चूहे में नींद को मापने के लिए polygraphic रिकॉर्डिंग प्रक्रिया

1International Institute for Integrative Sleep Medicine (WPI-IIIS), University of Tsukuba, 2Public Sector/Medical Solutions, Kissei Comtech Co., Ltd
Published 1/25/2016
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Neuroscience

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Oishi, Y., Takata, Y., Taguchi, Y., Kohtoh, S., Urade, Y., Lazarus, M. Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice. J. Vis. Exp. (107), e53678, doi:10.3791/53678 (2016).

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Abstract

Introduction

तकनीकी अग्रिमों अक्सर neurobiological प्रक्रियाओं की समझ में क्वांटम आती उपजी है। उदाहरण के लिए, मानव खोपड़ी से दर्ज की बिजली क्षमता sinusoidal तरंगों का रूप ले लिया है कि 1929 में हंस बर्जर की खोज की है, जो की आवृत्ति सीधे विषय का जागना के स्तर से संबंधित था, सोने-जगने की समझ में तेजी से प्रगति करने के लिए नेतृत्व एक जैसे दोनों पशुओं और मनुष्यों में नियमन,। 1 इस दिन electroencephlogram (ईईजी) करने के लिए, विद्युतपेशीलेख (ईएमजी), अर्थात्। साथ संयोजन के रूप में, कंकाल की मांसपेशियों द्वारा उत्पादित बिजली की गतिविधि, लगभग हर प्रयोगात्मक और नैदानिक ​​के डेटा "रीढ़" का प्रतिनिधित्व करता है मानव सहित, जानवरों से बर्ताव में cortical न्यूरॉन्स की गतिविधियों के साथ व्यवहार और शरीर विज्ञान सहसंबंधी करना चाहता है कि मूल्यांकन। सबसे बुनियादी नींद अनुसंधान प्रयोगशालाओं में इन ईईजी रिकॉर्डिंग घ हासिल कर ली है, जिसमें एक केबल आधारित प्रणाली (चित्रा 1) का उपयोग करके प्रदर्शन कर रहे हैंअता पैटर्न और स्पेक्ट्रम विश्लेषण करने के लिए बंद लाइन अधीन है [जैसे।, एक तेजी से फूरियर (FFT) एल्गोरिथ्म को बदलने के आवेदन करने वाले] विषय की सतर्कता राज्य दर्ज की जा रही निर्धारित करने के लिए। 2, 3 नींद तेजी से आँख आंदोलन के होते हैं (रेम) और गैर रेम (NREM) नींद। रेम नींद एक तेजी से कम वोल्टेज ईईजी, यादृच्छिक नेत्र आंदोलन, और मांसपेशियों atonia, मांसपेशियों को प्रभावी ढंग से लकवा मार जाता है, जिसमें एक राज्य की विशेषता है। शरीर मस्तिष्क से काफी हद तक काट दिया जाता है और गहरी नींद में प्रतीत होता है जबकि मस्तिष्क की गतिविधियों, कि जागने के जैसा दिखता है क्योंकि रेम नींद भी, उलटी सोने के रूप में जाना जाता है। इसके विपरीत, मोटर न्यूरॉन्स NREM नींद के दौरान प्रेरित कर रहे हैं, लेकिन कोई आंख आंदोलन है। ईईजी में 4 हर्ट्ज - मानव NREM नींद स्टेज 4 गहरी नींद या धीमी गति की नींद कहा जाता है और 0.5 के बीच डेल्टा गतिविधि के साथ बड़े, धीमी गति से मस्तिष्क तरंगों द्वारा की पहचान की है, जिसके तहत चार चरणों में विभाजित किया जा सकता है। दूसरी ओर, एक चूहे जैसे छोटे जानवरों में NREM नींद के चरणों के बीच एक उपखंड,एन डी चूहों, मनुष्य के रूप में देखा है कि वे नींद की लंबी समेकित अवधि के लिए नहीं है, क्योंकि ज्यादातर स्थापित नहीं किया गया।

इन वर्षों में, और ईईजी व्याख्या के आधार पर, सोने-जगने के विनियमन के कई मॉडल, सर्किट और humoral आधारित दोनों प्रस्ताव किया गया है। तंत्रिका और नींद या, वैकल्पिक रूप से, के लिए जरूरत के सेलुलर आधार "नींद ड्राइव," अनसुलझे रहता है, लेकिन जागने की अवधि के दौरान बनाता है और नींद से छितराया हुआ है कि एक homeostatic दबाव अवधारणा के रूप में की गई है। एक सिद्धांत यह अंतर्जात somnogenic कारकों जागना दौरान और उनके क्रमिक संचय नींद होमियोस्टैटिक दबाव का आधार है कि जमा है। त्रिदोषन कारकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि नींद पहली औपचारिक परिकल्पना 1892 4 में प्रकाशित रोसेनबम के काम करने के लिए जमा किया गया है, वहीं यह Ishimori 5, 6 और जो स्वतंत्र रूप से Pieron 7 था, और 100 से अधिक साल पहले, नींद को बढ़ावा देने के रसायनों के अस्तित्व का प्रदर्शन। दोनों शोधकर्ताओं hypnogenic पदार्थ या 'hypnotoxins' नींद से वंचित कुत्तों के मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (सीएसएफ) में मौजूद थे कि, प्रस्तावित, और वास्तव में साबित कर दिया। 8 पिछली सदी के दौरान नींद होमियोस्टैटिक प्रक्रिया में फंसा कई अतिरिक्त ख्यात hypnogenic पदार्थों पहचान की गई है (समीक्षा के लिए, रेफरी देखते हैं। 9), प्रोस्टाग्लैंडीन (पीजी) डी 2, 10 साइटोकिन्स, 11 एडेनोसाइन, 12 एनंदएमाइड, 13 और urotensin द्वितीय पेप्टाइड भी शामिल है। 14

एक निश्चित डिग्री करने के लिए सोने और जागने और, सर्किट आधारित सिद्धांतों से प्रेरित है कि जल्दी और मध्य 20 वीं सदी का उत्पादन निष्कर्षों में Economo 15, 16, Moruzzi और Magoun 17, और दूसरों के द्वारा प्रायोगिक कार्य के तत्कालीन प्रचलित त्रिदोषन सिद्धांत भारी पड़ रही है नींद। तिथि करने के लिए, कई "सर्किट मॉडल" प्रत्येक (समीक्षा के लिए, रेफरी। 18 देखें) गुणवत्ता और मात्रा बदलती के डेटा के द्वारा सूचित किया, प्रस्तावित किया गया है। एक मॉडलउदाहरण के लिए, धीमी गति की नींद बेसल अग्रमस्तिष्क में, एक क्षेत्र में मुख्य रूप से ब्रोका के विकर्ण बैंड और द्रव्य inominata की क्षैतिज अंग के नाभिक की consisiting कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स acetylcholine से रिहाई के एडेनोसाइन की मध्यस्थता निषेध के माध्यम से उत्पन्न होता है कि प्रस्ताव है। नींद / जगा विनियमन के 19 अन्य लोकप्रिय मॉडल हाइपोथेलेमस और ब्रेन स्टेम में ventrolateral preoptic क्षेत्र में नींद उत्प्रेरण न्यूरॉन्स के बीच परस्पर निरोधात्मक बातचीत और जगा उत्प्रेरण न्यूरॉन्स के आधार पर एक फ्लिप फ्लॉप स्विच तंत्र का वर्णन है। 18, 20, 21 इसके अलावा, में और रेम नींद से बदलने के लिए, एक समान आपस में निरोधात्मक बातचीत ब्रेन स्टेम में क्षेत्रों के लिए प्रस्तावित किया गया है, कि उदर periaqueductal ग्रे, पार्श्व pontine tegmentum, और sublaterodorsal नाभिक है। 22 सामूहिक रूप से, इन मॉडलों मूल्यवान साबित किया है heuristics और नींद अनुसंधान के क्षेत्र में अध्ययन के लिए afforded महत्वपूर्ण अर्थ व्यवस्थाएं; हालांकि, एक तुनींद जगा चक्र को विनियमित करने के आणविक तंत्र और सर्किट के टी समग्र समझ उसके घटकों में से एक और पूरी ज्ञान की आवश्यकता होगी। नीचे विस्तृत polygraphic रिकॉर्डिंग के लिए इस प्रणाली को इस लक्ष्य में सहायता करनी चाहिए।

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Protocol

आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं सुकुबा विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

ईईजी / ईएमजी रिकॉर्डिंग के लिए 1. इलेक्ट्रोड की तैयारी और केबल्स

  1. निम्नलिखित प्रक्रिया के अनुसार ईईजी / EMG रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड तैयार करें।
    नोट: इलेक्ट्रोड डिस्पोजेबल है और एक जानवर के लिए ही इस्तेमाल किया जा सकता है। ध्यान से सभी कनेक्टर्स के लिए तारों विन्यास की योजना है। सही उन्मुखीकरण के लिए कनेक्टर्स पर निशान रखें।
    1. एक 2 सेमी स्टेनलेस स्टील के तार करने के लिए एक 4 पिन हेडर के प्रत्येक पिन मिलाप। संक्षेप में, पिन करने के लिए तार का एक छोर पकड़ तार-पिन संयुक्त पर एक गर्म टांका लोहे जगह है, और बस इतना है कि संयुक्त मिलाप में सुचारू रूप से चलता सुनिश्चित करने के लिए कुछ मिलाप पिघला। पिन करने के लिए बहुत ज्यादा गर्मी लागू करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा; अन्यथा, पिन आसपास प्लास्टिक पिघल जाएगा।
    2. सिर करने के लिए पिन हैडर से जुड़ी 2 तारों में से प्रत्येक के लिए स्वतंत्र अंत मिलापएक 1.0 मिमी व्यास स्टेनलेस स्टील स्क्रू की। संक्षेप में, पेंच सिर नीचे धागे को तार के मुक्त अंत पकड़ तार-पेंच संयुक्त पर एक गर्म टांका लोहे जगह है, और बस इतना है कि संयुक्त मिलाप में सुचारू रूप से चलता सुनिश्चित करने के लिए कुछ मिलाप पिघला। शिकंजा बिना 2 तारों ईएमजी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के रूप में सेवा, जबकि शिकंजा के साथ 2 तार, ईईजी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के रूप में काम करते हैं।
    3. ईएमजी संकेत की गुणवत्ता बढ़ाने के लिए ईएमजी इलेक्ट्रोड के अंत में इन्सुलेशन 1 मिमी बंद पट्टी करने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
    4. पूरी तरह से ईईजी / ईएमजी रिकॉर्डिंग के दौरान बिजली के शोर को कम करने के लिए एक पतली लकड़ी की छड़ी या दांत लेने का उपयोग करके epoxy चिपकने के साथ सभी soldered पिन को कवर किया।
  2. नीचे वर्णित के रूप में पर्ची की अंगूठी के साथ इलेक्ट्रोड को जोड़ने के लिए एक केबल तैयार करें। इस केबल पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    1. एक 30 सेमी फ्लैट केबल का एक तार के साथ एक 4 पिन निगम / पांचवें वेतन आयोग संबंधक के प्रत्येक पिन मिलाप। संक्षेप में, पिन करने के लिए तार की छीन अंत पकड़ एक गर्म टांका लोहे जगहतार-पिन संयुक्त पर, और अभी काफी मिलाप संयुक्त में सुचारू रूप से चलता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ मिलाप पिघला।
      नोट: ईईजी / ईएमजी रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल प्रयोगात्मक जानवर पिंजरे की ऊंचाई के लिए उपयुक्त है जो फ्लैट केबल की लंबाई चुनें।
    2. मिलाप फ्लैट केबल के दूसरे सिरे पर तारों का एक टिप करने के लिए कुर्सियां ​​समेटना। संक्षेप में, तार के छीन मुक्त अंत के लिए एक समेटना सॉकेट पकड़ तार सॉकेट संयुक्त पर एक गर्म टांका लोहे जगह है, और बस इतना है कि संयुक्त मिलाप में सुचारू रूप से चलता सुनिश्चित करने के लिए कुछ मिलाप पिघला।
    3. प्रत्येक आवास समेटना एक 4 स्थिति में सॉकेट समेटना डालें।
    4. पूरी तरह से एक पतली लकड़ी की छड़ी या दांत लेने का उपयोग करके epoxy चिपकने के साथ कुर्सियां ​​समेटना को कवर किया।

माउस सिर में इलेक्ट्रोड 2. आरोपण (अवधि:। लगभग 20 मिनट)

  1. सर्जरी से पहले एक गर्म मनका अजीवाणु में सभी सर्जिकल उपकरणों जीवाणुरहित। एक पुरुष माउस anesthetize (10 - 20 सप्ताह पुरानी, ​​20 - 30 ग्राम)pentobarbital की intraperitoneal इंजेक्शन (50 मिग्रा / किग्रा) के साथ। माउस गहरा एक पैर की अंगुली बन्द रखो द्वारा anesthetized है कि जाँच के बाद, कतरनी के साथ सिर और गर्दन पर बाल दाढ़ी।
  2. Stereotaxic फ्रेम करने के लिए माउस ले जाएँ, और 2 कान सलाखों के बीच सिर को ठीक। सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पेट्रोलियम जेली लागू करें। शराब के साथ मुंडा-त्वचा को साफ और खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए एक छुरी के साथ midline के साथ काटा। खुले शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में रखने के लिए त्वचा क्लिप।
  3. (ड्रिल 2 छेद खोपड़ी में, ललाट cortical क्षेत्र के ऊपर एक (शीर्षस्थान के लिए 1 मिमी पूर्वकाल, midline के लिए 1.5 मिमी पार्श्व) और पार्श्विका क्षेत्र पर अन्य: एक कार्बाइड कटर (0.8 मिमी व्यास ड्रिल आकार) का उपयोग करके Paxinos और फ्रेंकलिन की stereotaxic निर्देशांक के अनुसार सही गोलार्द्ध के लैम्ब्डा 1 मिमी पूर्वकाल, पार्श्व 1.5 मिमी midline के लिए),। 23
  4. प्रत्येक scre के लिए 2.5 बदल जाता है - एक जौहरी स्क्रू ड्राइवर का उपयोग करके, छेद में जगह स्टेनलेस स्टील ईईजी रिकॉर्डिंग शिकंजा और 2 बनानेप्रांतस्था पर एपीड्यूरल स्थिति के लिए डब्ल्यू।
    नोट: मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान को रोकने के लिए भी गहरी शिकंजा सम्मिलित नहीं करें। शिकंजा कस खोपड़ी पर तय कर रहे हैं कि जाँच करें। यह कई रिकॉर्डिंग (आमतौर पर अधिक से अधिक 1 माह) की एक लंबी अवधि के दौरान स्थिर ईईजी संकेतों होना बहुत जरूरी है। विग्ली शिकंजा ईईजी कलाकृतियों का उत्पादन और प्रयोगात्मक अनुसूची के अंत से पहले बंद आ सकता है।
  5. इलेक्ट्रोड विधानसभा फिक्स खोपड़ी के लिए त्वरित गोंद के साथ (सीएफ धारा 1.1, पिन ऊपर की ओर कर दिया) और दंत सीमेंट के साथ कवर किया। Trapezius (गर्दन) की मांसपेशियों में संदंश के साथ द्विपक्षीय स्तर पर छोटे छेद बनाने के लिए और छेद में ईएमजी इलेक्ट्रोड के रूप में सेवा है कि स्टेनलेस स्टील के तारों डालें। पेशी के जोखिम से बचने के लिए एक रेशम के धागे (0.1 मिमी व्यास) के साथ त्वचा सीवन।
  6. Stereotaxic फ्रेम से माउस निकालें। बैक्टीरिया के संक्रमण से बचने के लिए माउस को एम्पीसिलीन (100 मिलीग्राम / किग्रा) और intraperitoneally meloxicam (1 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन और क्रमशः, शल्य चिकित्सा के बाद दर्द को कम करने के लिए। Keएक गर्मी पैड पर माउस ईपी और यह स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक कि यह निगरानी। हाउस व्यक्तिगत रूप से वसूली के दौरान माउस अन्य जानवरों द्वारा इलेक्ट्रोड के हटाने से बचने, और सर्जरी के बाद पहले दिन intraperitoneally meloxicam (1 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन के लिए।

3. रिकॉर्डिंग और प्राप्त ईईजी / EMG डेटा

  1. एक 1 सप्ताह वसूली की अवधि के, घर में एक ध्वनिरहित रिकार्डिंग कक्ष में रखा गया एक प्रयोगात्मक पिंजरे में व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक माउस के बाद। 12 घंटे की प्रकाश / 12-घंटा अंधेरे के चक्र को नियंत्रित स्वचालित रूप से 23 ± 1 डिग्री सेल्सियस के परिवेश के तापमान को बनाए रखने और (रोशनी की तीव्रता ~ 100 लक्स, 8:00 पर रोशनी)।
  2. एक रिकॉर्डिंग केबल करने के लिए माउस सिर पर ईईजी / ईएमजी इलेक्ट्रोड विधानसभा कनेक्ट करें। रिकॉर्डिंग केबल (माउस के आंदोलनों केबल के घुमा द्वारा प्रतिबंधित नहीं कर रहे हैं कि इस तरह डिजाइन किया जाता है) एक पर्ची अंगूठी और एक ईईजी / ईएमजी संकेत एम्पलीफायर से जुड़ा है कि सुनिश्चित करें। फ़िल्टर ईईजी / ईएमजी संकेतों (ईईजी, 0.5-64 हर्ट्ज; ईएमजी, 16-64 हर्ट्ज), एक एनालॉग से डिजिटल कनवर्टर (ए / डी) द्वारा 128 हर्ट्ज की एक नमूना दर पर digitize और अंत में ईईजी / EMG रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर चला रहे कंप्यूटर (तालिका 'माल', 4 वें प्रविष्टि पर रिकॉर्ड नीचे से)।
  3. रिकार्डिंग कक्ष में 3 दिन - 2 के लिए माउस आदत डालना। ईईजी / EMG रिकॉर्डिंग intraperitoneal दवा प्रशासन भी शामिल है, धीरे औषधि प्रशासन के समय में प्रत्येक आदी होना दिन पर माउस संभाल।
  4. बाद में, ईईजी / EMG रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर (तालिका 'माल', नीचे से 4 वें प्रविष्टि) शुरू करते हैं।
    1. 'डाटा जानकारी फ़ाइल' टैब का चयन करें और फ़ाइल नाम के आगे बॉक्स पर क्लिक करें। एक फ़ाइल नाम दर्ज करें और 'सहेजें' पर क्लिक करें।
    2. 'रिकॉर्डिंग हालत' टैब का चयन करें और दर्ज हो जाएगा, जो सभी ईईजी / ईएमजी चैनलों का चयन करें।
    3. 'रिकॉर्डिंग हालत' टैब में नमूने आवृत्ति (128 हर्ट्ज) का चयन करें।
    4. चयनित चैनल वीं में ठीक से प्रदर्शित कर रहे हैं, तो चेकई 'चैनल की जानकारी' टैब।
    5. 'टाइमर सेट' टैब का चयन करें और ईईजी और EMG प्रदर्शित करने के लिए 'मॉनिटर' पर क्लिक करें।
    6. ईईजी / ईएमजी संकेतों सही ढंग से प्रदर्शित कर रहे हैं की जाँच करें।
    7. 'टाइमर सेट' टैब का चयन करें और 'मुख्य टाइमर' क्षेत्र में रिकॉर्डिंग की शुरुआत और अंत के लिए घड़ी का समय निर्धारित किया है।
    8. रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए 'टाइमर सेट' टैब में 'मॉनिटर' पर क्लिक करें।
  5. आधारभूत तहत रिकार्ड ईईजी / ईएमजी संकेतों (यानी।, एक स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर माउस की नींद / जगा व्यवहार) और अलग उपचार की स्थिति (जैसे।, कैफीन प्रशासन या नकली उपचार) कई दिनों से अधिक। पिछले प्रयोगात्मक दिन के बाद pentobarbital की intraperitoneal इंजेक्शन (200 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ माउस euthanize।

ईईजी / ईएमजी डेटा के आधार पर व्यवहार राज्य के 4. स्कोरिंग

  1. ईईजी / ईएमजी विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर प्रारंभ (तालिका 'माल', नीचे से 4 वें प्रविष्टि)। चरण 3 के तहत उत्पादित ईईजी / ईएमजी कच्चे डेटा (.kcd फ़ाइल) खोलें 'नींद' टैब पर क्लिक करें और युग के समय का चयन करें। 10 सेकंड का चयन करें।
  2. 'नींद' टैब पर क्लिक करें और स्वचालित रूप से 3 चरणों में सभी 10 सेकंड युगों स्कोर करने के लिए 'मल्टी स्क्रीनिंग' का चयन (यानी।, NREM और रेम नींद, और जागने) ईईजी और EMG और बिजली वर्णक्रम विश्लेषण के आयाम के आधार पर ईईजी की। 3
  3. 'ईईजी के लिए FFT हालत' पर क्लिक करें।
  4. बिजली वर्णक्रम विश्लेषण के लिए मानकों सेट [256 दत्त अंक, Hanning खिड़की समारोह, और युग के अनुसार 5 स्पेक्ट्रा के औसत (2 ईईजी की सेकंड के लिए इसी)]। 3 क्लिक करें 'ठीक है'।
  5. क्लिक करें स्वत: जांच शुरू करने के लिए 'स्क्रीनिंग शुरू'। रन डेटा (.raf फ़ाइल) को खोलें।
  6. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1 बी और देखें तालिका 1 (स्वचालित स्क्रीनिंग के परिणामों की जाँच करें और यदि आवश्यक हो, मानक मापदंड के आधार पर स्वयं उन्हें सही 2, 3 संक्षेप में, क्लिक करें और एक गलत तरीके से रन बनाए विजिट पर बाईं माउस बटन पकड़ और गलत तरीके से रन बनाए युगों के तार के पार कर्सर खींचें। रिलीज बाईं माउस बटन और पॉप-अप विंडो में सही व्यवहार राज्य का चयन करें।
    नोट: कभी-कभी, दो सतर्क राज्यों के बीच संक्रमण पर युगों से एक राज्य के लिए स्पष्ट रूप से स्कोर करने के लिए मुश्किल हो जाता है। ऐसे मामलों में, युग प्रकट राज्य के लिए रन बनाए किया जाना चाहिए और एक ही मापदंड डेटा reproducibility सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग भर में समान युगों के लिए लागू किया जाना चाहिए।

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Representative Results

चित्रा 1 बी अलग सतर्कता राज्यों में माउस ईईजी का उदाहरण दिखाता है। तालिका 1 में दिखाया गया है ईईजी 4 हर्ट्ज से नीचे एक डेल्टा ताल के साथ बड़े, धीमी गति से मस्तिष्क तरंगों से पता चलता है और ईएमजी केवल एक कमजोर या कोई संकेत है, युगों NREM नींद के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। ईईजी 6 और 10 हर्ट्ज के बीच थीटा रेंज में तेजी से कम वोल्टेज मस्तिष्क तरंगों से पता चलता है और ईएमजी कम आयाम से पता चलता है, तो युगों रेम नींद के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। अन्य युगों जागना के रूप में वर्गीकृत किया जाना चाहिए (यानी।, कम-से-मध्यम वोल्टेज ईईजी और EMG गतिविधि की घटना)।

उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में वर्णित ईईजी / EMG रिकॉर्डिंग सेट-अप आधारभूत शर्तों के तहत या कैफीन के साथ उपचार के बाद नींद राशि और C57BL / 6 चूहों की नींद / जगा प्रोफ़ाइल निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (आंकड़े 2 और 3)।

बी के तहतअंधेरे एक (2A चित्रा) के दौरान की तुलना में प्रकाश की अवधि के दौरान सोने की बड़ी मात्रा के साथ, इन आंकड़ों के रूप में देखा रात में जानवर हैं जो aseline की स्थिति, चूहों, एक स्पष्ट circadian नींद जगा लय का प्रदर्शन किया। 12 घंटे की प्रकाश अवधि के दौरान, चूहों 6.7 घंटा और NREM और क्रमशः रेम नींद, के 0.9 घंटे से पता चला है; जबकि 12 घंटा अंधेरे अवधि के दौरान, जागना (चित्रा 2 बी) के प्रमुख था। दूसरी ओर, नींद की गुणवत्ता को सतर्कता राज्य और ईईजी शक्ति स्पेक्ट्रम विश्लेषण (चित्रा -2 सी एफ) के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है। आमतौर पर, ईईजी और ईएमजी के पोलिग्राफिक रिकॉर्डिंग, प्रकरण अवधि वितरण निर्धारित प्रत्येक सतर्कता राज्य (चित्रा -2 सी-ई) के लिए अवधि, और चरण संक्रमण संख्या मतलब के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 4 हर्ट्ज और 6 - 10 - इसके अलावा, प्रकाश और अंधेरे अवधि (चित्रा 2 एफ) के दौरान चूहों में NREM और रेम नींद के लिए ईईजी शक्ति स्पेक्ट्रम 0.5 की आवृत्ति रेंज में मजबूत ईईजी शक्ति घनत्व से पता चलता हैक्रमशः हर्ट्ज,। NREM और रेम नींद की intermingled राज्यों कभी कभी एक प्रदूषक हैं, - (4 हर्ट्ज 0.5) यह रेम नींद के दौरान ईईजी डेल्टा तरंगों की थोड़ी मात्रा भी शामिल है कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

चूहों की नींद जगा व्यवहार पर दवा के प्रभाव का आकलन करने के लिए, 24-30 ईईजी और EMG आम तौर पर लगातार 2 दिनों के लिए दर्ज की गई हैं। प्रकाश अवधि के प्रारंभिक चरण में 10:00 पर 1 दिन पर, निर्धारित करने के लिए, उदाहरण के लिए, C57BL / 6 चूहों पर कैफीन की कामोत्तेजना प्रभाव, 24 चूहों वाहन (intraperitoneally 10 मिलीग्राम / किग्रा खारा) के साथ इलाज किया गया। पशु तो 24 घंटा बाद में कैफीन (15 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ इलाज किया गया, और सतर्कता राज्यों ऑफ़लाइन जागने, रेम नींद, और NREM नींद में वर्गीकृत किया गया है। चित्रा 3 ए के प्रशासन के बाद ईईजी, ईएमजी, और hypnograms के विशिष्ट उदाहरण से पता चलता है एक C57BL 6 / माउस में कैफीन (कम polysomnographic पैनल) या वाहन (ऊपरी polysomnographic पैनल)। कैफीन increइंजेक्शन (चित्रा 3 बी) के बाद 3 घंटे के लिए C57BL / 6 चूहों 2.8 गुना में जागना की राशि ased।

आकृति 1
चूहे के लिए 1. नींद Bioassay प्रणाली चित्रा।

ईईजी संकेतों पर नजर रखने के लिए (एक), स्टेनलेस स्टील शिकंजा epidurally एक गोलार्द्ध के ललाट cortical और पार्श्विका क्षेत्रों पर प्रत्यारोपित कर रहे हैं। इसके अलावा, ईएमजी गतिविधि trapezius मांसपेशियों के भीतर द्विपक्षीय स्तर पर रखा स्टेनलेस स्टील के तारों से नजर रखी है। (बी) के एक माउस में NREM या रेम नींद या जागना दौरान 10 सेकंड के लिए ईईजी, ईएमजी, और ईईजी शक्ति घनत्व की विशिष्ट उदाहरण। NREM नींद में, ईईजी उच्च आयाम तरंगों से पता चलता है; और डेल्टा बैंड (0.5-4 हर्ट्ज) प्रमुख (बाएं) है। (- 10 हर्ट्ज 6) जा रहा है प्रमुख (मध्य) रेम नींद में, ईईजी थीटा बैंड के साथ, कम आयाम तरंगों से पता चलता है। जागना में, ईजैसे कोई आवृत्ति (दाएं) प्रमुख होने के साथ कम आयाम तरंगों से पता चलता है। ईएमजी संकेतों जागना में से दोनों NREM और रेम नींद में कम कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
ईईजी / ईएमजी रिकॉर्डिंग द्वारा मूल्यांकन C57BL / 6 चूहों में आधारभूत शर्तों के तहत चित्रा 2. सोने-जगने प्रोफाइल।

(ए) प्रत्येक व्यवहार चरण की प्रति घंटा की राशि में समय पाठ्यक्रम में परिवर्तन। व्हाइट और एक्स -axes ऊपर काली सलाखों के क्रमश: प्रकाश और अंधेरे की अवधि का संकेत मिलता है। (बी) के प्रत्येक चरण की कुल राशि 12 घंटा अंधेरे अवधि में उस के साथ तुलना में प्रकाश की अवधि के दौरान NREM और रेम नींद की एक बड़ी राशि से पता चलता है के लिए। (सी) ई का वितरणप्रत्येक चरण के pisode अवधि। प्रत्येक चरण (डी) मतलब अवधि अंधेरे अवधि में जागना के लिए रह गया है। (ई) प्रत्येक चरण के स्टेज-संक्रमण नंबर प्रकाश अवधि के दौरान अधिक लगातार बदलाव से पता चलता है। NREM दौरान (एफ) ईईजी शक्ति स्पेक्ट्रम और रेम नींद अनिवार्य रूप से प्रकाश और अंधेरे के समय के बीच कोई शक्ति घनत्व मतभेद से पता चलता है। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (एन = 5)। * पी <0.05, ** पी <0.01, बनती दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण द्वारा मूल्यांकन के रूप में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा ईईजी / ईएमजी रिकॉर्डिंग द्वारा मूल्यांकन कैफीन 3. कामोत्तेजना प्रभाव।

(ए) 15 मिलीग्राम / किग्रा (कम पैनल) की एक खुराक पर वाहन (ऊपरी पैनल) या कैफीन के प्रशासन के बाद ईईजी, ईएमजी, और hypnograms की विशिष्ट उदाहरण। (बी) के समय पाठ्यक्रम की कैफीन के इंजेक्शन के बाद एक तीन घंटे की अवधि में कैफीन। (सी) जागना साथ इलाज चूहों में जागना। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (एन = 5)। बनती दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण द्वारा मूल्यांकन के रूप ** पी <0.01, वाहन इंजेक्शन की तुलना में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

NREM नींद रेम नींद जागृत होना
ईईजी आयाम उच्च कम कम
प्रमुख ईईजी आवृत्ति डेल्टा बैंड (0.5-4 हर्ट्ज) थीटा बैंड (6-10 हर्ट्ज) कोई नहीं
ईएमजी आयाम कम कम उच्च

तालिका 1: सामान्य मानदंडों ईईजी / ईएमजी संकेतों से व्यवहार स्टेट्स स्कोर करने की।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल कम शोर, लागत प्रभावी, और उच्च throughput की शर्तों के तहत सोने और जागने के मूल्यांकन की अनुमति देता है कि ईईजी / ईएमजी रिकॉर्डिंग के लिए एक सेट-अप का वर्णन है। कारण ईईजी / ईएमजी इलेक्ट्रोड सिर विधानसभा के छोटे आकार के, इस प्रणाली माउस में दवाओं की optogenetics (ऑप्टिकल फाइबर आरोपण) या, संयोजन के रूप में एक साथ प्रवेशनी आरोपण के साथ, microinfusion सहित इंट्रा-मस्तिष्क प्रयोगों के लिए अन्य प्रत्यारोपण, के साथ जोड़ा जा सकता है अतिरिक्त विद्युत संकेतों (जैसे।, contralateral ईईजी, electrooculogram या स्थानीय क्षेत्र की क्षमता) की माप आवश्यक है, तो मस्तिष्क। 31 इसके अलावा, बहु पिन हेडर के संबंध में इलेक्ट्रोड सिर विधानसभा के डिजाइन, रिकॉर्डिंग चैनलों की संख्या में लचीलापन प्रदान करता है ।

हालांकि, व्यक्तिगत आवास इसलिए व्यवहार राज्यों के आकलन की सीमा जो इस प्रोटोकॉल, अर्थात् में वर्णित केबल आधारित डिजाइन के लिए आवश्यक है।, नींद और वाkefulness, सामाजिक संपर्क या जटिल व्यवहार परीक्षण के साथ संयोजन में। Telemetric उपकरणों अपने सीमित सुविधाओं के बिना नहीं कर रहे हैं, हालांकि इन मामलों में, एक वायरलेस नींद निगरानी प्रणाली विशेष रूप से बैटरी लागत और जीवन, संभावना अधिक उपयुक्त है।

ईईजी / ईएमजी संकेतों की गुणवत्ता चित्रा 1 और 1 टेबल। विग्ली इलेक्ट्रोड में दिखाया मापदंड के अनुसार व्यवहार राज्यों की स्कोरिंग के लिए महत्वपूर्ण है (यानी। शिकंजा) अक्सर ईईजी और FFT में कलाकृतियों में जिसके परिणामस्वरूप बिजली शोर के लिए कारण हैं विश्लेषण। ईईजी संकेत की गुणवत्ता पूरी तरह से वृद्धि हुई बिजली शोर है, जिसके परिणामस्वरूप शिकंजा और सीमेंट के बीच हवा के बुलबुले से बचने के लिए दंत सीमेंट के साथ इलेक्ट्रोड शिकंजा कवर करने के लिए इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है। ईईजी संकेतों की गुणवत्ता नेत्रहीन वे एक उच्च आयाम और कम आवृत्ति है कि इस बात की पुष्टि से एक स्पष्ट रूप से सो माउस में जाँच की जा सकती।

लागत औरप्रत्यारोपण इलेक्ट्रोड के लिए समय बहुत से सो अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं और चूहों में सोने-जगने के व्यवहार की बड़े पैमाने पर जांच के लिए एक बड़ी खामी माना जाता है। यहाँ वर्णित ईईजी / EMG रिकॉर्डिंग सिस्टम पर स्थापित और संचालित किया जा सकता कम करने वाली मध्यम ईईजी / ईएमजी रिकॉर्डिंग उपकरण के लिए इलेक्ट्रोड सामग्री और चिकित्सा आपूर्ति (माउस के अनुसार लगभग 2 अमरीकी डालर) और निवेश के लिए लागत आवर्ती सहित लागत, (पर्ची अंगूठी, एम्पलीफायर और ए / डी कनवर्टर, माउस के अनुसार लगभग 2000 अमरीकी डालर)।

समय के संबंध में, एक कुशल शोधकर्ता कम से कम 20 मिनट में एक माउस के लिए इलेक्ट्रोड आरोपण निष्कर्ष निकाल सकते हैं; और इस प्रकार, यह प्रति दिन 20 से अधिक चूहों पर संचालित करने के लिए संभव है। ईईजी / ईएमजी माप के आधार पर सोने के मूल्यांकन के समग्र दक्षता के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण कारक अधिग्रहण और ईईजी / ईएमजी डेटा की स्वत: स्कोरिंग के लिए सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल होता है। इन उद्देश्यों के लिए, वाणिज्यिक और घर में विकसित सॉफ्टवेयर की एक किस्म के एक साथ उपलब्ध हैमूल्य निर्धारण या स्कोरिंग सटीकता में उच्च परिवर्तनशीलता।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-pin header Hirose A3B-4PA-2DSA(71)
Ampicillin Meiji Seika
Analog-to-digital converter Contec AD16-16U(PCIEV)
Caffeine Sigma C0750
Carbide cutter Minitor B1055
Crimp housing Hirose DF11-4DS-2C
Crimp socket Hirose DF11-30SC
Dental cement (Toughron Rebase) Miki Chemical Product
Epoxy adhesive Konishi #16351
FFC/FPC connector Honda Tsushin Kogyo FFC-10BMEP1(B)
Flat cable Hitachi Cable 20528-ST LF
Instant glue (Aron Alpha A) Toagosei N/A
Meloxicam Boehringer Ingelheim N/A
Pentobarbital Kyoritsu Seiyaku N/A
Signal amplifier Biotex N/A
Sleep recording chamber APL N/A
SleepSign software Kissei Comtec N/A for EEG/EMG recording/analysis
Slip ring Biotex N/A
Stainless steel screw Yamazaki N/A φ1.0 × 2.0
Stainless steel wire Cooner Wire AS633

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