माउस रीढ़ की हड्डी में serotonergic फाइबर इमेजिंग स्पष्टता का उपयोग / क्यूबिक तकनीक

Neuroscience

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Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J. Vis. Exp. (108), e53673, doi:10.3791/53673 (2016).

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Abstract

रीढ़ की हड्डी को लांग उतरते फाइबर हरकत, दर्द धारणा है, और अन्य कार्यों के लिए आवश्यक हैं। इन फाइबर सिस्टम के बहुमत की रीढ़ की हड्डी में फाइबर समाप्ति पैटर्न को अच्छी तरह से किसी भी प्रजाति में जांच नहीं की गई है। Serotonergic फाइबर, जो रीढ़ की हड्डी के लिए परियोजना, ऊतकीय वर्गों पर चूहों और opossums में अध्ययन किया गया है और उनके कार्यात्मक महत्व दिया रीढ़ की हड्डी में उनके फाइबर समाप्ति पैटर्न पर आधारित deduced किया है। स्पष्टता और घन तकनीक के विकास के साथ, यह इस फाइबर प्रणाली और रीढ़ की हड्डी में इसके वितरण, जो serotonergic supraspinal रास्ते में से पहले अज्ञात सुविधाओं को प्रकट करने की संभावना है जांच करने के लिए संभव है। यहाँ, हम इमेजिंग माउस रीढ़ की हड्डी में serotonergic फाइबर संयुक्त स्पष्टता और घन तकनीक का उपयोग कर के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। विधि एक जोड़ती साथ एक हाइड्रोजेल समाधान और ऊतकों के स्पष्टीकरण के साथ एक माउस का छिड़काव शामिलअभिकर्मकों समाशोधन का समझना। रीढ़ की हड्डी के ऊतकों बस के नीचे दो सप्ताह में मंजूरी दे दी थी, और सेरोटोनिन के खिलाफ बाद में immunofluorescent धुंधला कम से कम दस दिनों में पूरा किया गया। एक बहु फोटॉन फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ, ऊतक स्कैन किया गया और एक 3 डी छवि Osirix सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खंगाला गया था।

Protocol

आचार कथन: पशु विषयों को शामिल सभी प्रक्रियाओं पशु की देखभाल और आचार समिति (ACEC) न्यू साउथ वेल्स विश्वविद्यालय के दिशा-निर्देशों पर (अनुमोदित ACEC नंबर 14 / 94a है) का पालन करें।

1. पारदर्शी माउस स्पाइनल कॉर्ड की तैयारी

  1. बर्फ का ठंडा हाइड्रोजेल समाधान की तैयारी
    1. 16% paraformaldehyde समाधान की तैयारी (पीएफए)
      1. 16 ग्राम पाउडर paraformaldehyde 70 मिलीलीटर पूर्व गर्म आसुत जल (50-55 डिग्री सेल्सियस) में जोड़ें और एक गर्म चुंबकीय दोषी पर हलचल जब तक paraformaldehyde भंग कर रहा है। नोट: समाधान पर 55 डिग्री सेल्सियस गर्मी और जानते हैं कि paraformaldehyde विषैला होता है होने की अनुमति न दें।
      2. एक सिलेंडर के लिए paraformaldehyde समाधान स्थानांतरण और 100 मिलीलीटर के लिए आसुत जल जोड़ें। paraformaldehyde समाधान एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर का उपयोग कर शांत।
    2. आसुत जल 26.25 मिलीलीटर में 125 मिलीग्राम VA-044 सर्जक भंग और एक 4 में समाधान शांतसी फ्रिज °।
    3. कूल 5 मिलीलीटर एक्रिलामाइड समाधान (40%), 1.25 मिलीग्राम बीआईएस समाधान (2%) (चेतावनी: बीआईएस और एक्रिलामाइड समाधान विषाक्त कर रहे हैं, आनुवंशिक दोष या कैंसर का कारण बन सकता है), 5 मिलीलीटर 10x पीबीएस, 12.5 मिलीलीटर 16% पीएफए ​​समाधान है, और बर्फ पर VA-044 सर्जक समाधान।
    4. बर्फ पर ऊपर समाधान मिक्स।
      नोट: कुल मात्रा 50 मिलीग्राम है।
  2. छिड़काव और माउस स्पाइनल कॉर्ड का संग्रह
    1. ketamine (80 मिलीग्राम / किग्रा) और xyzaline (5 मिलीग्राम / किग्रा) 0.9% सामान्य खारा में पतला की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ एक माउस चतनाशून्य। माउस के लिए खुराक है कि चूहों के लिए की तुलना में कम हो सकता है।
    2. एक धूआं हुड में एक उपयुक्त प्लास्टिक सतह पर, शरीर से दूर माउस के अंगों को ठीक (चिपचिपा टेप प्रभावी है) एक बार माउस पैर की अपनी त्वचा के लिए एक चुटकी का जवाब नहीं है।
    3. सीने पर माउस त्वचा कट और फिर छाती की हड्डी एक कैंची के साथ दिल को बेनकाब करने के लिए।
    4. , एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर एक 25 जी सुई के साथ वें से जुड़ीट्यूबिंग के अंत ई, दिल के बाएं वेंट्रिकल में सुई डालने सही आलिंद कटाव लगभग 10 मिलीग्राम / मिनट की दर से रक्त के लिए एक बाहर निकलें बिंदु बनाने के लिए और फिर 40 मिलीलीटर 0.9% सामान्य नमक के साथ कपड़े धोने शुरू करने के लिए।
    5. जब पूरा, 35 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे हाइड्रोजेल समाधान के साथ माउस छिड़कना।
      नोट: 10 मिलीलीटर की गति छिड़कना / मिनट तंत्रिका ऊतक की सूजन से बचने के लिए।
    6. एक ब्लेड के साथ पीठ पर त्वचा काटकर अलग कर देना और फिर कशेरुकी के बगल की मांसपेशियों को हटा दें। एक तरफ कशेरुकी मेहराब काटने और उन्हें दूसरे पक्ष को flipping के बाद, एक ठीक कैंची के साथ कशेरुका स्तंभ के बाहर रीढ़ की हड्डी ले।
  3. माउस स्पाइनल कॉर्ड समाशोधन
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हाइड्रोजेल समाधान के 15 मिलीलीटर में रीढ़ की हड्डी रखें।
    2. हाइड्रोजेल समाधान के 10 मिलीलीटर निकालें और एक 5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों के साथ समाधान के बाकी डालो। हाइड्रोजेल समाधान के साथ 5 मिलीलीटर ट्यूब भरें जब तक यह पूरी तरह से भरा हुआ है।
    3. 5 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर parafilm का एक छोटा सा टुकड़ा खिंचाव और फिर ट्यूब के गले में parafilm लपेटो। नोट: parafilm संपर्कों को सुनिश्चित हाइड्रोजेल समाधान और वहाँ हाइड्रोजेल समाधान और parafilm के बीच कोई बुलबुले हैं।
    4. एक 37 में 5 मिलीलीटर ट्यूब रखो   डिग्री सेल्सियस ओवन में रात भर। हाइड्रोजेल समाधान का निरीक्षण करें जब तक यह एक जेल बन जाता है।
    5. ओवन से बाहर 5 मिलीलीटर ट्यूब ले लो और (जैसे एक shoveled 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के रूप में) एक औजार के साथ ट्यूब से जेल को हटा दें। जेल के लिए मोटे ऊतक चिपके द्वारा रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से जेल निकालें और फिर मोटे ऊतक दूर ले (जेल ऊतकों को रहना होगा और इसलिए ऊतक से हटा दिया जाएगा)।
    6. रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से जेल को हटाने के बाद, रीढ़ की हड्डी में एक प्रकार के बरतन पर 24 घंटे के लिए 1x पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ 4 बार धो लें।
    7. 3.85 छ यूरिया और 3.85 ग्राम एन, एन, एन ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediam भंग द्वारा घन समाशोधन समाधान तैयार5.38 मिलीलीटर में ine आसुत जल।
      नोट: एक गर्म दोषी प्रयोग किया जाता है। 2.31 छ पॉलीथीन ग्लाइकोल मोनो-P-isooctylphenyl आकाश / ट्राइटन X-100 के समाधान के लिए जोड़ने के बाद यह स्पष्ट हो गया है और कमरे के तापमान को शांत होता है।
      नोट: इन तीन रसायनों के 10 ग्राम एक माउस के लिए कर रहे हैं।
    8. coronally एक धार के साथ 2-3 मिमी लंबे खंडों में माउस रीढ़ की हड्डी में कटौती और उनके ऊपर घन समाशोधन समाधान के 5 मिलीलीटर में डाल दिया। 37 पर ओवन में एक प्रकार के बरतन पर रखें   3 दिन के लिए सें।
    9. तीन दिन बाद, एक ताजा एक समाशोधन के लिए समाधान बदल जाते हैं। नोट: ऊपर समाधान का उपयोग करने से पहले तैयार किया जाता है।
    10. दो से तीन दिन बाद में घन समाशोधन समाधान ताज़ा करने के बाद, फ़ॉन्ट 8 पत्र के साथ एक कागज के खिलाफ ऊतक की पारदर्शिता की जाँच करें। यदि यह पारदर्शी है, पत्र को मंजूरी दे दी ऊतकों के माध्यम से देखा जा सकता है। समाशोधन समाधान निकालें और PBST के 4 मिलीलीटर जोड़ने (0.1% ट्राइटन-X100) ऊतक 4 बार एक दिन (हर 6 घंटे) धोने के लिए।

  1. 3 दिनों के लिए एक प्रकार के बरतन पर एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में: प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में रीढ़ की हड्डी खंडों सेते (100 PBST में विरोधी सेरोटोनिन, खरगोश में उठाया, 1 पतला)।
  2. एंटीबॉडी समाधान निकालें और PBST के 4 मिलीलीटर जोड़ने (0.1% ट्राइटन-X100) एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में रीढ़ की हड्डी खंडों 4 बार एक दिन (हर 6 घंटा) धोने के लिए।
  3. एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में एक प्रकार के बरतन पर 3 दिन के लिए ऊतक सेते हैं: PBST समाधान निकालें और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ने (100 PBST में 594 संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी, 1 पतला)।
  4. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और PBST के 4 मिलीलीटर एक दिन (हर 6 घंटे) एक प्रकार के बरतन पर एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में जोड़ने के लिए रीढ़ की हड्डी खंडों 4 बार धोने के लिए। अगले दिन ऊतक इमेजिंग के लिए तैयार है।

3. इमेजिंग

  1. PBST समाधान निकालें और ऊतक के अपवर्तनांक भी बनाने के लिए 85% ग्लिसरॉल के 4 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को अगले 85% ग्लिसरॉल की कुछ बूँदें रखो और एक 22 x 50 मिमी 2 coverslip गिलास के साथ यह coverslip।
    नोट: रीढ़ की हड्डी के उन्मुखीकरण का फैसला कैसे छवि की तरह लग रहा है।
  3. बहु फोटॉन फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के आयोजन फ्रेम पर गिलास स्लाइड रखो और प्रकाश मार्ग में ऊतक चलते हैं।
  4. हीलियम नीयन लेजर लाइन 594 एनएम का चयन और लाइव छवि में सकारात्मक संकेत की चमक की जाँच करके इष्टतम स्तर पर लेजर की तीव्रता को समायोजित।
  5. 20X उद्देश्य (पानी में, एनए 0.7) का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी के ऊतकों की स्कैनिंग क्षेत्र का चयन करें और एक z ढेर बनाने के लिए तैयार है, और प्रत्येक चरण 3 माइक्रोन करने के लिए सेट की गहराई।
  6. 20X ओर्ब के तहत जेड ढेर के ऊपर से नीचे तक ऊतक स्कैनसक्रिय और फिर 63X उद्देश्य (तेल में, एनए 1.4) क्रमशः (कदम आकार 1 माइक्रोन था)। 3 डी वीडियो एक 3 डी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 28 पुनर्निर्माण किया।

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Representative Results

इस खंड में स्पष्टता और घन प्रोटोकॉल का एक संयोजन का उपयोग कर पारदर्शी माउस रीढ़ की हड्डी में सेरोटोनिन एंटीबॉडी धुंधला से परिणाम दिखाता है। हम बताते हैं कि serotonergic फाइबर उदर सींग के उदर भाग में एक विशेषता के साथ रीढ़ की हड्डी के सभी laminae में मौजूद हैं (चित्रा 1, 1 वीडियो भी देखें)। नियंत्रण ऊतक सकारात्मक फाइबर (परिणाम नहीं दिखाया गया था) नहीं था। उदर सींग में, घनी पैक serotonergic फाइबर उदर सींग का वेंट्रोमीडिअल हिस्से में मौजूद हैं और वे उदर सींग के पार्श्व भाग की ओर विस्तार (चित्रा 2, भी वीडियो 2 देखें)। कुछ immunopositive फाइबर भी पृष्ठीय सींग या केंद्रीय नहर की ओर उदर सींग से करता हूं। Immunopositive फाइबर पृष्ठीय सींग के सभी laminae में मौजूद हैं लेकिन सकारात्मक फाइबर के बीच एक छोटे से अंतराल विशेष रूप से पार्श्व में पटल 2 और 4 में है,पृष्ठीय सींग का हिस्सा है। पृष्ठीय सींग में serotonergic फाइबर के बहुमत छोटे व्यास के हैं और उनमें से केवल एक छोटी संख्या में बड़े व्यास (वीडियो 1) के हैं। एक क्षैतिज अनुभाग में, उदर सींग में घनी पैक serotonergic फाइबर रीढ़ की हड्डी के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ यात्रा करते हैं और एक बड़े फाइबर बंडल के लिए फार्म मनाया गया। सबसे दिलचस्प पहलू यह है कि इस बड़े फाइबर बंडल शाखाएं नियमित रूप से अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ है, जो फाइबर बंडल को सीधा कर रहे मुद्दों है। ये शाखाएं आगे उदर सींग के पार्श्व भाग करने के लिए उनके रास्तों साथ collateralize। इन शाखाओं के साथ तुलना में, मध्य रेखा की ओर विस्तार देने वाले अनियमित और छोटे (चित्रा 2) कर रहे हैं। 63X उद्देश्य के तहत, पृष्ठीय सींग में serotonergic फाइबर रीढ़ की हड्डी की धुरी के साथ यात्रा करते हैं और तंत्र के मार्ग के किनारे विभिन्न बिंदुओं पर समाप्त करने के लिए मनाया गया। मोटी फाइबर कई मायनों पतली एफ के बीच वितरित कर रहे हैं ibers (चित्रा 3, भी वीडियो 3 देखें)।

आकृति 1
चित्रा 1:। 200x बढ़ाई बाएँ पर काठ की हड्डी के एक राज्याभिषेक अनुभाग में serotonergic फाइबर, उदर सींग है सही पृष्ठीय सींग, पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के औसत दर्जे का हिस्सा है, और उदर रीढ़ की हड्डी के पार्श्व भाग है। पैमाने बार 100 माइक्रोन है। Serotonergic फाइबर विशेष रूप से उदर सींग जहां फाइबर घनत्व अधिक है की वेंट्रोमीडिअल भाग में, सभी laminae में मौजूद हैं। इन तंतुओं दोनों उदर सींग के पार्श्व भाग और केंद्रीय नहर या पृष्ठीय सींग की ओर का विस्तार। अन्य laminae में फाइबर का घनत्व कम है। serotonergic फाइबर के बहुमत पतले होते हैं। केवल फाइबर की एक छोटी संख्या मोटी हैं और वे दोनों पृष्ठीय सींग और उदर सींग (में देखा जाता है> यह भी देखना वीडियो 1 (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें))।

चित्र 2
चित्रा 2:। 200x बढ़ाई बाएँ पर उदर सींग के उदर भाग को और अधिकार में serotonergic फाइबर रीढ़ की हड्डी के पार्श्व पहलू हैं, पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा है, और उदर रीढ़ की हड्डी की दुम हिस्सा है। पैमाने बार 100 माइक्रोन है। Serotonergic फाइबर रीढ़ की हड्डी के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ यात्रा कर दिखाया गया है और उदर सींग जहां वे एक मोटी फाइबर बंडल फार्म की औसत दर्जे हिस्से में पैक कर रहे हैं। इस बंडल में से कुछ शाखाओं, उदर सींग के पार्श्व भाग की ओर से नियमित अंतराल पर बढ़ा है, जबकि दूसरों है कि मध्य रेखा की ओर विस्तार अनियमित और कम कर रहे हैं। इन तंतुओं पथ के मार्ग के किनारे कई बिंदुओं पर समाप्त ( वीडियो भी 2 देखें(राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें))।

चित्र तीन
चित्रा 3: 630X बढ़ाई तहत पृष्ठीय सींग में serotonergic फाइबर वाम, रीढ़ की हड्डी के पार्श्व भाग है सही रीढ़ की हड्डी, पृष्ठीय और उदर में क्रमश: पृष्ठीय और पृष्ठीय सींग के उदर भाग को देखें की औसत दर्जे का हिस्सा है। । पैमाने पर पट्टी 7 माइक्रोन है। Serotonergic फाइबर रीढ़ की हड्डी के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ यात्रा और तंत्र के मार्ग के किनारे समाप्त कर रहे हैं। इन तंतुओं मोटी फाइबर intermingled की एक छोटी संख्या के साथ छोटे व्यास के मुख्य रूप से कर रहे हैं। इन तंतुओं को शायद ही कभी एक दूसरे के साथ ओवरलैप ( वीडियो भी 3 देखें (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) )।

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Discussion

प्रोटोकॉल संयुक्त स्पष्टता और घन तकनीकों के साथ माउस रीढ़ की हड्डी में छवि serotonergic तंतुओं को वर्णित दिखाता है कि कैसे। यह चेउंग एट अल। 14 और Tomer एट अल। 15 द्वारा विकसित निष्क्रिय समाशोधन प्रोटोकॉल की तुलना में एक तेजी से समाशोधन प्रक्रिया का परिचय और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में अच्छी तरह से साफ करने के दौरान हाइड्रोजेल द्वारा समर्थित होने की अनुमति देता है।

माउस रीढ़ की हड्डी के निर्धारण के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में चेउंग एट अल। 14 और Tomer एट अल। 15 द्वारा रिपोर्ट, सभी समाधान बर्फ, जो रसायन के polymerization रोकता पर शांत रखने के लिए है। अन्य महत्वपूर्ण कदम आदेश तंत्रिका ऊतक की सूजन से बचने के लिए हाइड्रोजेल समाधान के साथ धीरे-धीरे माउस छिड़कना है। हाइड्रोजेल समाधान के लिए एक जेल बनने के लिए, degassing की आवश्यकता है। इस के लिए एक विकल्प के रूप में, हम हैदराबाद के बीच ट्यूब के शीर्ष कवर करने के लिए इस्तेमाल किया और parafilm कोई हवाई बुलबुले को छोड़ दियाRogel समाधान और parafilm। यह बहुत अच्छी तरह से काम किया है और हाइड्रोजेल समाधान कुछ ही घंटों के बाद एक जेल बन गया। हालांकि कुछ बुलबुले जेल में पाए गए हैं, वे निम्न प्रयोगों, जो रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में बुलबुले के अभाव के द्वारा प्रदर्शन किया गया था के साथ हस्तक्षेप नहीं किया। क्लियरिंग सबसे महत्वपूर्ण कदम है, और अभिकर्मकों का एक संयोजन की आवश्यकता है। समाशोधन समाधान, अमीनो-अल्कोहल युक्त, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों एसडीएस / बोरिक एसिड आधारित समाशोधन मूल स्पष्टता प्रोटोकॉल 16 में इस्तेमाल किया समाधान की तुलना में बहुत तेजी से की लिपिड को हटा।

स्पष्टता और घन परंपरागत तकनीक पर प्रतिरक्षाऊतकरसायन का लाभ यह है कि पूरे ऊतक ब्लॉक ऊतक सेक्शनिंग बिना imaged किया जा सकता है, एक परिणाम के रूप में, serotonergic फाइबर की निरंतरता को बनाए रखा है, और यह एक लंबी दूरी के लिए एक ही फाइबर का पालन करने के लिए संभव है जेड ढेर के भीतर। इस लाभ के साथ, collateralization आत्मविश्वास से 3 डी छवियों के साथ पहचाना जा सकता है, एकएन डी उपन्यास निष्कर्ष इसलिए serotonergic रास्ते की प्रकृति के बारे में बनाया जा सकता है। प्रोटोकॉल वर्णित बस विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ ऊतक लेबल करके फाइबर सिस्टम, साथ ही नाभिक की जांच के लिए एक सुविधाजनक उपकरण है। इस तकनीक को भी डबल या ट्रिपल लेबलिंग का उपयोग करके एक ही माउस मस्तिष्क में विभिन्न प्रणालियों से पूछताछ के लिए एक आदर्श विकल्प है। हमारी प्रयोगशाला स्थापित करने में, एक बहु फोटॉन फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के लगभग 300 माइक्रोन की दूरी काम के साथ उपलब्ध था। यह 600 मीटर की एक अधिकतम करने के लिए हमारी छवि को सीमित करता है, तो ऊतक के दोनों पक्षों को स्कैन कर रहे हैं। हालांकि, एक प्रकाश चादर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, उनकी पूरी चौड़ाई, लंबाई और गहराई के माध्यम से छवि पूरे माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी कर सकते हैं। इस तकनीक के अन्य लाभ यह है कि एंटीबॉडी eluted जा सकता है और फिर एक और अलग एंटीबॉडी या एंटीबॉडी ही ऊतकों को फिर से लागू किया है। इस जानवर के उपयोग में काफी के रूप में अच्छी तरह से नए मस्तिष्क के ऊतकों की तैयारी के साथ जुड़े लागत कम कर देता हैएक प्रयोग के लिए। उसी कारण से, इस तकनीक को अन्य ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है। वहां पहले से ही फेफड़े, गुर्दे, हृदय, आंत, और ट्यूमर के ऊतक 26,27 पर किए गए अध्ययन किया गया है।

वहाँ भी इस तकनीक के लिए सीमाएं हैं, उदाहरण के लिए, माउस hindbrain में raphe नाभिक न्यूरॉन्स के कई प्रकार, GABAergic न्यूरॉन्स सहित शामिल हैं। हालांकि स्पष्टता और घन एक माउस मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में raphespinal फाइबर के विविध प्रकार के वितरण के अध्ययन के लिए अनुमति देगा। उन न्यूरॉन्स, जो उनके न्यूरोट्रांसमीटर या प्रोटीन मार्कर द्वारा विशेष रूप से पहचान नहीं कर रहे हैं, इस सेटिंग में पहचान नहीं की जा सकती है। इस तरह के एक विकल्प के रूप में सीटू संकरण में न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ विशिष्ट न्यूरॉन्स या फाइबर सिस्टम लेबल करने के लिए है। यह लेबलिंग प्रणाली और फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए उपलब्ध फिल्टर द्वारा सीमित दूसरी ओर, है। सभी raphespinal फाइबर इमेजिंग इसलिए एक चुनौती बनी हुई है।इन तकनीकों का एक अग्रगामी दरियाफ्त की एक intracranial इंजेक्शन के साथ संयुक्त कर रहे थे (जैसे बाकला leucoagglutinin के रूप में - पीएचए-एल), यह संभव serotonergic फाइबर, फाइबर GABAergic, और दूसरों को देखने के लिए हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution Bio Rad 161-0140 http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution Bio Rad 161-0142 http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde Sigma 158127 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea Merck Millipore 66612 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine Merck Millipore 821940 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100 Merck Millipore 648462 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose Sigma S0389 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody Merck Millipore AB938 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate Life Technologies  A-11012 https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope Leica Leica TCS SP5 MP STED http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

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References

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