Modelleme Kemoterapi Dayanıklı Lösemi * These authors contributed equally

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Slone, W. L., Moses, B. S., Evans, R., Piktel, D., Martin, K. H., Petros, W., Craig, M., Gibson, L. F. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (108), e53645, doi:10.3791/53645 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Gelişmiş Hazırlık

  1. dekstran G10 parçacıklarının hazırlanması.
    1. 10 g G10 parçacıklarına PBS 1X 50 ml ekleyerek G10 bulamaç hazırlanır. tersine çevirerek karıştırın ve G10 4 ° CO / N fosfat tamponlu salin (PBS) üzerinden yerleşmek için izin verir.
    2. G10 sütun ayrılık günü, yerleşmiş G10 parçacıklar aspirat PBS ve 50 ml taze PBS ekleyin. tersine çevirerek karıştırın. Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de yerleşmiş G10 parçacıklar ve saklamak için 50 ml taze PBS eklenerek, iki kez tekrarlayın.
  2. BMSC ve OB Kültürleme.
    1. % 90 kaynaşma elde edilene kadar% 6 CO2 ve 10 cm doku kültürü plakaları üzerinde büyütülmüş, 37 ° C 'de BMSC veya OB hem koruyun.
    2. Yeni 10 cm plakalar üzerine 2: Trypsinize BMSC veya OB hücreleri ve 1 ayrıldı. lösemi ko-kültür için gerekli olana kadar hücreleri bu standartlara göre yetiştirilir.

2. oluşturulması ve Co-kültür bakımı

  1. 5-20 x 10 6 lösemi hücreleri ekleyin in,% 80-% 90 konfluent BMSC veya OB plakasına tümöre özgü kültür ortamı 10 mi.
    NOT: Lab daha% 1 ila% 7 16-18 arasındadır gösterilmiştir kemik iliği mikro-özetlemek için,% 5 O2, 37 ° C 'de ko-kültürler tutar. Ancak, bu oksijen gerilimi ile ortak kültürlerini koruyarak üç lösemi alt popülasyonlar kurulması için kritik değildir ve laboratuar takdirine bağlıdır.
  2. Her 4. gün (süspansiyon lösemik hücreler de dahil olmak üzere), 1 ml'lik ortam, ancak kaldırmak ve 9 ml taze lösemi kültür ortamı ile değiştirin. plakadan medya 9 ml çıkarırken, BMSC veya OB yapışık katman rahatsız etmemek için dikkatli olun.
    1. plaka köşesinde yan ve aspirat medya plaka eğerek ortamı çıkarın. Taze medya ekleyerek, ayrıca, BMSC veya OB yapışık tabakanın en az kesintiye sağlamak için yan duvar karşı plaka köşesinde damla damla eklemeyi unutmayın.
  3. Ko-kültür 12. günün ardından, yaklaşık 5 ila 10 kat çanak up kültür ortamı ve aşağı pipetleme hafifçe çanak üzerinde tarafından BHYK veya OB katmanından lösemik hücreleri yıkayın ve daha sonra 15 ml konik tüp içinde toplamak. aşama 2.1 'de tarif edildiği gibi, yeni% 80-% 90 konfluent BHYK veya OB plaka üzerine reseed.
    NOT: BMSC veya OB tek tabaka bozmadan S ve PB lösemi hücreleri kaldıracak adım 2.3 açıklandığı gibi ko-kültür yumuşak durulama. Bu, sadece tümör hücreleri aşağıdaki ko-kültür plakasına aktarılır sağlar. Bu 12 gün döngüsü kullanıcı ihtiyaçlarına göre gerektiğinde kadar birçok kez tekrar edilebilir.

3. Hazırlanması G10 Boncuk Sütunlar

NOT: Steril aşağı analiz veya kültür G10 sütun ayrılması aşağıdaki gerekiyorsa aşağıdaki adımlar steril tekniği kullanılarak yapılmalıdır ve G10 sütunları steril biyolojik kaputu kurulum olmalıdır.

  1. Ön-WARM hücre kültür ortamı, su banyosu içinde 37 ° C (~ 30 mi kolon başına). 10 ml'lik tek kullanımlık şırınga kullanarak, kaldırmak ve pistonu atın. şırınga, cam yünü ekleyin.
  2. cımbız kullanarak, ince gevşek ipliklerini içine cam yünü dışında çekin. Şırınga 2/3 cam yünü ile dolana kadar şırınga hafifçe dolu cam yünü çoklu katmanlar ekleyin.
    NOT: cam yünü lösemik hücre toplama kirletmesini gevşek G10 partikülleri önlemek için çok önemlidir. Emin cam yünü G10 parçacıkları desteklemek için yeterli dolu, ama çok yoğun sütun aracılığıyla medya akışını engellemek için dolu değil emin olun.
  3. kapalı konumda bir şırınganın ucu 1 yollu valf ekleyin.
  4. halkaya Kelepçe şırınga sütunu yani 50 ml konik tüp (toplama tüp) musluk altına yerleştirilebilir yeterince yüksek duruyor. şırınga sütununda toplama tüpü yerleştirin.
  5. 10 ml'lik bir pipet üstünde sütun PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi, G10 parçacıkları ekleme damla damla kullanılmasıcam yünü. cam yünü üzerine G10 partikülleri form (şırınga mezuniyet ile ölçülen) bir p 2 mi pelet kadar G10 parçacıklarının eklenmesi devam edin.
  6. önceden ısıtılmış medya ile G10 sütun dengeye.
    1. sütununa önceden ısıtılmış ortam 2 ml ilave edilir. Bu kadar açık musluk vana yavaş medya damla damla sütunun dışarı akar.
    2. önceden ısıtılmış ortam 10 ml'lik bir toplam kadar adımı tekrar 3.6.1 sütun karşılaşıncaya edilmiştir.
      Not: G10 partikülleri toplama tüpü boyunca akış görülen ya 1) + G10 parçacıklarının eklenmesi durumunda ek bir G10 taneciklerinin kolona kaçmasına emin ~ 2 mi pelet korumak ya da 2) kullanılmayan bir ve tekrar ile sütun yerine 3.4-3.6.1 adımları.
    3. sütunundan önceden ısıtılmış medya tahliye ettikten sonra, stopcock kapatın ve içinden akışı ile toplama tüpü atın. sütununda yeni koleksiyonu tüp ekleyin. Kolon ortamı + hücre karışımı ile yüklenebilir hazırdır.
      NOT: Kolonlarhemen kullanılmıştır ve kurumaya izin verilmelidir.

4. Co-kültür içinde 3 alt popülasyonlar ayırmak

  1. Süspansiyon (S) tümör ICSI'nin toplanması.
    1. ko-kültür plaka aspire medya pipet ile ve yavaşça plaka yıkayın ve bir 15 ml konik tüp lösemi hücreleri içeren medya toplamak için aynı medya uygulamak yeniden. Toplanan lösemili hücreler S ICSI'nin vardır.
  2. Faz Parlak (PB) tümör ICSI'nin toplanması.
    1. ko-kültür plaka üzerine geri 10 ml taze medya ekleyin. yapışık lösemi hücreleri ancak yapışık BMSC / OB bileşeni çıkarmak için yeterince sert değil kaldırmak için yukarı ve aşağı yaklaşık 5 kat eklendi medya pipetleme kuvvetlice çalkalayın.
    2. pipet ile aspire ve 15 ml konik tüp medya toplamak. Toplanan hücreler PB ICSI'nin vardır.
  3. Faz Dim (PD) tümör ICSI'nin toplanması.
    1. rem 1 ml PBS ile durulayın plakaove kalan ortam. 5 dakika için 37 ° C inkübatör içine 3 mi tripsin ve yeri ile tripsinize ko-kültür plakası.
    2. yapışık BMSC / OB çıkarmak için plakanın kenarlarına dokunun yavaşça inkübatör dışına plakasını çıkarın ve.
    3. dışında büyük hücre agrega kırmak için 1 ml fetal sığır serumu (FBS) ve pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez ekleyin.
    4. 15 ml konik tüp hücrelerin medyayı toplayın. Bu hücreler de BMSC / OB ile arıtılmamış PD ICSI'nin vardır.
  4. Santrifüj 3 7 dakika boyunca 400 x g'de subpopülasyonunun izole edilmiştir. Aspire ve atın yüzer madde daha sonra tek tek 1 ml önceden ısıtılmış medya pelet tekrar süspansiyon. Hücreler G10 kolona yüklendi hazırdır.

G10 Sütun üzerine 5. Yükleme Co-kültür Hücreleri

NOT: Emin stopcock olun tamamen G10 sütun medya içeren hücreleri eklemeden önce kapatılır. Ayrıca, her subpopülasyonu introduc öyle değil ayrı bir G10 kolonu üzerinde koştu olmalıdıraşağı analizde nüfus arasında herhangi bir önyargı e.

  1. 1.000 ul pipet kullanarak, damla damla ayrı bir G10 sütuna önceden ısıtılmış medya her hücre alt populasyonun 1 ml ekleyin. hücreleri içeren medya üstünde veya G10 pelet içinde kalmasını sağlamak. Hücreler, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca G10 pelet üzerinde inkübe izin verin.
    NOT: musluğu inkübasyon süresince kapalı kalır.

6. G10 Sütun lösemik hücreler Toplama

  1. Her G10 sütun 1-3 ml önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Açık musluk vana ve medya yavaş yavaş kolon damla damla çıkmak için izin verir.
    NOT: sütun veya sütun yıkayın ve izole lösemi hücreleri kirletebilir BMSC / OB içeren G10 pelet yavaş akış hızını korumak için çok önemlidir.
  2. 15 ila 20 ml arasında bir toplam kadar G10 kolonuna küçük artışlarla (1-2 mL) içinde önceden ısıtılmış ortam eklemeye devam sütun içinden geçen ve elde edilmiştir. Yakın musluk valve ve kapak toplama tüpü.
    NOT: Bir G10 parçacık pelet toplama tüpün dibinde görülürse, yavaşça G10 parçacık pelet rahatsız ve yeni bir tüpe transfer bırakarak tüpten ortamı çıkarın.
  3. Santrifüj oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 400 x g'de medyayı topladı. Süpernatantı ve alt uygulama için uygun tampon hücre pelletini.
  4. Hücreler artık BHYK veya OB kirlenme serbest lösemi hücrelerinin saf nüfus ve kullanıcı takdirine aşağı uygulamalara uygulanacak hazırız.
    NOT: G10 sütunlar aracılığıyla hücrelere geçerken lösemi hücre canlılığı değişmeden kalmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu ko-kültür modeli Başarılı kurulum ve kültür. Yapışık BMSC veya OB tek tabaka göre lösemik hücrelerin 3 alt popülasyonlarının kurulması neden 1 BMSC tek tabaka içine numaralı seribaşı ALL hücreleri başlangıçta askıya olarak yalnızca tek bir nüfusa nasıl görüneceği göstermektedir olacak lösemi hücreleri. lösemik hücreler lösemi hücrelerinin 3 mekansal alt-popülasyonunu oluşturulması için BHYK etkileşime 4 gün boyunca ((süspansiyon s), faz parlak (PB), ve faz dim (PD)). Tümör hücrelerinin 3 subpopülasyonunun yaygın BHYK veya OB ile birlikte kültür 24 saat sonra görülebilir ederken biz lösemili hücrelerin ve BMSC / OB hücreler arasında tam dinamikleri ve etkileşimler yer almaya izin vermek için 4 gün hücreler kültür co herhangi bir manipülasyon ya da deney öncesi yer (Şekil 1) sürer. Ayrıca, arı olan kemik iliği fizyolojisi özetlemek için% 5 bir oksijen gerilimi ile ko-kültür muhafaza dikkatn% 1 -7% 16-18 arasında değiştiği bildirilmiştir.

alt analiz büyük bir kısmı BHYK ya OB lösemik hücrelerin ayrılmasını gerektirir. Bunu sağlamak için, lösemi hücreleri (Şekil 2A) saf bir nüfus hasat G10 sütun kullanır. BMSC ve PD REH hücrelerinin trypsinization ardından karışık nüfus flow sitometri iki ayrı ileri / yan nüfus (Şekil 2B, üst panel) tarafından görülür. G10 ayrılması sadece REH ALL hücrelerinin saf bir nüfus eden, ileri / yana saçılım akış sitometrisi (Şekil 2B, alt panel) ile teyit edildi, geri kazanılır.

Bu ko-kültürü modeli ile BHYK Ob ile ko-kültür yapışık BHYK ya da OB olan mekansal konumlama nisbetle göre olan lösemik hücre fenotipinin sorgulama için izin verdiğinde 3 alt popülasyonları arasından lösemik hücrelerin izole edilmesi yeteneğine kullanımıtek tabaka. Özellikle ilgi çekici bir BMSC veya OB ko-kültür PD nüfus elde ALL hücreleri sitotoksik kemoterapiye maruz kaldıktan sonra hiçbir hücre ölümü için çok az olmasıdır (Şekil 3A, B).

Şekil 1
Şekil 1. BMSC veya OB formu üç uzamsal nüfuslu ko-kültür ALL hücreleri. Bizim laboratuvar kemik iliği mikro-kaynaklı stromal hücreler (BMSC veya OB) ile lösemik hücre etkileşimleri modellemek için bir in vitro ko-kültür sistemi kullanır. ko-kültür kurmak, lösemi hücreleri (Kırmızı) 'Zaman 0 "olarak ifade edilmektedir BHYK veya OB (Mavi), bir% 80 -90% konfluent tek tabaka üzerine ekilir. Eş kültürlerinde kemik iliği mikro koşulları yaklaşık% 5 oksijen 37 ° C 'de muhafaza edilir. Lösemik hücreler gibi erken 24 saat olarak 3 alt popülasyonlar oluşmaya başlar, ancak fo tam etkileşimler sağlamak içinrm biz ko-kültürler 4 gün deneyler için lösemik hücreleri kullanarak önce kurmak için izin verir. 4. günde (sağ panel) ile, lösemi hücrelerinin üç alt popülasyonlar yapışık tek tabaka ile ilgili olarak oluşturacaktır. şematik (sağ üstte) ve faz kontrast mikroskobu (sağ alt) göstermek askıya (S) serbestçe medyada yüzen lösemi hücreleri; faz parlak (PB) BMSC veya OB tek tabaka yüzeyine yapıştırılır lösemi hücreleri; ve faz dim (PD) BMSC veya OB tek tabaka altında göç etmiş lösemi hücreleri. Ölçek çubuğu 10 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
G10 sütun Şekil 2. BMSC / OB ALL hücrelerinin ayrılmasını sağlar. Bir G10 col kullanma işleminin (A) GösteriUMN alt analizi için, tümör hücrelerinin saf popülasyonu elde etmek için BMSC / ob ko-kültür tüm hücreleri ayırmak için. Soldan sağa, hücrelere ve BMSC / ob hücre karışımı, G10 kolonu üstüne ilave edilir; (Merkez) hücre karışımı G10 harç yerleşmek ve 20 dakika süre ile oda sıcaklığında inkübe edilmelidir (Not: musluğu ilk iki adım boyunca kapalı konumda olduğunda); (sağda) lösemi hücrelerinin stopcock açarak ve önceden ısıtılmış medya ile sütun durulama ile elde edilir. (B) Üst panel ALL hücreleri BMSC (mavi kapısı) ve Reh içeren hücrelerin karışık bir nüfus (kırmızı kapısı olduğunu G10 ayrılmadan önce gösterir ) ileri değerlendirilerek (FSC) ve yan dağılım (SSC) analizi. G10 ayırma ALL hücreleri (kırmızı kapısı)% 1'den daha az stromal hücre kontaminasyonu (mavi kapısı) kalır REH sadece saf nüfusu aşağıdaki alt panel. Thi büyük halini görmek için tıklayınız s rakam.

Şekil 3,
Şekil 3. PD lösemik hücreler, kemoterapi maruz daha fazla dayanıklılığa sahiptir. Ara-C 4 günlük maruz bırakılmasından sonra, indirgenmiş canlılığı göstermez bir BMSC ko-kültür (A) PD popülasyonundan geri SD-1 lösemik hücreler [1 uM] Muamele edilmemiş kontroller ile benzer bir MTX [50 uM] ya da VCR [25 uM], (Ara-C, ikinci bir doz stabilitesine bağlı herhangi bir ilaç kaybı hesaba 48 saat sonra ilave dikkat edin). OB hücreleri ile birlikte-kültür tripan mavisi exclusion.SD-1 lösemi hücreleri ile belirlenen canlılık (B) içindeki bir eğilim göstereceği şekilde, tek başına ortam ile ilgili lösemi hücreleri, S ve PB nüfus önemli canlılığı azaltmıştır. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. (*) P <muamele edilmemiş kontroller ile 0.05, t-test göreceli ifade eder.5fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hastalığın nüks katkıda minimal rezidüel hastalık (MRD) HEPSİ agresif refrakter tedavisinde önemli bir klinik sorundur, yanı sıra, diğer hematolojik maligniteler bir ev sahibi olmaya devam ediyor. Kemik iliği mikro TÜM 3,8 nüks en sık sitedir. Bu nedenle, kemik iliği mikro modeli modelleri kemoterapi maruziyeti sırasında lösemili tümör hücre canlılığı ve MRD bakımı ile ilgili hipotezleri test etmek için hayati araçlardır. fare modelleri uyuşturucu etkinliği ile ilgili test soruları için altın standart tanımlar iken, 2D ko-kültür lösemik hücre hayatta kalma kemik iliği mikroçevresinin desteği ile ilgili test hipotezler ve uyuşturucu stratejileri için uygun maliyetli bir yöntem olmaya devam ediyor. Birçok grup BHYK ile lösemik hücrelerin bu ko-kültür göstermiştir veya kemoterapi ajanları 9,10,12-14,19-21 ile meydan okuduğunda OB bir sağkalım avantajı sağlamaktadır. Çalışma modelleme, normal olgunlaşmamış CD34 + hemamezenkimal kök hücreler (MSC) ile birlikte kültür topoietic hücreler hematopoietik hücreler, hematopoietik hücrelerin 22,23 üç ayrı uzamsal popülasyonları oluşturulması için MSC adherent tek tabaka ile etkileşim olduğunu ortaya çıkarmıştır. Çoğalma ve CD34 + hücrelerinin farklılaşma ko-kültür 22 içindeki konuma göre gerçekleştirildi. Bu kemik iliği mikro-stromal hücre 2B ko-kültür içinde, tümör hücrelerinin bir dirençli bir popülasyonu destek ve alt analiz için izole ilişkin sorular test etmek için bu gözlem genişletmiştir.

tipik süspansiyon haline tümör çıkarılmasıyla lösemik hücreler numune standart 2D ko-kültür modellerinde farklı olarak, model, ko-kültür BHYK üç alt popülasyonlar göre BHYK veya OB formu ile ko-kültür olan lösemik hücrelerde daha dinamik etkileşime temsil gösterir veya OB tek tabaka (Şekil 1). oluşturan tümör subpopülasyonunun askıya alınır (S) tümör, WHIch serbestçe medyada yüzen; BHYK ya da OB yüzeyine yapıştırılan faz parlak (PB); ve faz loş BHYK veya OB tek tabaka (Şekil 1) altında gömülü olan (PD). Bu modelde, katı bir beslenme ve yeniden tohumlama zamanlama bir ko-kültürü modeli tutarlı sonuçlar elde etmek ve bu nedenle 4 günlük aralıklarla ko-kültürler beslemek ve 12 günde bir yeni BMSC veya OB mono tabakaları tümörün aktarmak için önemli olduğu bulunmuştur. Gerektiğinde bu alternatif tümör tipleri için modifikasyona ihtiyaç duyabilir. BHYK ya da OB altında göç edecek tümör hücrelerinin sayısı PD popülasyonu, farklı lösemi hücreleri arasında değişebilir oluşturulur. PD tümör hücrelerinin sayısı zor aşağı analiz için yeterli hücreleri toplamak için düşük yapma olduğunda bu modelin bir sınırlama olabilir. Bazı durumlarda, bu sorun, üç ayrı alt toplulukların birleştirilmesi için izin vermek için ko-kültürler çoğaltma kurarak aşılabilir.

Bu model, yeniden olarakBHYK tümör hücre etkileşimi üzerinde yer alır veya lösemi hücrelerinin spesifik biyolojisi için stromal hücre kontaminasyonu temizlemek için etkili bir yöntem olması önemlidir OB. Bu G10 sütun kullanmak stromadan tümör hücrelerinin bu ayırma gerçekleştirmek için. Bu sütunların uygun kurulum ve kullanım aşağı analiz için saf tümör popülasyonlarının izolasyonu için çok önemlidir. Şekil 2B'de,% 99'dan daha fazla saflıkta tümör hücrelerinin kurtarma G10 kolonu ayırma sonuçları düzgün yürütülmesi de belirtildiği gibi. Bu stromal hücre kirlenmeye karşı neden olur sonuçların yorumlanması komplikasyonsuz lösemik hücrelerin alt analizi sağlar. Tüm lösemik hücre tipleri hücre çizgileri veya primer hasta numuneleri G10 sütun geçmesine yetenekleri açısından daha farklı olup olmadığını belirtmek önemlidir. büyük ölçekli deneylerde kullanılmadan önce kullanıcıların giriş istenilen miktarda ihtiyaç duyulan f kurtarmak için gereken lösemi hücrelerinin sayısını belirlemek gerekirveya kendi özel aşağı ihtiyacı var. Buna ek olarak, yıkama ortamı miktarı G10 kolon sonrası kuluçka denemek ve geri hücrelerin sayısını artırmak için artırılabilir yanına koştu. Bakım ek yıkar hücre sayımları Mesajı yıkama belirlenen ya da içinden akış sitometri analizi akış olabilir stromal hücre kontaminasyona neden yok sigorta için alınmalıdır.

Bu model kurma olarak, kemoterapi sitotoksik maruz kaldığında PD nüfus elde lösemi hücreleri tek başına, hem de, aynı ko-kültür S ya da PB popülasyonlarından geri kazanılan kişilerce ortamında yetiştirilen lösemik hücreler ile karşılaştırıldığında canlılığı arttığı görülmektedir (Şekil 3 AB). O kemoterapiden belirgin bir koruma elde in vitro lösemi hücrelerinin bir popülasyonu temsil çünkü bu önemlidir. Bu tarafından desteklenen en dirençli tümör nüfusa, hedef amaçlayan tedavi stratejileri test etmek için kullanışlı bir araç sağlarKemik iliği mikro-. Bu lösemili hücrelerin çok iyi BHYK veya OB ko-kültür ile korunmaktadır, çünkü Bundan başka, bu ya da standart ko-kültür modeller veya görünür olmadığı tam tümör öldürür tek başına ortam içinde in vitro kombinasyon tedavi stratejilerine müsait dayanıklı mikroçevresinin desteklenen lösemik toplumlarda görülen etkilerin hep temsilcisi.

Son olarak, bu modelin kullanımı, kemoterapi tedavisine direnç sorumlu BMSC / OB arasındaki etkileşimler ve lösemili hücrelerin içine değerli bilgiler sağlayabilir MRD yol ve daha sonra nüks inanıyoruz. Bu model daha aşağı pre-klinik modelleri bilgilendirecek Deney tasarlama bir in vitro platform sağlar. kemik iliği hücreleri ve TÜM türetilmiş lösemili hücreler arasındaki etkileşimleri test etmek için bu modelin kullanımını göstermek rağmen, biz bu modelin gelecek yönleri ve uygulamaları bizi olacağını umutluyuzKemik iliği mikro-kemoterapötik müdahalesi sırasında tümörler için kutsal bir site sağlayan malignite çeşitli eful.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
G10 sephadex beads Sigma G10120 Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe BD 309604
Glass wool Pyrex 3950
1-way stopcocks World Precision Instruments, Inc. 14054-10
50 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021039 Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021037 Used for cell collection
Fetal Bovine Serum Sigma F6178
0.05% Trypsin  Mediatech, Inc. 25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 664160
Culture media
Osteoblast culture media  PromoCell C-27001 For human osteoblast media 
RPMI 1640 media Mediatech, Inc. 15-040 For tumor media prepation 
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts PromoCell C-12720 Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. 
Human Bone Morrow Stromal Cells WVU Biospecimen Core De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH ATCC ATCC-CRL-8286 REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
SD-1 DSMZ ACC 366 SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ayala, F., Dewar, R., Kieran, M., Kalluri, R. Contribution of bone microenvironment to leukemogenesis and leukemia progression. Leukemia. 23, (12), 2233-2241 (2009).
  2. Coustan-Smith, E., Sancho, J., et al. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 96, (8), 2691-2696 (2000).
  3. Gaynon, P. S., Qu, R. P., et al. Survival after relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer. 82, (7), 1387-1395 (1998).
  4. Kikuchi, M., Tanaka, J., et al. Clinical significance of minimal residual disease in adult acute lymphoblastic leukemia. Int. J. Hematol. 92, (3), 481-489 (2010).
  5. Krause, D. S., Scadden, D. T., Preffer, F. I. The hematopoietic stem cell niche-home for friend and foe? Cytometry B Clin. Cytom. 84, (1), 7-20 (2013).
  6. Meads, M. B., Hazlehurst, L. A., Dalton, W. S. The Bone Marrow Microenvironment as a Tumor Sanctuary and Contributor to Drug Resistance. Clin. Cancer Res. 14, (9), 2519-2526 (2008).
  7. Nguyen, K., Devidas, M., et al. Factors Influencing Survival After Relapse From Acute Lymphoblastic Leukemia: A Children's Oncology Group Study. Leuk. Off. J. Leuk. Soc. Am. Leuk. Res. Fund UK. 22, (12), 2142-2150 (2008).
  8. Szczepanek, J., Styczyński, J., Haus, O., Tretyn, A., Wysocki, M. Relapse of Acute Lymphoblastic Leukemia in Children in the Context of Microarray Analyses. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). 59, (1), 61-68 (2011).
  9. Boyerinas, B., Zafrir, M., Yesilkanal, A. E., Price, T. T., Hyjek, E. M., Sipkins, D. A. Adhesion to osteopontin in the bone marrow niche regulates lymphoblastic leukemia cell dormancy. Blood. 121, (24), 4821-4831 (2013).
  10. Bradstock, K., Bianchi, A., Makrynikola, V., Filshie, R., Gottlieb, D. Long-term survival and proliferation of precursor-B acute lymphoblastic leukemia cells on human bone marrow stroma. Leukemia. 10, (5), 813-820 (1996).
  11. Clutter, S. D., Fortney, J., Gibson, L. F. MMP-2 is required for bone marrow stromal cell support of pro-B-cell chemotaxis. Exp. Hematol. 33, (10), 1192-1200 (2005).
  12. Manabe, A., Murti, K. G., et al. Adhesion-dependent survival of normal and leukemic human B lymphoblasts on bone marrow stromal cells. Blood. 83, (3), 758-766 (1994).
  13. Mudry, R. E., Fortney, J. E., York, T., Hall, B. M., Gibson, L. F. Stromal cells regulate survival of B-lineage leukemic cells during chemotherapy. Blood. 96, (5), 1926-1932 (2000).
  14. Tesfai, Y., Ford, J., et al. Interactions between acute lymphoblastic leukemia and bone marrow stromal cells influence response to therapy. Leuk. Res. 36, (3), 299-306 (2012).
  15. Hathcock, K. S. Depletion of Accessory Cells by Adherence to Sephadex G-10. Curr. Protoc. (2001).
  16. Berniakovich, I., Giorgio, M. Low oxygen tension maintains multipotency, whereas normoxia increases differentiation of mouse bone marrow stromal cells. Int. J. Mol. Sci. 14, (1), 2119-2134 (2013).
  17. Chow, D. C., Wenning, L. A., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Modeling pO(2) distributions in the bone marrow hematopoietic compartment. II. Modified Kroghian models. Biophys. J. 81, (2), 685-696 (2001).
  18. Holzwarth, C., Vaegler, M., et al. Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells. BMC Cell Biol. 11, (2010).
  19. O'Leary, H., Akers, S. M., et al. VE-cadherin Regulates Philadelphia Chromosome Positive Acute Lymphoblastic Leukemia Sensitivity to Apoptosis. Cancer Microenviron. Off. J. Int. Cancer Microenviron. Soc. 3, (1), 67-81 (2010).
  20. Wang, L., Chen, L., Benincosa, J., Fortney, J., Gibson, L. F. VEGF-induced phosphorylation of Bcl-2 influences B lineage leukemic cell response to apoptotic stimuli. Leukemia. 19, (3), 344-353 (2005).
  21. Wang, L., Coad, J. E., Fortney, J. M., Gibson, L. F. VEGF-induced survival of chronic lymphocytic leukemia is independent of Bcl-2 phosphorylation. Leukemia. 19, (8), 1486-1487 (2005).
  22. Jing, D., Fonseca, A. V., et al. Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells--modeling the niche compartments in vitro. Haematologica. 95, (4), 542-550 (2010).
  23. Jing, D., Wobus, M., Poitz, D. M., Bornhäuser, M., Ehninger, G., Ordemann, R. Oxygen tension plays a critical role in the hematopoietic microenvironment in vitro. Haematologica. 97, (3), 331-339 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics