Modelado Quimioterapia Leucemia resistente * These authors contributed equally

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Slone, W. L., Moses, B. S., Evans, R., Piktel, D., Martin, K. H., Petros, W., Craig, M., Gibson, L. F. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (108), e53645, doi:10.3791/53645 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Preparación Avanzada

  1. Preparación de partículas de dextrano del G-10.
    1. Preparar suspensión del G-10 mediante la adición de 50 ml de PBS 1x a 10 g de partículas del G-10. Mezclar por inversión y permitir que se asiente G10 de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
    2. El día del G10 separación en columna, aspirado de PBS a partir de partículas del G-10 se establecieron y añadir 50 ml de PBS. Mezclar por inversión. Repetir dos veces, añadiendo 50 ml de PBS a las partículas del G-10 se establecieron y se almacena a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
  2. El cultivo de BMSC y OB.
    1. Mantener tanto BMSC o OB a 37 ° C en 6% de CO 2 y cultivadas en placas de cultivo de tejido de 10 cm hasta que se alcanza 90% de confluencia.
    2. Trypsinize BMSC o células OB y ​​dividieron 1: 2 a nuevas placas de 10 cm. Las células se cultivan a estos estándares hasta que se necesite para leucémica co-cultivo.

2. Establecimiento y mantenimiento de co-cultura

  1. Añadir 5-20 x 10 6 células leucémicas in 10 ml de medio de cultivo específico de tumor sobre un 80% -90% de confluencia BMSC o placa OB.
    NOTA: Nuestro laboratorio mantiene co-cultivos a 37 ° C en 5% de O 2 recapitular mejor el microambiente de la médula ósea que se ha demostrado en un rango de 1% a 7% 16-18. Sin embargo, el mantenimiento de co-cultivos en esta tensión de oxígeno no es crítica para el establecimiento de las tres subpoblaciones leucémicas y es a discreción del laboratorio.
  2. Cada día eliminar todos menos 1 ml de medios de comunicación (incluyendo las células leucémicas en suspensión) y reemplazar con 9 ml de medio de cultivo fresco leucémica. Al retirar 9 ml de medio de la placa, tenga cuidado de no perturbar la capa adherente BMSC u OB.
    1. Retire los medios de comunicación por la inclinación de la placa de los medios de comunicación lateral y aspirado en la esquina de la placa. Además, cuando la adición de medio fresco, asegúrese de añadir gota a gota en la esquina de la placa contra la pared lateral para asegurar la mínima interrupción de la capa adherente BMSC u OB.
  3. Después de los 12 días de co-cultivo, enjuagar las células leucémicas de BMSC o capa OB pipeteando medios de cultivo de plato hacia arriba y abajo suavemente sobre el plato de aproximadamente 5 a 10 veces y luego recoger en 15 ml de tubo cónico. Sembrar de nuevo en la nueva -90% confluentes BMSC 80% o placa OB tal como se describe en el paso 2.1.
    NOTA: El suave aclarado de la co-cultivo como se describe en el paso 2.3 se eliminarán las células leucémicas S y PB sin perturbar la monocapa BMSC o OB. Esto permite que las células tumorales sólo para ser transferidos a la siguiente placa de co-cultivo. Este ciclo de 12 días se puede repetir tantas veces como sea necesario en base a las necesidades del usuario.

3. Preparación de las columnas G-10 del grano

NOTA: Si se requiere el análisis de aguas abajo estéril o cultivo después de la separación la columna G-10 los siguientes pasos deben llevarse a cabo utilizando una técnica estéril y columnas del G-10 deben ser configurados en una campana biológica estéril.

  1. Pre-warm medios de cultivo celular a 37 ° C en baño de agua (~ 30 ml por columna). Usando una jeringa desechable de 10 ml, retirar y desechar émbolo. Añadir lana de vidrio para jeringa.
  2. Con unas pinzas, separar la lana de vidrio en hebras sueltas delgadas. Añadir múltiples capas de lana de vidrio ligeramente lleno a la jeringa hasta 2/3 de la jeringa se llena con lana de vidrio.
    NOTA: La lana de vidrio es crucial para evitar que las partículas sueltas del G-10 se contamine la colección de células leucémicas. Asegúrese de que la lana de vidrio está llena lo suficiente para mantener las partículas del G-10, pero no demasiado densamente poblada por los medios de comunicación para bloquear el flujo a través de la columna.
  3. Adjuntar 1-way llave de paso para la punta de la jeringa en la posición cerrada.
  4. columna jeringa pinza de anillo de pie alto lo suficiente para un tubo cónico de 50 ml (tubo de recogida) se puede colocar debajo de la llave de paso. Colocar el tubo de recogida en la columna de la jeringa.
  5. Usando una pipeta de 10 ml, añadiendo, gota a gota, partículas del G-10 se volvieron a suspender en PBS a la columna en la parte superior dela lana de vidrio. Continuar añadiendo partículas del G-10 hasta que un ml de pellets ~ 2 (medido por las graduaciones de la jeringa) de partículas del G-10 formas en la parte superior de la lana de vidrio.
  6. Equilibrar la columna G-10 con los medios de pre-calentado.
    1. Añadir 2 ml de medio precalentado a la columna. Abrir la llave de paso de la válvula lentamente para que los medios de comunicación fluye de la columna gota a gota.
    2. Repita el paso 3.6.1, hasta un total de 10 ml de medio precalentado han sido corrió a través de la columna.
      NOTA: Si las partículas del G-10 se ven en el flujo a través en el tubo de recogida, ya sea 1) añadir más partículas del G-10 para mantener ~ 2 ml pellet asegurándose no hay partículas adicionales G10 escapar de la columna o 2) Sustituir la columna con un uno sin usar y de repetición 3.4-3.6.1 pasos.
    3. Después de que los desagües de los medios precalentado a partir de la columna, cerrar la llave de paso y desechar el tubo de recogida a través del flujo. Añadir un nuevo tubo de recogida en la columna. Columna está listo para ser cargado con los medios de mezcla de células +.
      Nota: Las columnasdebe utilizarse inmediatamente y no se deja secar.

4. La separación de 3 subpoblaciones dentro de Co-cultura

  1. Colección de subpoblación de suspensión (S) tumor.
    1. Aspirar los medios de placa de co-cultivo con una pipeta y suavemente volver a aplicar los mismos medios para enjuagar la placa y recoger un medio que contiene células leucémicas en un tubo cónico de 15 ml. Las células leucémicas recogidos son la subpoblación S.
  2. Colección de la Fase brillante (PB) subpoblación de tumores.
    1. Añadir 10 ml de medio fresco de nuevo en la placa de co-cultivo. Enjuague vigorosamente con la pipeta medios añadidos arriba y hacia abajo aproximadamente 5 veces para eliminar las células leucémicas adherentes, pero no lo suficiente para desalojar adherente BMSC / OB componente.
    2. Aspirar con la pipeta y recoger los medios de comunicación en un tubo cónico de 15 ml. Las células recogidas son la subpoblación PB.
  3. Colección de la Fase Dim (PD) subpoblación de tumores.
    1. placa de enjuague con 1 ml de PBS a REMresiduos de medios de ove. Trypsinize placa de co-cultivo con 3 ml de tripsina y el lugar en incubadora a 37ºC durante 5 min.
    2. Retire la placa de la incubadora y golpear suavemente lados de la placa para desalojar adherente BMSC / OB.
    3. Añadir 1 ml de suero bovino fetal (FBS) y la pipeta arriba y abajo 3-5 veces para romper los grandes agregados celulares.
    4. Recoger los medios de comunicación con las células en un tubo cónico de 15 ml. Estas células son la subpoblación PD no purificada con BMSC / OB también.
  4. Centrífuga 3 subpoblaciones aisladas a 400 xg durante 7 minutos. Aspirar y desechar el sobrenadante luego volver a suspender de forma individual gránulos en 1 ml de medio precalentado. Las células están listas para ser cargado en una columna de G10.

5. Carga de co-cultivo de células en la columna G-10

NOTA: Asegúrese de que la llave de paso está completamente cerrado antes de añadir las células que contienen los medios de comunicación a la columna G-10. Además, cada subpoblación debe ser corrió por una columna G10 separada a fin de no introe cualquier sesgo entre las poblaciones en el análisis de aguas abajo.

  1. Con una pipeta de 1.000 l, añadir 1 ml de cada una subpoblación de células en medios pre-calentado a una columna G-10 por separado, gota a gota. Asegúrese de que los medios de comunicación que contiene las células se mantiene en la parte superior o dentro de pellets G10. Permitir que las células se incuban en pellet G10 durante 20 min a RT.
    NOTA: Llave de paso se mantiene cerrado por la duración de la incubación.

6. Recogida de las células leucémicas del G-10 Columna

  1. Añadir 1-3 ml de medio precalentado a cada columna G-10. Abrir la llave de paso de la válvula y permitir que los medios para salir lentamente gota a gota la columna.
    NOTA: Es fundamental mantener una tasa de flujo lento de la columna o el sedimento que contiene G10 BMSC / OB puede lavar fuera de la columna y contaminar las células leucémicas aisladas.
  2. Continuar añadiendo medios de pre-calentado en incrementos pequeños (1-2 ml) a la columna G-10, hasta un total de 15 a 20 ml se ha ejecutado a través de la columna y se ha recogido. Cerrar la llave de paso VAlve tubo de recogida y la tapa.
    NOTA: Si un pellet de partículas G10 se ve en la parte inferior del tubo de recogida, los medios de comunicación eliminar suavemente del tubo dejando pellet de partículas G10 no perturbado y la transferencia a un nuevo tubo.
  3. Centrifugar recogió el medio a 400 xg durante 7 min a TA. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en tampón apropiado para la aplicación de aguas abajo.
  4. Las células son ahora una población pura de células leucémicas libres de BMSC o contaminación OB y ​​están listos para ser aplicados a las aplicaciones posteriores a discreción del usuario.
    NOTA: la viabilidad celular leucémica debe permanecer sin cambios cuando pasa a las células a través de columnas del G-10.

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Representative Results

La configuración correcta y la cultura de este modelo de co-cultivo se traducirá en el establecimiento de 3 subpoblaciones de células leucémicas en relación con el adherente BMSC o OB monocapa. La Figura 1 muestra cómo todas las células sembradas en una monocapa BMSC aparecen inicialmente como una única población de suspendido células leucémicas. En el transcurso de 4 días las células leucémicas interactúan con el BMSC para formar 3 subpoblaciones espacial de las células leucémicas (suspendido (S), brillante fase (PB), y tenue de fase (PD)). Mientras que los 3 subpoblaciones de células tumorales habitualmente se pueden ver después de 24 horas de co-cultivo con BMSC u obstetra que co-cultivar las células durante 4 días para permitir que toda la dinámica y las interacciones entre las células leucémicas y BMSC células / OB se lleven a cabo antes de cualquier manipulación o la experimentación se lleva a cabo (Figura 1). Además, tenga en cuenta que mantener los co-cultivos en una tensión de oxígeno del 5% de recapitular la fisiología de la médula ósea, que tiene la abejan informó en un rango de 1% -7% 16-18.

Una gran mayoría de los análisis de aguas abajo requiere la separación de las células leucémicas de la BMSC o OB. Para lograr esto usamos las columnas G-10 para cosechar una población pura de células leucémicas (Figura 2A). Después de tripsinización de las células BMSC y PD REH una población mixta es visto por dos poblaciones de avance / secundarios distintos por citometría de flujo (Figura 2B, panel superior). Después de la separación del G-10 una población pura de sólo REH TODAS las células se recupera, lo cual fue confirmado por el delantero / parte de dispersión citometría de flujo (Figura 2B, panel inferior).

El uso de este modelo de co-cultivo y la capacidad de aislar las células leucémicas de 3 subpoblaciones cuando en co-cultivo con BMSC u OB permite la interrogación del fenotipo de células leucémicas con relación a su localización espacial en relación con el BMSC adherentes u OBmonocapa. De particular interés, es que todas las células se recuperaron de la población PD de un BMSC u OB co-cultivo tienen poca o ninguna muerte celular después de la exposición a la quimioterapia citotóxica (Figura 3A, B).

Figura 1
Figura 1. Todas las células co-cultivo con BMSC u OB forman tres poblaciones espaciales. Nuestro laboratorio utiliza un sistema de co-cultivo in vitro para modelar las interacciones de células leucémicas con células estromales derivadas del microambiente de la médula ósea (BMSC o OB). Para establecer el co-cultivo, las células leucémicas (rojo) se siembran en un -90% monocapa confluente 80% de BMSC u OB (azul), que se denota como Tiempo 0 '. Los co-cultivos se mantienen a 37 ° C en 5% de oxígeno para aproximarse a las condiciones del microambiente de la médula ósea. Las células leucémicas se empiezan a formar 3 subpoblaciones tan pronto como 24 horas, pero para permitir interacciones completas para FOrm permitimos co-cultivos de 4 días para establecer antes de utilizar las células leucémicas para los experimentos. Por día 4 (paneles de la derecha), tres subpoblaciones de células leucémicas se forman en relación con la monocapa adherente. El esquema (arriba a la derecha) y la microscopía de contraste de fase (abajo a la derecha) muestran la suspensión (S) células leucémicas de libre flotación en los medios de comunicación; brillante de fase (PB) células leucémicas que se adhieren a la superficie de la monocapa o BMSC OB; y los tenue de fase (PD) células leucémicas que han migrado por debajo de la monocapa BMSC u OB. La barra de escala representa 10 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. El uso de columnas G-10 permite la separación de todas las células de BMSC / OB. (A) Demostración de el proceso de usar un col G10UMN en separar las células del BMSC / OB co-cultivo para conseguir una población pura de células tumorales para el análisis de aguas abajo. De izquierda a derecha, se añade una mezcla de todas las células y las células OB / BMSC a la parte superior de la columna de G-10; (Center) mezcla de células se asentará en la suspensión G10 y debe ser incubó a TA durante 20 min (nota: la llave de paso está en la posición cerrada a lo largo de dos primeros pasos); (derecha) de las células leucémicas se recuperan mediante la apertura de la llave de paso y lavar la columna con los medios de pre-calentado. (B) El panel superior muestra antes de la separación del G-10 que existe una población mixta de células que contienen BMSC (puerta azul) y REH Todas las casillas (puerta roja ) mediante la evaluación hacia adelante (FSC) y dispersión lateral () análisis de la CSS. Panel inferior, después de la separación del G10 sólo a la población pura de células (REH TODAS puerta roja) se mantienen con la contaminación por menos del 1% de células del estroma (puerta azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de thi s figura.

figura 3
Figura 3. PD células leucémicas tienen mayor resistencia a la exposición a la quimioterapia. 1 SD-células leucémicas recuperados de la población PD de un co-cultivo BMSC (A) no muestran reducción de la viabilidad después de una exposición de 4 días a Ara-C [1 M] , MTX [50 mM], o VCR [25 mM], similar a los controles no tratados (tenga en cuenta que una segunda dosis de Ara-C añadió a 48 hr para dar cuenta de cualquier pérdida de fármaco debido a la estabilidad). Las células leucémicas de los medios por sí solos, las poblaciones de S, y PB han reducido significativamente la viabilidad determinada por azules exclusion.SD-1 en las células leucémicas de tripano co-cultivadas con células OB mostrar tendencias similares en la viabilidad (B). Los resultados se expresan como media ± SEM. (*) Indica p <0,05, prueba de la t no apareado-relación con los controles no tratados.5fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

enfermedad mínima residual (MRD) que contribuye a la recaída de la enfermedad sigue siendo un importante reto clínico en el tratamiento de refractario agresivo ALL, así como, una serie de otras enfermedades malignas hematológicas. El microambiente de la médula ósea es el sitio más común de recidiva en TODA 3,8. Como tal, los modelos que modelan el microambiente de la médula ósea son herramientas vitales para poner a prueba hipótesis relacionadas con la supervivencia de las células tumorales de leucemia y mantenimiento de MRD durante la exposición a la quimioterapia. Mientras que los modelos de ratón definen el estándar de oro para las preguntas de pruebas relacionadas con la eficacia del fármaco, 2D co-cultivo continúa siendo una metodología rentable para probar hipótesis y estrategias de drogas relacionadas con el apoyo microambiente de la médula ósea de la supervivencia de las células leucémicas. Muchos grupos han demostrado que el co-cultivo de las células leucémicas con BMSC u OB proporciona una ventaja en la supervivencia cuando se enfrentan a los agentes de quimioterapia 9,10,12-14,19-21. modelado de trabajo normal CD34 + inmaduras hemacélulas topoietic en co-cultivo con células madre mesenquimales (MSC) reveló que las células hematopoyéticas interactuarán con la monocapa adherente de MSCs para formar tres poblaciones espaciales distintas de células hematopoyéticas 22,23. La proliferación y diferenciación de las células CD34 + se efectuó en relación con su ubicación dentro de la co-cultivo 22. Hemos ampliado en esta observación para poner a prueba las preguntas relacionadas con apoyo de células microambiente del estroma de la médula ósea de una población resistente de las células tumorales dentro de un co-cultivo 2D y su aislamiento para el análisis de aguas abajo.

A diferencia de los modelos 2D co-cultivo estándar que normalmente muestras de células leucémicas de la eliminación del tumor en suspensión, nuestro modelo muestra que el co-cultivo representa una interacción más dinámica en la que las células leucémicas en co-cultivo con BMSC o forma OB tres subpoblaciones con relación a la BMSC OB o monocapa (Figura 1). Las subpoblaciones de tumores que se forman se suspenden (S) del tumor, WHIch está flotando libremente en los medios de comunicación; fase brillante (PB) que se adhiere a la superficie de la BMSC o OB; y los tenue de fase (PD) que han enterrado debajo de la BMSC o monocapa OB (Figura 1). En este modelo, se encontró que una alimentación estricta y el horario resiembra es importante para lograr resultados consistentes en un modelo de co-cultivo y por lo tanto alimentar a los co-cultivos a intervalos de 4 dias y la transferencia del tumor a nuevas monocapas BMSC o OB cada 12 días. Esto puede requerir la modificación de los tipos de tumores alternativas según sea necesario. El número de células tumorales que migrarán por debajo de la BMSC o OB para formar la población PD puede variar entre diferentes células leucémicas. Esto puede ser una limitación del modelo, cuando el número de células tumorales con EP son bajos por lo que es difícil reunir suficientes células para el análisis de aguas abajo. En algunos casos este problema se puede superar mediante el establecimiento de replicar co-cultivos para permitir la puesta en común de los tres subpoblaciones individuales.

Como este modelo de reradica en la interacción de las células tumorales con el BMSC u OB es importante tener un método eficaz para eliminar la contaminación de células del estroma para hacer frente a la biología específica de las células leucémicas. Para llevar a cabo esta separación de células tumorales de estroma que utilizamos columnas G-10. La correcta configuración y el uso de estas columnas es crucial para el aislamiento de las poblaciones tumorales puros para el análisis de aguas abajo. Como se destaca en la Figura 2B, la ejecución correcta de los resultados de separación de la columna G-10 en la recuperación de las células tumorales en mayor que 99% de pureza. Esto permite el análisis aguas abajo de las células leucémicas sin complicación de la interpretación de los resultados que resultarían de contaminación de células del estroma. Es importante tener en cuenta que todos los tipos de células leucémicas si las líneas celulares o muestras de pacientes primarias pueden variar ligeramente en su capacidad para pasar a través de las columnas G-10. Antes de su uso en experimentos a gran escala los usuarios deben determinar el número de células leucémicas deben de entrada para recuperar la cantidad necesaria deseada fo sus necesidades aguas abajo específicos. Además, la cantidad de medios de lavado corrió sobre el poste de la columna de incubación G10 se puede aumentar para tratar de aumentar el número de células recuperadas. Se debe tener cuidado para asegurar que los lavados adicionales no causan contaminación de células del estroma que se puede determinar de lavado en profundidad de los recuentos de células o citometría de flujo análisis de flujo a través.

En el establecimiento de este modelo, se observó que las células leucémicas recuperados de la población PD han aumentado la viabilidad en comparación con las células leucémicas cultivadas en medio solo, así como a las recuperado de las poblaciones S o PB en el mismo co-cultivo cuando se expone a la quimioterapia citotóxica (Figura 3 AB). Esto es significativo, ya que representa una población de células leucémicas en vitro que se derivan protección pronunciada de la quimioterapia. Esto proporciona una herramienta útil para poner a prueba las estrategias de tratamiento dirigidas a la orientación de la población tumor más resistente, que es apoyado porel microambiente de la médula ósea. Además, debido a que estas células leucémicas están tan bien protegidos por el BMSC o OB co-cultivo es susceptible de estrategias de tratamiento, la combinación in vitro, que en medios solos o modelos de co-cultivo estándar parecerían o matarían completamente el tumor que no es siempre es representativa de los efectos observados en el microambiente apoyado poblaciones leucémicas resistentes.

Por último, creemos que el uso de este modelo puede proporcionar información valiosa sobre las interacciones entre las BMSC / OB, y las células leucémicas que son responsables de la resistencia a la quimioterapia, conducir a la ERM, y posteriormente una recaída. Este modelo proporciona una plataforma in vitro para diseñar experimentos que informar mejor a los modelos preclínicos aguas abajo. Aunque se muestra el uso de este modelo para probar las interacciones entre las células del estroma de la médula ósea y las células leucémicas TODAS derivados, tenemos la esperanza de que las futuras direcciones y aplicaciones de este modelo nos seráneful en una variedad de tumores malignos en los que el microambiente de la médula ósea proporciona un sitio de refugio para los tumores durante la intervención quimioterapéutica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
G10 sephadex beads Sigma G10120 Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe BD 309604
Glass wool Pyrex 3950
1-way stopcocks World Precision Instruments, Inc. 14054-10
50 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021039 Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021037 Used for cell collection
Fetal Bovine Serum Sigma F6178
0.05% Trypsin  Mediatech, Inc. 25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 664160
Culture media
Osteoblast culture media  PromoCell C-27001 For human osteoblast media 
RPMI 1640 media Mediatech, Inc. 15-040 For tumor media prepation 
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts PromoCell C-12720 Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. 
Human Bone Morrow Stromal Cells WVU Biospecimen Core De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH ATCC ATCC-CRL-8286 REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
SD-1 DSMZ ACC 366 SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.

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