकाओं का एक शुद्ध आबादी रहे हैं और उपयोगकर्ता के विवेक पर बहाव के अनुप्रयोगों के लिए लागू किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं।
    नोट: लयूकेमिक सेल व्यवहार्यता जब G10 कॉलम के माध्यम से कोशिकाओं से गुजर रहा अपरिवर्तित रहना चाहिए।

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Representative Results

सफल सेटअप और इस सह संस्कृति मॉडल की संस्कृति पक्षपाती BMSC या ओबी monolayer के सापेक्ष leukemic कोशिकाओं के 3 उप-जनसंख्या की स्थापना में परिणाम होगा। चित्रा 1 से पता चलता है कि कैसे सभी कोशिकाओं को एक BMSC monolayer में वरीयता प्राप्त शुरू में ही निलंबित कर दिया की एक भी आबादी दिखाई leukemic कोशिकाओं। 4 दिन leukemic कोशिकाओं BMSC के साथ बातचीत leukemic कोशिकाओं के 3 स्थानिक उप-जनसंख्या के रूप में करने के पाठ्यक्रम पर (निलंबित (एस), चरण उज्ज्वल (पंजाब), और चरण मंद (पीडी))। ट्यूमर कोशिकाओं के 3 उप-जनसंख्या सामान्यतः BMSC या ओबी के साथ सह-संस्कृति के 24 घंटे के बाद देखा जा सकता है जब तक हम संस्कृति सह 4 दिनों के लिए कोशिकाओं पूर्ण गतिशीलता और leukemic कोशिकाओं और BMSC / ओबी कोशिकाओं के बीच बातचीत जगह लेने के लिए अनुमति देने के लिए किसी भी हेरफेर या प्रयोग से पहले जगह लेता है (चित्रा 1)। इसके अलावा, ध्यान दें कि हम अस्थि मज्जा शरीर क्रिया विज्ञान पुनरावृत्ति करने के लिए 5% की एक ऑक्सीजन तनाव पर सह संस्कृतियों को बनाए रखने, जो मधुमक्खी हैn 1% -7% 16-18 से लेकर को सूचना दी।

बहाव के विश्लेषण का एक विशाल बहुमत BMSC या ओबी से leukemic कोशिकाओं की जुदाई की आवश्यकता है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए हम leukemic कोशिकाओं (2A चित्रा) की एक शुद्ध आबादी फसल के लिए G10 कॉलम का उपयोग करें। BMSC और पीडी REH कोशिकाओं के trypsinization के बाद एक मिश्रित आबादी से फ्लो द्वारा दो अलग-अलग आगे / पक्ष आबादी (चित्रा 2 बी, शीर्ष पैनल) द्वारा देखा जाता है। G10 जुदाई केवल REH सभी कोशिकाओं का एक शुद्ध आबादी के बाद बरामद किया है, जो आगे / ओर तितर बितर प्रवाह cytometry (चित्रा 2 बी, नीचे पैनल) द्वारा पुष्टि की गई।

इस सह संस्कृति मॉडल और 3 उप-जनसंख्या से leukemic कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए जब BMSC या ओबी के साथ सह-संस्कृति में पक्षपाती BMSC या ओबी करने के लिए अपने स्थानिक स्थान रिश्तेदार के संबंध के साथ लयूकेमिक सेल phenotype से पूछताछ के लिए अनुमति देता है क्षमता का उपयोगmonolayer। खास रुचि है, कि सभी कोशिकाओं को एक BMSC या ओबी सह संस्कृति के पीडी आबादी से बरामद साइटोटोक्सिक कीमोथेरेपी प्रदर्शन के बाद कोई कोशिका मृत्यु के लिए छोटी है (चित्रा 3 ए, बी)।

आकृति 1
चित्रा 1. BMSC या ओबी प्रपत्र तीन स्थानिक आबादी के साथ सह संस्कृति में सभी कोशिकाओं। हमारी प्रयोगशाला अस्थि मज्जा microenvironment निकाली गई stromal कोशिकाओं (BMSC या ओबी) के साथ लयूकेमिक सेल बातचीत मॉडल करने के लिए इन विट्रो सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग करता है। सह-संस्कृति की स्थापना करने के लिए, leukemic कोशिकाओं (लाल) BMSC या ओबी (ब्लू), जो 'समय 0' के रूप में चिह्नित है के एक 80% -90% मिला हुआ monolayer पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। सह संस्कृतियों अस्थि मज्जा microenvironment की शर्तों लगभग 5% ऑक्सीजन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। Leukemic कोशिकाओं के रूप में जल्दी 24 घंटा के रूप में 3 उप-जनसंख्या के रूप में शुरू हो जाएगा, लेकिन पूरी बातचीत के लिए करने के लिए अनुमति देने के लिएआरएम हम सह संस्कृतियों 4 दिनों के प्रयोगों के लिए leukemic कोशिकाओं के उपयोग से पहले स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं। दिन 4 (सही पैनल) के द्वारा, leukemic कोशिकाओं के तीन उप-जनसंख्या पक्षपाती monolayer के संबंध में बनेगी। योजनाबद्ध (शीर्ष सही) और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी (नीचे सही) दिखाने निलंबित (एस) leukemic कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से मीडिया में चल; चरण उज्ज्वल (पंजाब) leukemic कोशिकाओं जो BMSC या ओबी monolayer की सतह का पालन कर रहे हैं; और चरण मंद (पीडी) लयूकेमिक कोशिकाओं है कि BMSC या ओबी monolayer के नीचे चले गए हैं। स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. G10 कॉलम का प्रयोग BMSC / ओबी से सभी कोशिकाओं के विभाजन के लिए अनुमति देता है। (ए) एक G10 कर्नल उपयोग करने की प्रक्रिया का प्रदर्शनUMN BMSC / ओबी सह संस्कृति से सभी कोशिकाओं को अलग करने के लिए नीचे की ओर विश्लेषण के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी को प्राप्त करने के लिए। बाएं से दाएं, सभी कोशिकाओं और BMSC / ओबी कोशिकाओं का एक मिश्रण G10 स्तंभ के शीर्ष करने के लिए जोड़ा जाता है; (बीच में) सेल मिश्रण G10 घोल में आदी हो जाएगा और 20 मिनट के लिए आरटी पर incubated किया जाना चाहिए (नोट: पानी निकलने की टोंटी पहले दो चरणों के दौरान बंद की स्थिति में है); (दाएं) leukemic कोशिकाओं पानी निकलने की टोंटी खोलने और पूर्व गर्म मीडिया के साथ स्तंभ rinsing द्वारा बरामद कर रहे हैं। (बी) के शीर्ष पैनल G10 जुदाई BMSC (नीला गेट) और REH युक्त सभी कोशिकाओं कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी (लाल फाटक है कि वहाँ पहले से पता चलता है ) आगे का मूल्यांकन द्वारा (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) विश्लेषण। नीचे पैनल, G10 जुदाई केवल REH का शुद्ध आबादी सभी कोशिकाओं (लाल गेट) 1% से कम stromal सेल संदूषण (ब्लू गेट) के साथ रहने के बाद। Thi का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें एस आंकड़ा।

चित्र तीन
चित्रा 3. पीडी leukemic कोशिकाओं कीमोथेरेपी प्रदर्शन करने के लिए प्रतिरोध में वृद्धि हुई है। एसडी 1 लयूकेमिक एक BMSC सह संस्कृति (ए) के पीडी आबादी से बरामद आरा-सी के लिए एक दिन में 4 प्रदर्शन के बाद कम हो व्यवहार्यता प्रदर्शित नहीं करते कोशिकाओं [1 माइक्रोन] , MTX [50 माइक्रोन के], या वीसीआर [25 माइक्रोन के], अनुपचारित नियंत्रण के समान (ध्यान दें कि आरा-सी की दूसरी खुराक 48 घंटा में जोड़ा स्थिरता की वजह से किसी भी दवा नुकसान के लिए खाते में करने के लिए)। अकेले मीडिया से leukemic कोशिकाओं, एस, और पंजाब की आबादी काफी कम कर दिया है व्यवहार्यता के रूप में trypan नीले exclusion.SD -1 leukemic कोशिकाओं ओबी कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत द्वारा निर्धारित व्यवहार्यता (बी) में इसी तरह के रुझान प्रदर्शित करते हैं। परिणाम ± SEM के मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। (*) पी <0.05, unpaired टी परीक्षण अनुपचारित नियंत्रण के सापेक्ष अर्थ।5fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कम से कम अवशिष्ट रोग (एमआरडी) जो रोग के पतन के लिए योगदान आक्रामक आग रोक के उपचार सभी में एक प्रमुख नैदानिक ​​चुनौती है, और साथ ही, अन्य hematological कैंसर के एक मेजबान होना जारी है। अस्थि मज्जा microenvironment सभी 3,8 में डूबने का सबसे आम साइट है। जैसे, मॉडल है कि अस्थि मज्जा microenvironment मॉडल कीमोथेरेपी प्रदर्शन के दौरान लयूकेमिक ट्यूमर सेल अस्तित्व और MRD के रखरखाव से संबंधित परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। जबकि माउस मॉडल का परीक्षण दवा प्रभावकारिता से संबंधित प्रश्नों के लिए सोने के मानक को परिभाषित, 2 डी सह संस्कृति परीक्षण परिकल्पना और लयूकेमिक सेल अस्तित्व की हड्डी कल microenvironment समर्थन से संबंधित दवा रणनीतियों के लिए एक लागत प्रभावी कार्यप्रणाली होना जारी है। कई समूहों BMSC साथ लयूकेमिक कोशिकाओं के सह संस्कृति से पता चला है या ओबी जब कीमोथेरेपी एजेंटों 9,10,12-14,19-21 के साथ चुनौती दी अस्तित्व का लाभ प्रदान करता है। काम मॉडलिंग सामान्य अपरिपक्व CD34 + हेमाmesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) के साथ सह-संस्कृति में topoietic कोशिकाओं है कि hematopoietic कोशिकाओं MSCS की पक्षपाती monolayer hematopoietic कोशिकाओं 22,23 के तीन अलग स्थानिक आबादी के लिए फार्म के साथ बातचीत करेंगे पता चला। परमाणु अप्रसार और CD34 + कोशिकाओं के भेदभाव सह संस्कृति 22 के भीतर अपने स्थान के सापेक्ष प्रभावित किया गया था। हम एक 2 डी सह संस्कृति के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं के एक प्रतिरोधी आबादी की अस्थि मज्जा microenvironment stromal सेल समर्थन और नीचे की ओर विश्लेषण के लिए अपने अलगाव से संबंधित सवालों का परीक्षण करने के लिए इस अवलोकन पर विस्तार किया है।

मानक 2 डी सह संस्कृति मॉडल जो आम तौर पर निलंबित कर दिया ट्यूमर को हटाने के द्वारा leukemic कोशिकाओं का नमूना के विपरीत, हमारे मॉडल से पता चलता है कि सह संस्कृति BMSC या ओबी फार्म के साथ सह संस्कृति में जो leukemic कोशिकाओं में एक और अधिक गतिशील बातचीत तीन उप-जनसंख्या के सापेक्ष BMSC का प्रतिनिधित्व करता है या ओबी monolayer (चित्रा 1)। ट्यूमर उप-जनसंख्या है कि फार्म निलंबित कर रहे हैं (एस) ट्यूमर, whiचर्चा स्वतंत्र रूप से मीडिया में तैर रही है; चरण उज्ज्वल (पंजाब) कि BMSC या ओबी की सतह का पालन किया जाता है; और चरण मंद (पीडी) जो BMSC या ओबी monolayer (चित्रा 1) के नीचे दफन कर दिया है। इस मॉडल में, हमने पाया है कि एक सख्त खिलाने और reseeding अनुसूची एक सह संस्कृति मॉडल में अनुरूप परिणाम प्राप्त करने और इसलिए हम 4 दिन के अंतराल पर सह संस्कृतियों को खिलाने के लिए और नए BMSC या ओबी monolayers ट्यूमर हस्तांतरण हर 12 दिनों के लिए महत्वपूर्ण है। जरूरत के रूप में इस विकल्प ट्यूमर प्रकार के संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या कि BMSC या ओबी नीचे की ओर पलायन होगा फार्म के लिए पीडी आबादी अलग leukemic कोशिकाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं। इस मॉडल की एक सीमा हो सकती है, जब पीडी ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या कम कर रही है यह मुश्किल नीचे की ओर विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए कर रहे हैं। कुछ मामलों में इस समस्या को दोहराने सह संस्कृतियों तीन अलग-अलग उप-जनसंख्या की पूलिंग के लिए अनुमति देने के लिए स्थापित करके दूर किया जा सकता है।

इस मॉडल के रूप में पुन:BMSC के साथ ट्यूमर सेल बातचीत पर झूठ या ओबी यह leukemic कोशिकाओं के विशिष्ट जीव विज्ञान को संबोधित करने के stromal सेल संक्रमण को दूर करने के लिए एक प्रभावी तरीका है करने के लिए महत्वपूर्ण है। ट्यूमर कोशिकाओं स्ट्रोमा से हम G10 कॉलम उपयोग के इस जुदाई पूरा करने के लिए। उचित स्थापना और इन स्तंभों के उपयोग के बहाव के विश्लेषण के लिए शुद्ध ट्यूमर आबादी के अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 2 बी, 99% से अधिक शुद्धता पर ट्यूमर कोशिकाओं की वसूली में G10 स्तंभ जुदाई परिणामों के समुचित निष्पादन में प्रकाश डाला है। यह परिणाम है कि stromal सेल संदूषण से नतीजा होगा की व्याख्या की जटिलता के बिना leukemic कोशिकाओं के बहाव के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। यह ध्यान रखें कि सभी लयूकेमिक प्रकार की कोशिकाओं है कि क्या सेल लाइनों या प्राथमिक रोगी के नमूने G10 कॉलम के माध्यम से पारित करने की क्षमता में थोड़ा भिन्न हो जाएगा महत्वपूर्ण है। बड़े पैमाने पर प्रयोग में उपयोग करने से पहले उन वे इनपुट वांछित राशि की जरूरत च ठीक करने के लिए करना चाहिए leukemic कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण करना चाहिएया उनकी विशिष्ट जरूरतों को नीचे की ओर। इसके अलावा, धोने मीडिया की राशि से अधिक भाग गया G10 स्तंभ पोस्ट ऊष्मायन कोशिश करते हैं और बरामद कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। देखभाल के लिए बीमा है कि अतिरिक्त washes जो कोशिकाओं की गिनती द्वारा पोस्ट धो निर्धारित किया जा सकता है या के माध्यम से प्रवाह के प्रवाह cytometry विश्लेषण stromal सेल संदूषण का कारण नहीं है लिया जाना चाहिए।

इस मॉडल स्थापित करने में, हमने देखा है कि लयूकेमिक पीडी आबादी से बरामद कोशिकाओं जब कीमोथेरेपी साइटोटोक्सिक से अवगत कराया हम अकेले हैं, साथ ही एक ही सह संस्कृति में एस या पीबी आबादी से बरामद उन लोगों के लिए मीडिया में उगाई लयूकेमिक कोशिकाओं की तुलना में वृद्धि हुई है व्यवहार्यता (चित्रा 3 एबी)। क्योंकि यह इन विट्रो में लयूकेमिक कोशिकाओं है कि कीमोथेरेपी से स्पष्ट संरक्षण प्राप्त की आबादी का प्रतिनिधित्व करता है यह महत्वपूर्ण है। यह सबसे प्रतिरोधी ट्यूमर आबादी है, जिसके द्वारा समर्थित है को निशाना बनाने के उद्देश्य से उपचार रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता हैअस्थि मज्जा microenvironment। इसके अलावा, क्योंकि इन leukemic कोशिकाओं को इतनी अच्छी तरह BMSC या ओबी सह संस्कृति द्वारा संरक्षित हैं यह इन विट्रो संयोजन उपचार रणनीतियों के लिए उत्तरदायी मीडिया में अकेला है, कि या मानक सह संस्कृति मॉडल के लिए प्रकट होता है या जो नहीं है पूरी तरह से ट्यूमर को मार डालेंगे प्रतिरोधी microenvironment समर्थित लयूकेमिक आबादी में देखा प्रभाव का हमेशा प्रतिनिधि।

अंत में, हमें विश्वास है कि इस मॉडल का उपयोग करते हैं, BMSC / ओबी के बीच बातचीत, और लयूकेमिक कोशिकाओं है कि कीमोथेरेपी उपचार के लिए प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार हैं में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं MRD के लिए नेतृत्व, और बाद में पलटा। यह मॉडल इन विट्रो प्रयोगों जो बेहतर बहाव के पूर्व नैदानिक ​​मॉडल सूचित करेंगे डिजाइन करने के लिए मंच प्रदान करता है। हालांकि हम इस मॉडल अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं और सभी ली गई leukemic कोशिकाओं के बीच बातचीत का परीक्षण करने का उपयोग दिखाने के लिए, हमें उम्मीद है कि भविष्य दिशाओं और इस मॉडल के आवेदनों हमें होंगेकैंसर की एक किस्म है जिसमें अस्थि मज्जा microenvironment कीमोथेराप्युटिक हस्तक्षेप के दौरान ट्यूमर के लिए अभयारण्य की एक साइट प्रदान करता है में eful।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
G10 sephadex beads Sigma G10120 Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe BD 309604
Glass wool Pyrex 3950
1-way stopcocks World Precision Instruments, Inc. 14054-10
50 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021039 Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021037 Used for cell collection
Fetal Bovine Serum Sigma F6178
0.05% Trypsin  Mediatech, Inc. 25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 664160
Culture media
Osteoblast culture media  PromoCell C-27001 For human osteoblast media 
RPMI 1640 media Mediatech, Inc. 15-040 For tumor media prepation 
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts PromoCell C-12720 Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. 
Human Bone Morrow Stromal Cells WVU Biospecimen Core De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH ATCC ATCC-CRL-8286 REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
SD-1 DSMZ ACC 366 SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.

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