Modeling Chemotherapie beständig Leukämie * These authors contributed equally

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Slone, W. L., Moses, B. S., Evans, R., Piktel, D., Martin, K. H., Petros, W., Craig, M., Gibson, L. F. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (108), e53645, doi:10.3791/53645 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Advanced Vorbereitung

  1. Vorbereiten Dextran G10 Partikel.
    1. Bereiten G10 Aufschlämmung durch Zugabe von 50 ml 1x PBS zu 10 g G10 Teilchen. Mischen durch Umdrehen und lassen G10 aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° CO / N zu regeln.
    2. Der Tag des G10-Säule Trennung absaugen PBS aus der ständigen G10-Partikel und 50 ml frischem PBS hinzufügen. Mischen durch Umdrehen. Zweimal wiederholen, Zugabe von 50 ml frischem PBS ständiger G10 Teilchen und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  2. Kultivieren BMSC und OB.
    1. Halten beide BMSC oder OB bei 37 ° C in 6% CO 2 und 10 cm-Gewebekulturplatten gezüchtet, bis 90% Konfluenz erreicht wird.
    2. Trypsinize BMSC oder OB-Zellen und spalten 1: 2 auf neue 10 cm-Platten. Die Zellen werden auf diese Normen herangezogen, bis für leukämische Co-Kultivierung benötigt wird.

2. Aufbau und Pflege einer Co-Kultur

  1. In 5-20 x 10 6 Leukämiezellen in 10 ml tumorspezifischen Kulturmedien auf einem 80% -90% konfluent BMSC oder OB Platte.
    HINWEIS: Unser Labor hält Co-Kulturen bei 37 ° C in 5% O 2, um besser die Knochenmark-Mikroumgebung rekapitulieren, die von 1% bis 7% auf einen Bereich 16-18 gezeigt ist. Doch bei diesem Sauerstoffspannung Kokulturen Aufrechterhaltung ist nicht kritisch für die Festlegung der drei Leukämie Subpopulationen und liegt im Ermessen des Labors.
  2. Jeden 4. Tag alle, aber 1 ml Medium (einschließlich leukämischen Zellen in Suspension) entfernen und mit 9 ml frisch Leukämiekulturmedien ersetzen. Beim Entfernen von 9 ml Medium von der Platte, sein nicht vorsichtig die BMSC oder OB haftende Schicht zu stören.
    1. Entfernen Sie das Medium durch Platte zur Seite und absaugen Medien in der Ecke der Platte zu kippen. Außerdem, wenn frisches Medium hinzufügen, achten Sie darauf, tropfenweise in die Ecke der Platte gegen die Seitenwand hinzuzufügen minimaler Unterbrechung des BMSC oder OB haftende Schicht zu gewährleisten.
  3. Nach dem 12. Tag der Co-Kultur, spülen Leukämiezellen von BMSC oder OB Schicht durch Pipettieren von Kulturmedien von Schale nach oben und unten leicht über der Schale etwa 5 bis 10 mal und dann in 15 ml konischen Röhrchen sammeln. Reseed auf neu 80% -90% konfluent BMSC oder OB Platte als 2,1 in Schritt beschrieben.
    HINWEIS: Die schonende Spülung der Co-Kultur wie in Schritt 2.3 wird S und PB leukämischen Zellen ohne Störung des BMSC oder OB-Monoschicht zu entfernen. Dies ermöglicht nur Tumorzellen auf die nächste Co-Kulturplatte überführt werden. Diese 12-Tage-Zyklus kann so oft wie erforderlich auf Bedürfnisse der Nutzer wiederholt werden.

3. Vorbereitung G10 Bead Columns

HINWEIS: Wenn sterile Downstream-Analyse oder die Kultivierung folgenden G10-Säule Trennung erforderlich ist, die folgenden Schritte steriler Technik zunutze machen sollten, und G10 Spalten sollte in einem sterilen biologischen Haube sein Setup durchgeführt.

  1. Pre-warm Zellkulturmedien auf 37 ° C in einem Wasserbad (~ 30 ml pro Säule). Mit einem 10-ml-Einwegspritze, zu entfernen und Kolben verwerfen. In Glaswolle Spritze.
  2. Mit einer Pinzette auseinanderziehen Glaswolle in dünne lose Stränge. In mehreren Schichten aus leicht verpackt Glaswolle an der Spritze, bis 2/3 der Spritze mit Glaswolle gefüllt ist.
    HINWEIS: Die Glaswolle ist entscheidend Verunreinigungen der Leukämiezell Sammlung lose G10 Partikel zu verhindern. Stellen Sie sicher, Glaswolle gepackt genug, um die G-10-Partikel zu unterstützen, aber nicht zu dicht gepackten Medienstrom durch die Säule zu blockieren.
  3. Bringen 1-Wege-Hahn auf die Spitze der Spritze in die geschlossene Position.
  4. Clamp Spritze Spalte Ring stehen hoch genug, so eine 50 ml konischen Röhrchen (Sammelrohr) kann unter Absperrhahn platziert werden. Zeigen Sammelröhrchen unter Spritze Spalte.
  5. Mit einem 10 ml-Pipette hinzufügen, tropfenweise, Partikel G10 in PBS auf die Säule oben aufdie Glaswolle. Fügen Sie weitere G10 Partikel bis zu einem ~ 2 ml Pellet aus G10-Teilchen bildet sich auf der Oberseite des Glaswolle (wie von Abstufungen auf die Spritze gemessen).
  6. Gleichgewicht kommen die G-10-Säule, die mit vorgewärmten Medien.
    1. 2 ml vorgewärmten Medien Spalte. Offene Absperrventil langsam, so dass Medien fließt aus der Spalte tropft.
    2. Wiederholen Sie Schritt 3.6.1 bis insgesamt 10 ml vorgewärmtes Medium wurden über die Säule lief.
      HINWEIS: Wenn G10 Partikel in der Strömung durch die Sammelrohr gesehen werden, entweder 1) mehr G10-Partikel in den halten ~ 2 ml Pellet dafür, dass keine zusätzlichen G10 Partikel aus der Kolonne entweichen oder 2) ersetzen Säule mit einem unbenutzten ein und wiederholen Schritte 3.4-3.6.1.
    3. Nach den vorgewärmten Medien Abflüsse aus der Säule, den Wasserhahn schließen und Sammelrohr mit Fluss durch verwerfen. Hinzufügen neuer Sammelröhrchen unter Spalte. Spalte ist bereit, mit Medien + Zellgemisch geladen werden.
      HINWEIS: Spaltensofort und nicht erlaubt sollten zum Trocknen verwendet werden.

4. Die Trennung 3 Subpopulationen in Co-Kultur

  1. Sammlung von Suspension (S) Tumor Subpopulation.
    1. Absaugen Medien von Co-Kulturplatte mit Pipette und sanft wieder gelten die gleichen Medien, um die Platte zu spülen und Medien, die Leukämiezellen in einem 15 ml konischen Röhrchen sammeln. Die Leukämiezellen gesammelt sind die S-Subpopulation.
  2. Sammlung von Phase Bright (PB) Tumor Subpopulation.
    1. 10 ml frisches Medium wieder auf Co-Kulturplatte. Spülen Sie kräftig durch hinzugefügte Medien Auf- und Abpipettieren etwa 5 mal haftLeukämieZellen zu entfernen, aber nicht hart genug haft BMSC / OB Komponente zu entfernen.
    2. Saugen Sie mit Pipette und sammeln Medien in einem 15 ml konischen Röhrchen. Die gesammelten Zellen sind die PB Subpopulation.
  3. Sammlung von Phase-Dim (PD) Tumor Subpopulation.
    1. Rinse-Platte mit 1 ml PBS zu remove Stoffreste. Trypsinize Co-Kulturplatte mit 3 ml Trypsin und Ort in 37 ° C Inkubator für 5 min.
    2. Entfernen Platte von Inkubator und sanft tippen Seiten der Platte haft BMSC / OB zu entfernen.
    3. 1 ml fötales Rinderserum (FBS) und Pipette auf und ab 3-5 mal abgesehen große Zellaggregate zu brechen.
    4. Sammeln Medien mit Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Diese Zellen sind das ungereinigte PD Subpopulation mit BMSC / OB als auch.
  4. Zentrifuge 3 Subpopulationen bei 400 g für 7 min isoliert. Saugen und Überstand verwerfen dann individuell resuspendieren Pellets in 1 ml vorgewärmten Medien. Zellen sind bereit, auf einer G10-Säule geladen werden.

5. Laden Co-Kulturzellen auf G10-Säule

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Hahn wird vor der Zugabe von Medien, die Zellen zu G10-Säule vollständig geschlossen. Außerdem muss jede Unterpopulation über einen separaten G10-Säule lief, so nicht zu introducE keine Vorspannung zwischen Populationen in Downstream-Analyse.

  1. Mit einem 1000 ul Pipette, 1 ml von jeder Zell-Subpopulation in vorgewärmten Medien zu einem separaten G10-Säule tropft. Stellen Sie sicher, dass die Medien die Zellen bleibt an der Spitze oder innerhalb G10 Pellet enthält. Erlauben Zellen für 20 min bei RT auf G10 Pellet inkubiert.
    HINWEIS: Absperrhahn geschlossen bleibt für die Dauer der Inkubation.

6. Sammeln Leukämiezellen von G10-Säule

  1. In 1-3 ml vorgewärmt Medien zu den G-10-Säule. Offene Absperrventil und erlauben Medien die Spalte tropfenweise langsam zu beenden.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine langsame Fließgeschwindigkeit aus der Säule oder der G10-Pellet, das BMSC / OB zu pflegen können aus der Säule zu waschen und die isolierten Leukämiezellen kontaminieren.
  2. Weiter hinzuzufügen vorgewärmten Medien in kleinen Schritten (1-2 ml) auf G10-Säule, bis insgesamt 15 bis 20 ml hat durch die Säule laufen und gesammelt wurde. Absperrhahn schließen vaSammelröhrchen lve und Kappe.
    HINWEIS: Wenn ein G10 Partikel-Pellet am Boden des Sammelrohrs gesehen wird, sanft entfernen Medien aus dem Rohr verlassen G10 Partikel-Pellet ungestört und Übertragung auf neue Röhre.
  3. Zentrifuge gesammelt Medien bei 400 × g für 7 min bei RT. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet in Puffer geeignet für Folgeanwendungen.
  4. Die Zellen sind nun eine reine Population von Leukämiezellen frei von BMSC oder OB Kontamination und sind bereit, bei der Benutzer Ermessen zu Downstream-Anwendungen angewendet werden.
    HINWEIS: Leukämiezelllebensfähigkeit sollten unverändert bleiben, wenn die Zellen durch G10 Säulen vorbei.

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Representative Results

Erfolgreichen Aufbau und die Kultur dieser Co-Kultur-Modell wird bei der Errichtung von drei Subpopulationen von Leukämiezellen gegenüber dem haft BMSC oder OB-Monoschicht führen. Abbildung 1 zeigt, wie alle in einem BMSC Monoschicht ausgesät Zellen zunächst als nur eine einzige Population von suspendierten erscheinen Leukämiezellen. Im Laufe von 4 Tagen mit dem BMSC Leukämiezellen interagieren 3 Raum Subpopulationen von Leukämiezellen zu bilden (gesperrt (S), Phase hell (PB) und die Phase dim (PD)). Während die 3 Subpopulationen von Tumorzellen kann üblicherweise nach 24 h Co-Kultur mit BMSC oder OB sehen wir Co-Kultur, die Zellen für 4 Tage die volle Dynamik und Wechselwirkungen zwischen den Leukämiezellen und BMSC / OB-Zellen stattfinden kann vor jeglicher Manipulation oder Experimente stattfindet (Abbildung 1). Beachten Sie auch, dass wir die Co-Kulturen unter einem Sauerstoffdruck von 5% beibehalten Knochenmark Physiologie zu rekapitulieren, die Biene hatn gemeldet 16-18 von 1% -7% zu liegen.

Eine große Mehrheit der nachgeschaltete Analyse erfordert die Trennung der Leukämiezellen aus dem BMSC oder OB. Um dies zu erreichen verwenden wir Spalten G10 eine reine Population von Leukämiezellen (2A) zu ernten. Nach Trypsinisierung von BMSC und PD REH Zellen eine gemischte Bevölkerung wird durch zwei unterschiedliche Vor- / Seitenpopulationen mittels Durchflusszytometrie (2B, oberes Feld) zu sehen. G10 Trennung Nach einer reinen Population von nur REH ALL-Zellen gewonnen wird, die bestätigt wurde durch Vorwärts- / Seitwärtsstreuung Durchflusszytometrie (2B, Bodenplatte).

Verwendung dieser Co-Kulturmodell und die Fähigkeit, Leukämiezellen aus 3 Unterpopulationen zu isolieren, wenn in Co-Kultur mit BMSC oder OB zur Abfrage von Leukämiezell-Phänotyp ermöglicht, mit Bezug auf seine räumliche Lage relativ zum haft BMSC oder OBMonolayer. Von besonderem Interesse ist, dass alle aus der PD Bevölkerung gewonnenen Zellen eines BMSC oder OB Co-Kultur haben wenig bis gar keine Zelltod nach Exposition einer zytotoxischen Chemotherapie (3A, B).

Abbildung 1
Abbildung 1. ALL-Zellen in Co-Kultur mit BMSC oder OB Form drei Raumgruppen. Unser Labor verwendet eine In-vitro-Co-Kultursystem zu Leukämiezellinteraktionen mit Knochenmark-Mikroumgebung abgeleitet Stromazellen (BMSC oder OB) modellieren. Um festzustellen, Co-Kultur werden Leukämiezellen (Rot) ausgesät auf einem 80% -90% konfluenten Monolayer von BMSC oder OB (blau), die als "Zeit 0" bezeichnet ist. Co-Kulturen werden bei 37 ° C bei 5% Sauerstoff anzunähern Bedingungen der Knochenmarkmikroumgebung gehalten. Leukämiezellen beginnen drei Subpopulationen als 24 Stunden so früh zu bilden, aber für eine vollständige Interaktion zu ermöglichen, form wir Co-Kulturen 4 Tage ermöglichen, bevor Verwendung leukämischen Zellen für Experimente zu schaffen. Nach Tag 4 (rechte Felder), drei Subpopulationen von leukämischen Zellen in Bezug auf den anhaftenden Monoschicht bilden. Die schematische (oben rechts) und die Phasenkontrastmikroskopie (unten rechts) zeigen die aufgehängte (S) Leukämiezellen frei in den Medien schwimmt; Phase hell (PB) Leukämiezellen, die an der Oberfläche der BMSC oder OB Monolage eingehalten werden; und die Phasen dim (PD) Leukämiezellen, die unter der BMSC oder OB-Monoschicht gewandert sind. Maßstabsbalken entspricht 10 Mikrometer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Verwendung von G10-Säulen ermöglicht die Trennung aller Zellen von BMSC / OB. (A) Demonstration des Prozesses eine G10 col der VerwendungUMN zu trennen alle Zellen von BMSC / OB Co-Kultur eine reine Population von Tumorzellen für die nachfolgende Analyse zu erreichen. Von links nach rechts wird eine Mischung aller Zellen und BMSC / OB Zellen an die Spitze des G10-Säule hinzugefügt; (Zentrum) Zellgemisch wird in der G10 Aufschlämmung absetzen und sollte für 20 min bei RT inkubiert werden (Anmerkung: Der Hahn ist in der geschlossenen Position im gesamten ersten zwei Schritte); (rechts) Leukämiezellen gewonnen werden durch den Wasserhahn öffnen und Spülen Spalte mit vorgewärmten Medien. (B) Top-Panel zeigt vor G10 Trennung, dass es eine gemischte Population von Zellen enthält, BMSC (blaues Tor) und REH alle Zellen (rot Tor ) nach vorne Auswertung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Analyse. Bodenplatte nach G10 Trennung nur die reinen Population von REH ALL-Zellen (rot-Tor) bleiben mit weniger als 1% Stromazellen Verschmutzung (blaues Tor). Bitte hier klicken, um eine größere Version zu sehen thi Wert.

Abbildung 3
Abbildung 3. PD Leukämiezellen haben eine erhöhte Resistenz gegenüber Chemotherapie Exposition. SD-1 Leukämie gewonnenen Zellen aus der PD Bevölkerung eines BMSC Co-Kultur (A) nicht nach einer 4 Tage Exposition gegenüber Ara-C reduziert tragfähig [1 uM] MTX [50 uM] oder VCR [25 & mgr; M], ähnlich wie bei den unbehandelten Kontrollen (beachten Sie, dass eine zweite Dosis Ara-C in 48 Stunden hinzugefügt aufgrund Stabilität für jede Droge Verlust zu berücksichtigen). Leukämiezellen aus den Medien allein, S und PB Populationen Rentabilität deutlich reduziert, wie durch Trypanblau exclusion.SD-1 Leukämiezellen co-kultiviert mit OB-Zellen bestimmt zeigen ähnliche Trends in der Lebensfähigkeit (B). Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. (*) Kennzeichnet p <0,05; ungepaarter t-Test gegenüber unbehandelten Kontrollen.5fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Minimaler Resterkrankung (MRD), das mit Rückfall der Krankheit beiträgt wie vor eine große klinische Herausforderung bei der Behandlung von aggressiven refraktärer ALL, sowie eine Vielzahl von anderen hämatologischen Malignitäten zu sein. Das Knochenmark-Mikroumgebung ist die häufigste Lokalisation eines Rückfalls in ALLEN 3,8. Als solche Modelle, die das Knochenmark-Mikroumgebung sind wichtige Werkzeuge zu testen Hypothesen während der Chemotherapie Exposition gegenüber leukämischen Überleben von Tumorzellen und die Wartung von MRD modellieren. Während Mausmodellen der Goldstandard für die Prüfung Fragen der Arzneimittelwirksamkeit, weiterhin 2D-Co-Kultur im Zusammenhang definieren, um Knochen morgen Mikroumgebung Unterstützung von Leukämiezellüberleben im Zusammenhang zur Überprüfung von Hypothesen und Drogenstrategien eine kostengünstige Methode zu sein. Viele Gruppen haben gezeigt, dass Co-Kultur von Leukämiezellen mit BMSC oder OB stellt einen Überlebensvorteil gezeigt, wenn 9,10,12-14,19-21 mit Chemotherapeutika in Frage gestellt. Arbeits Modellierung normalen unreife CD34 + hematopoietic Zellen in Co-Kultur mit mesenchymalen Stammzellen (MSC) zeigte, dass hämatopoetischen Zellen mit der anhaftenden Monoschicht von MSCs interagieren 22,23 drei unterschiedliche räumliche Populationen hämatopoetischer Zellen zu bilden. Proliferation und Differenzierung der CD34 + -Zellen wurde in Bezug auf ihre Lage innerhalb der Co-Kultur 22 bewirkt. Wir haben auf dieser Beobachtung erweitert Fragen zu Mikroumgebung Stromazellen des Knochenmarks Unterstützung aus einem widerstandsfähigen Population von Tumorzellen in einem 2D-Co-Kultur und seiner Isolierung für Downstream-Analyse mit Bezug zu testen.

Im Gegensatz zu Standard-2D-Co-Kulturmodellen, die typischerweise Leukämiezellen durch Entfernung des suspendierten Tumorprobe, zeigt unser Modell, dass Co-Kultur für eine weitere dynamische Interaktion, in der leukämischen Zellen in Co-Kultur mit BMSC oder OB bilden drei Subpopulationen gegenüber dem BMSC oder OB-Monoschicht (Abbildung 1). Die Tumor Subpopulationen, die aufgehängt sind (S) Tumor bilden, dich schwebt frei in den Medien; Phasen hell (PB), die auf der Oberfläche des BMSC oder OB angeklebt ist; und die Phasen dim (PD), die unterhalb der BMSC oder OB-Monoschicht begraben haben (Abbildung 1). In diesem Modell haben wir festgestellt, dass eine strikte Fütterung und Nachsaat Zeitplan ist wichtig, konsistente Ergebnisse in einer Co-Kultur-Modell zu erreichen und damit füttern wir die Co-Kulturen in 4 Tagesintervallen und übertragen Tumor zu neuen BMSC oder OB-Monoschichten alle 12 Tage. Das kann die Änderung für alternative Tumorarten erfordern, wie gebraucht. Die Anzahl der Tumorzellen, die unter dem BMSC oder OB wandern wird die PD Bevölkerung zu bilden zwischen verschiedenen Leukämiezellen variieren. Dies kann eine Einschränkung des Modells sein, wenn die Anzahl der Tumorzellen PD niedrig Zuber gibt es schwierig, genügend Zellen für die nachfolgende Analyse zu sammeln. In einigen Fällen kann dieses Problem durch Schaffung replizieren Kokulturen überwunden werden zur Bündelung der drei einzelnen Subpopulationen zu ermöglichen.

Da dieses Modell Wiederliegt auf Tumorzellinteraktion mit dem BMSC oder OB ist es wichtig, ein wirksames Verfahren zu haben stromalen Zellverunreinigungen zu entfernen spezifischen Biologie der Leukämiezellen zu adressieren. Um diese Trennung von Tumorzellen erreichen von Stroma wir G10 Spalten verwenden. Bei richtiger Einstellung und die Verwendung dieser Spalten ist von entscheidender Bedeutung für die Isolierung von reinen Tumorpopulationen für Downstream-Analyse. In 2B, einwandfreie Durchführung des G10-Säule Trennergebnisse bei der Wiederherstellung von Tumorzellen bei mehr als 99% Reinheit, wie hervorgehoben. Dies ermöglicht eine nachgeschaltete Analyse der leukämischen Zellen ohne Komplikation der Interpretation der Ergebnisse, die aus Stromazellen Kontamination führen würde. Es ist wichtig zu beachten, dass alle Leukämiezelltypen, ob Zelllinien oder primären Patientenproben leicht in ihrer Fähigkeit, variiert durch die G-10-Spalten zu übergeben. Vor dem Einsatz in Großversuche sollten Anwender die Zahl der Leukämiezellen bestimmen sie Eingang muss die gewünschte Menge benötigt f erholenoder ihre spezifischen Bedürfnisse stromabwärts. Außerdem liefen die Menge an Waschmedium über die G10-Säule Post Inkubation erhöht werden kann, um zu versuchen, die Anzahl der Zellen gewonnen erhöhen. Sorgfalt sollte, um sicherzustellen, genommen werden, dass die zusätzlichen Waschungen verursachen keine Stromazellen Kontamination, die Nachwaschschritten bestimmt werden kann, indem Zellzahlen oder Durchflusszytometrie-Analyse der Strömung durch.

Bei der Bestimmung der Modell beobachteten wir, dass der PD Bevölkerung gewonnen Leukämiezellen Lebensfähigkeit verglichen mit leukämischen Zellen in Medium allein gezüchtet zugenommen haben, sowie diejenigen, die aus den S oder PB-Populationen in der gleichen Co-Kultur gewonnen, wenn einer zytotoxischen Chemotherapie ausgesetzt (Abbildung 3 AB). Dies ist bedeutsam, weil es eine Bevölkerung von Leukämiezellen in vitro darstellt, die ausgeprägten Schutz vor Chemotherapie abzuleiten. Dies stellt ein nützliches Werkzeug Behandlungsstrategien bei Targeting die meisten resistente Tumor Bevölkerung ausgerichtet zu testen, die durch unterstützt wirddas Knochenmark-Mikroumgebung. Darüber hinaus, weil diese Leukämiezellen durch das BMSC oder OB Co-Kultur geschützt, so gut sind, ist es offen für in-vitro-Kombination Behandlungsstrategien, dass in den Medien allein oder Standard-Co-Kultur-Modelle oder würde den Tumor erscheinen würde vollständig abzutöten, die nicht ist immer repräsentativ für Effekte in resistenten Mikroumgebung unterstützt Leukämie Bevölkerung gesehen.

Schließlich glauben wir, dass die Verwendung dieses Modells wertvolle Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen BMSC / OB zur Verfügung stellen kann, und Leukämiezellen, die für die Resistenz gegen Chemotherapie zur Behandlung verantwortlich sind, zu MRD führen, und Rückfall später. Dieses Modell stellt ein in vitro-Plattform Experimente zu entwerfen, die besser stromabwärts vorklinischen Modellen informieren. Obwohl wir Verwendung dieses Modells zeigen zu testen Wechselwirkungen zwischen Stromazellen des Knochenmarks und alle abgeleiteten Leukämiezellen, sind wir zuversichtlich, dass die zukünftige Ausrichtung und Anwendungen dieses Modell uns sein wirdeful in einer Vielzahl von malignen Erkrankungen, bei denen das Knochenmark-Mikroumgebung von Tumoren während der chemotherapeutischen Intervention ein Ort der Zuflucht bietet.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
G10 sephadex beads Sigma G10120 Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe BD 309604
Glass wool Pyrex 3950
1-way stopcocks World Precision Instruments, Inc. 14054-10
50 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021039 Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021037 Used for cell collection
Fetal Bovine Serum Sigma F6178
0.05% Trypsin  Mediatech, Inc. 25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 664160
Culture media
Osteoblast culture media  PromoCell C-27001 For human osteoblast media 
RPMI 1640 media Mediatech, Inc. 15-040 For tumor media prepation 
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts PromoCell C-12720 Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. 
Human Bone Morrow Stromal Cells WVU Biospecimen Core De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH ATCC ATCC-CRL-8286 REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
SD-1 DSMZ ACC 366 SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.

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