Arenavirus-सेल लगाव के मापन के लिए बेहद संवेदनशील परख

Immunology and Infection

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Klaus, J. P., Botten, J. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (109), e53682, doi:10.3791/53682 (2016).

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Abstract

Introduction

Arenaviruses है कि प्रकृति में 1-3 कृन्तकों में मुख्य रूप से रखा जाता है छा, एकल असहाय आरएनए वायरस के एक परिवार के हैं। जबकि इन वायरस आमतौर पर कृंतक जलाशयों 1,2 में एक स्पर्शोन्मुख, लगातार संक्रमण की स्थापना, वे मनुष्यों 3 में गंभीर बीमारी का कारण बन सकता है। महत्वपूर्ण रोगजनक प्रजातियों नई दुनिया Junin वायरस (JUNV) 4 और पुरानी दुनिया लासा वायरस 5, जो etiologic अफ्रीका में दक्षिण अमेरिका और लासा बुखार में अर्जेंटीना रक्तस्रावी बुखार के एजेंट हैं, क्रमशः शामिल हैं। लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनेंनजाइटिस वायरस (LCMV), परिवार के 6 prototypic वायरस, एक दुनिया भर में वितरण किया गया है और immunosuppressed में असुरक्षित व्यक्तियों 6 में सड़न रोकनेवाला मैनिंजाइटिस, विकासशील भ्रूण 7 में गंभीर जन्म दोष, या उच्च मारक सहित रोग राज्यों की एक किस्म के लिए जिम्मेदार है ठोस अंग प्रत्यारोपण 8,9 निम्न व्यक्तियों। संयुक्त राज्य अमेरिका की कमीखाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) अनुमोदित टीके या प्रभावी विषाणु-विरोधी इन वायरस से निपटने के लिए उपन्यास रणनीतियों उपचारात्मक इन उभरती / फिर से उभरते रोगजनकों निशाना बनाने के लिए विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण जरूरत पर प्रकाश डाला गया।

Arenavirus जीनोम दो एकल असहाय आरएनए क्षेत्रों, बड़े (एल) (~ 7.2 केबी) और छोटे (एस) (~ 3.6 केबी) खंडों 10 के होते हैं। जबकि एल खंड वायरल पोलीमर्स (एल) और मैट्रिक्स प्रोटीन (जेड) को कूटबद्ध एस खंड वायरल nucleoprotein (एनपी) और लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी) encodes। एल और एस जीनोमिक शाही सेना खंडों (vRNAs) virions 10-12 में पैक कर रहे हैं। Arenavirus संक्रमण के प्रारंभिक कदम वायरल कणों की कुर्की वायरल जीपी और अपनी इसी मेजबान सेल रिसेप्टर्स जो JUNV के लिए, मानव transferrin रिसेप्टर 1 (hTfR1) शामिल 13,14 के बीच एक संवाद के माध्यम से कोशिकाओं की मेजबानी करने के लिए है। कुर्की के बाद, JUNV कणों क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis 15 के माध्यम से सेल में रखा जाता है।कणों तो देर इंडोसोम जहां इस डिब्बे के कम पीएच जीपी 16,17 के सक्रियण चलाता है के लिए यातायात। एक बार सक्रिय, endosomal झिल्ली में जीपी इनकोडिंग संलयन पेप्टाइड सम्मिलित करता है, वायरल और endosomal झिल्ली के बीच विलय की शुरुआत। कोशिका द्रव्य, जहां वे जीनोमिक प्रतिकृति और प्रतिलेखन के लिए टेम्पलेट्स के रूप में सेवा में विरिअन पैक vRNAs की रिहाई में सफल संलयन का परिणाम है। जब वायरल संरचनात्मक प्रोटीन और vRNAs के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न कर रहे हैं, नए कण इकट्ठा और संक्रमित कोशिका से कली जीवन चक्र पूरा करने के लिए 18।

उपचारात्मक रोगजनक arenaviruses निशाना बनाने के लिए नई रणनीति की खोज की सुविधा के लिए, हमारे समूह मेजबान कारक है कि मेजबान के लिए वायरस के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन नगण्य हैं की पहचान पर ध्यान केंद्रित किया है। इस संदर्भ में, वायरल जीवन चक्र इस तरह मेजबान कारकों द्वारा नियंत्रित की सटीक मंच (ओं) को परिभाषित करने के लिए गाइड करने के लिए आवश्यक हैएंटीवायरल रणनीतियों का विकास। इस के साथ साथ, हम एक मात्रात्मक (क्यू) आरटी पीसीआर आधारित परख है कि चयनित मेजबान प्रोटीन और / या एंटीवायरल अणुओं वायरल प्रविष्टि 19 के इस प्रारंभिक चरण को प्रभावित करती है कि क्या पहचान करने के प्रयोजन के लिए arenavirus-सेल लगाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन है। Arenavirus-सेल लगाव को मापने के लिए वैकल्पिक तरीकों बायोटिन 20, फ्लोरोसेंट रंगों 21, या 22 रेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ लेबल virions चित्रित किया है। इन तरीकों को कमियाँ इनपुट वायरस की एक बड़ी मात्रा, रेडियोधर्मिता का उपयोग (संक्रमण (MOI) जैसे उच्च multiplicities), और / या इनपुट वायरस (जैसे एकाग्रता और / या वायरस की लेबलिंग) तैयार करने के लिए अतिरिक्त कदम से निपटने के लिए आवश्यकता शामिल कर सकते हैं । विशेष रूप से, उच्च MOI के उपयोग के लिए यह मुश्किल अनुत्पादक लगाव घटनाओं 15,23 बनाम उत्पादक भेद करने के लिए बनाता है। QRT- पीसीआर आधारित यहाँ वर्णित परख के लिए के रूप में कुछ के रूप में 20 पट्टिका का उपयोग कर लगाव घटनाओं का पता लगाने कर सकते हैंमिंग इकाइयों के वायरस (PFUs) है, जो एक 48 अच्छी तरह से थाली के लिए 0.0004 के MOI में तब्दील हो। इसलिए, परख की मजबूत संवेदनशीलता उच्च MOI के लिए आवश्यकता के रूप में अच्छी तरह से किसी भी वायरस लेबलिंग या एकाग्रता कदम पर काबू। इसके अलावा, परख हो सकता है i) विरिअन endocytosis को मापने के लिए के रूप में अच्छी तरह से कोशिका द्रव्य में वायरस जीनोम की रिहाई के रूप संलयन निम्नलिखित अनुकूलित और द्वितीय) (उदाहरण के लिए वायरस-विशिष्ट QRT- पीसीआर अभिकर्मकों के विकास के माध्यम से अन्य वायरस के साथ प्रयोग के अनुरूप है, देखते हैं 24-27)।

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Protocol

नोट: यह महत्वपूर्ण है कि वर्णित प्रोटोकॉल सख्त पूर्व पीसीआर तकनीक का उपयोग (कैसे एक पूर्व पीसीआर प्रयोगशाला और कैसे अच्छा पूर्व पीसीआर तकनीक का उपयोग कर प्रयोगों का संचालन करने के लिए स्थापित करने के बारे में एक उत्कृष्ट अवलोकन के लिए 28 देखें) से बाहर किया जा रहा है। यह आवश्यक है कि सभी अभिकर्मकों और उपकरणों प्रवर्धित डीएनए qPCR लक्ष्य अनुक्रम युक्त के लिए स्वतंत्र हैं और कहा कि उचित नियंत्रण इस तरह के प्रदूषण को पता लगाने के लिए जगह में हैं। प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है।

1. 48 अच्छी तरह से प्लेट्स में मीडिया और बीज कोशिकाओं को तैयार

  1. 50 मिलीलीटर जोड़कर 500 पूरा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम से (DMEM) युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन 1% मिलीलीटर, और HEPES (एन-2-hydroxyethylpiperazine-एन-2-ईथेन सल्फोनिक एसिड) बफर समाधान तैयार गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 5 मिलीलीटर DMEM के एक 500 मिलीलीटर की बोतल के लिए एक 100x पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन और 100x HEPES बफर समाधान में से प्रत्येक की। यह अभिकर्मक 4 में संग्रहित किया जा सकता76; महीनों के लिए सी।
  2. बीज 2.5 x 10 4 वेरो E6 प्रति अच्छी तरह से पूरा DMEM के 500 μl के अंतिम मात्रा में एक 48 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में कोशिकाओं। 10 से 18 घंटे के लिए युक्त 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    1. कार्यदिवस के अंत में प्लेट बीज। या तो नकल या तीन प्रतियों कुओं में प्रत्येक वायरस नमूने के परीक्षण।
      नोट: इस परख के लिए एक 48 अच्छी तरह से आधारित प्लेटफॉर्म वर्णन किया गया है, जबकि यह 96 या 384 अच्छी तरह प्लेटें में उपयोग के लिए नीचे परख पैमाने पर करने के लिए संभव होना चाहिए।

2. वायरस-सेल लगाव बाहर ले

नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल वायरस, JUNV तनाव खरा # 1 (सी # 1), सफलतापूर्वक JUNV रोग की रोकथाम के लिए 29 एक जीवित तनु वैक्सीन के रूप में इस्तेमाल किया गया है। JUNV सी # 1 दोनों vivo में इन विट्रो में सीरियल बीतने के माध्यम से उग्र JUNV तनाव एक्सजे से ली गई है और 12 से 30 अमीनो एसिड पैतृक एक्सजे तनाव से अलग किया गया था। becausई JUNV सी # 1 एक जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) -2 रेटेड रोगज़नक़ है, काम के लिए इस खंड में वर्णित उचित बीएसएल -2 प्रथाओं 31 का उपयोग कर बाहर किया जाना चाहिए। यह व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (जैसे आंखों की सुरक्षा, प्रयोगशाला कोट, दस्ताने डबल), एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग भी शामिल है, और यह सुनिश्चित करना कि सभी कर्मियों संस्थागत प्रशिक्षण और सुरक्षित रूप से इस जीव को संभालने के लिए आवश्यक मंजूरी मिली है।

  1. JUNV सी # 1 नमूना (एस) वांछित PFUs करने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए पतला या ठंडा पूरा DMEM में गठन इकाइयों ध्यान केंद्रित करने और अच्छी तरह से प्रत्येक में जोड़ने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर दुकान।
    नोट: के रूप में पूरा DMEM में पतला वायरस से बाध्यकारी अध्ययन करने के लिए एक विकल्प, एक कम सीरम एकाग्रता (2%) और एक उचित बफर के साथ पीबीएस युक्त एक न्यूनतम माध्यम का उपयोग सीरम वायरस लगाव के साथ हस्तक्षेप का कारण हो सकता है कि क्या स्थापित करने के लिए। वैकल्पिक वायरस के लिए इसी तरह के लगाव प्रोटोकॉल bicarbo बिना RPMI 1640 माध्यम के उपयोग की सूचना दी हैनैट 0.2% गोजातीय सीरम albumin, 10 मिमी (2- (morpholino) ethanesulfonic एसिड) से युक्त है, और 10 मिमी HEPES, 6.8 पीएच 32। यह बाध्यकारी मीडिया पीएच परिवर्तन है कि जब मीडिया इनक्यूबेटर के सीओ 2 -environment से निकाल दिया जाता है हो सकता है को रोकने के लिए बेहतर हो सकता है।
    1. 200 से 2,000 से लेकर PFUs के साथ कुओं टीका लगाना अनुत्पादक लगाव घटनाओं को सीमित करना। चित्रा 2 में दिखाया गया है, इस परख के रूप में कुछ के रूप में 20 PFU (या के रूप में कई के रूप में 2 x 10 6 pfu) का उपयोग कर लगाव का पता लगाने में सक्षम है।
    2. एक मास्टर कोशिकाओं पर टीका के लिए वायरस का मिश्रण बनाएं। प्रत्येक वायरस नमूना अच्छी तरह से प्रति 50 μl के एक मात्रा में नकली कुओं पर टीका दिया जाएगा। इसलिए, अगर अच्छी तरह से प्रति वायरस के 2,000 PFUs के अलावा वांछित है, बर्फ के 120 μl की कुल मात्रा में 4,800 PFUs पतला ठंड DMEM पूरा करें।
      1. परख की विशिष्टता के लिए नियंत्रित करने के लिए है कि या तो TfR1 (TRVb) या ऍक्स्प व्यक्त नहीं करते चीनी हैम्स्टर अंडाशय सेल लाइनों की एक जोड़ी मिलान का उपयोगress hTfR1 (TRVb -1) इन कोशिकाओं को JUNV अनुलग्नक के रूप में या कम किया जा सकते हैं या तो नहीं करना चाहिए, क्रमशः 13,33। वैकल्पिक रूप से, arenavirus लगाव 34 या 35 प्रवेश को रोकने के लिए इस तरह के proteinase कश्मीर के रूप में एक प्रोटीज के साथ कोशिकाओं का इलाज। के रूप में वे कोशिकाओं 13,36 में JUNV के प्रवेश को ब्लॉक करने के लिए जाना जाता है घुलनशील hTfR1 या monocolonal एंटीबॉडी ch128.1, जो hTfR1 के लिए विशिष्ट है, यह भी माना जा सकता है। इसके अतिरिक्त, मुफ्त mannose 14 या JUNV विशेष को निष्क्रिय करने एंटीबॉडी 37 के साथ कणों की ऊष्मायन के साथ कोशिकाओं के pretreatment वायरस प्रवेश बाधित कर सकते हैं।
      2. कृपया ध्यान दें, तथापि, कि इन बाद अभिकर्मकों और दृष्टिकोण, JUNV प्रवेश को अवरुद्ध होने के बावजूद, लगाव ब्लॉक करने के लिए बात की पुष्टि नहीं की है, हालांकि यह एक संभावना विवरण है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल को औपचारिक रूप से है कि क्या इन विभिन्न दृष्टिकोणों प्रभाव विरिअन लगाव निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें औरजगह या तो एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में या 15 मिनट के endocytosis बाहर ले जाने के लिए चढ़ाया कोशिकाओं की क्षमता को बाधित करने के लिए बर्फ पर।
  3. अगले, अच्छी तरह से प्रत्येक से पूरा DMEM aspirate और तेजी से प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार धोने बर्फ के ठंडे पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) 7.4 पीएच के 100 μl का उपयोग कर। तब उचित कुओं के लिए प्री-पतला वायरस के नमूने (2.1 चरण में तैयार) के 50 μl जोड़ें।
  4. प्लास्टिक की चादर में प्लेट लपेटें और तुरंत या तो बर्फ पर या 1 1.5 घंटे के लिए वायरस लगाव घटित करने के लिए अनुमति देने के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में वापस जगह है। प्लेट, इस कदम भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखें बफर धोने, और वायरस के नमूने।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के पूरा होने के बाद, वायरस inoculum aspirate और प्रत्येक अच्छी तरह से ठंडा पीबीएस के 200 μl के साथ 3 बार धोएं।

3. वायरल शाही सेना निष्कर्षण

  1. वाणिज्यिक किट का उपयोग करके (जैसे, RNeasy मिनी किट) एक्कोर से JUNV सी # वायरल शाही सेना शुद्ध 1 कणों monolayers से जुड़ीडिंग निर्माता प्रोटोकॉल के। विशेष रूप से, नीचे सूचीबद्ध संशोधनों के साथ RNeasy मिनी हैंडबुक में पृष्ठों 23-28 (4 वें संस्करण अप्रैल 2006) पर "स्पिन प्रौद्योगिकी प्रोटोकॉल का उपयोग पशु कोशिकाओं से कुल शाही सेना की शुद्धि" का पालन करें।
    1. Lyse कोशिकाओं lysis बफर RLT के 350 μl सीधे प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से जोड़कर कदम 1 बी में निर्देशन के रूप में। बफर कई बार मिश्रण सेल सुनिश्चित करने के लिए। ध्यान दें कि कोशिकाओं को आसानी से इस बफर में lyse और पूर्ण सेल एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत कुओं को देखने के द्वारा सत्यापित किया जा सकता।
    2. स्थानांतरण किट स्तंभ (कदम 3 ए) के परिणामस्वरूप सेल lysate और के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल के बाकी का पालन करें। इस बिंदु पर, वायरस lysis बफर से निष्प्रभावी कर दिया गया है, ताकि प्रोटोकॉल के बचे हुए चरणों वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट के बाहर किया जा सकता है बशर्ते किट नलियों संक्रामक वायरस से दूषित नहीं कर रहे थे।
    3. निर्माता प्रोटोकॉल है, जो एक addit है से वैकल्पिक कदम 9 को शामिल करेंस्पिन स्तंभ के ional centrifugation बफर RPE के किसी भी संभावित भार समाप्त करने के लिए।
    4. अंतिम चरण में निर्माता प्रोटोकॉल (चरण 10), elute nuclease मुक्त DDH 2 ओ के 30 μl का उपयोग कर स्पिन स्तंभ से शुद्ध शाही सेना इस बिंदु पर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर शाही सेना या QRT- पीसीआर परख में सीधे इस्तेमाल करते हैं। न्युक्लिअसिज़ द्वारा शुद्ध वायरल शाही सेना के नमूने की गिरावट को रोकने के लिए, nuclease मुक्त अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग करें और बर्फ पर thawed शाही सेना के नमूने रखने के लिए।
      नोट: बफ़र RLT और RW1 guanidine नमक होते हैं और ब्लीच के साथ नहीं मिलाया जाना चाहिए। बफर RW1 इथेनॉल में शामिल है।

4. QRT- पीसीआर वायरल जीनोम का मापन

  1. सीडीएनए में बाद में qPCR के लिए JUNV सी # 1 एस खंड आरएनए को परिवर्तित करने के लिए, 50 μl की कुल मात्रा में आरटी के लिए वायरल शाही सेना (कदम 3.1.4 में उत्पन्न) विषय।
    1. nuclease की 6.75 μl: आरटी प्रतिक्रिया की स्थापना करने के लिए, पहली बार एक मास्टर मिश्रण प्रतिक्रिया प्रति निम्नलिखित अभिकर्मकों के प्रत्येक युक्त बनानेमुक्त DDH 2 हे, आरटी प्राइमर एस के एक 2 माइक्रोन शेयर के 5 μl 2098- 2075- करने के लिए (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), जो एस खंड जीनोमिक शाही सेना के एनपी क्षेत्र के 5 μl के लिए पूरक है 10X पीसीआर बफर द्वितीय, एक 25 मिमी 2 MgCl समाधान के 11 μl, आरटी एंजाइम, RNase अवरोध के 1 μl (0.4 यूनिट) के 1.25 μl (62.5 इकाइयों), और dNTPs की एक 500 माइक्रोन शेयर के 10 μl।
      नोट: arenavirus प्रतिकृति के दौरान, 4 वायरल एस खंड आरएनए प्रजातियों उत्पन्न कर रहे हैं: एक पूरी लंबाई की जीनोमिक आरएनए (vRNA), एक पूरी लंबाई की antigenomic आरएनए (vcRNA) (कि vRNA के रिवर्स पूरक है), और दो subgenomic mRNAs एनपी और जीपी जीन एन्कोडिंग, क्रमशः। यहाँ सूचीबद्ध आरटी प्राइमर केवल एस खंड vRNA के लिए विशिष्ट है, लेकिन नहीं vcRNA, एनपी mRNA, या जीपी mRNA।
    2. धीरे आरटी मास्टर मिश्रण मिश्रण है और फिर व्यक्तिगत 0.2 मिलीग्राम पीसीआर ट्यूबों में 40 μl विभाज्य। प्रत्येक ट्यूब वायरल शाही सेना के 10 μl जोड़ें। शामिल i) कोई टेम्पलेट नियंत्रण ट्यूब (जैसे। Nuclease मुक्त DDH 2 हे 40 के लिए मास्टर मिश्रण के ii) कोई आरटी एंजाइम नियंत्रण μl) और के 10 μl (जैसे कि प्राप्त नहीं किया मास्टर मिश्रण के 40 μl के लिए एक ज्ञात पॉजिटिव वायरल शाही सेना नमूना के 10 μl जोड़ने किसी भी आरटी एंजाइम) प्रवर्धित डीएनए वायरल लक्ष्य अनुक्रम युक्त के साथ आरटी अभिकर्मकों के प्रदूषण के लिए स्क्रीन करने के लिए। पूर्ण आरटी मास्टर मिश्रण सेलुलर शाही सेना की उपस्थिति में परख विशिष्टता के लिए नियंत्रित करने के साथ असंक्रमित कोशिकाओं से निकाले शाही सेना को शामिल करें।
    3. इसके अतिरिक्त, पूर्ण गुरु मिश्रण करने के लिए एक ज्ञात पॉजिटिव वायरल शाही सेना नमूना आरटी अभिकर्मकों की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए शामिल हैं। ध्यान दें कि आरटी प्रतिक्रिया की मात्रा यदि आवश्यक हो तो 25 μl को कम किया जा सकता है।
  2. 10 मिनट, 30 मिनट के लिए 48 डिग्री सेल्सियस, और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 25 डिग्री सेल्सियस: निम्नलिखित साइकिल चालन की स्थिति के लिए आरटी ट्यूबों के अधीन। ध्यान दें कि नमूने एक 4 डिग्री सेल्सियस कदम जोड़कर इस बिंदु पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है या thermocycler में रात भर के लिए छोड़ दिया।
  3. पी25 μl की कुल मात्रा में erform qPCR।
    1. निम्नलिखित संयोजन के द्वारा एक qPCR मास्टर मिश्रण बनाओ: (एक 9 माइक्रोन के शेयर का) 2.5 μl प्रत्येक के आगे पीसीआर प्राइमर S1937 + 1958+ करने के लिए (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT -3 ') और रिवर्स पीसीआर प्राइमर एस 2001 को 1982- (5 करने के लिए qPCR जांच एस 1960+ की '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), एक 2 माइक्रोन शेयर 2.5 μl () 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), और 2 एक्स यूनिवर्सल qPCR मास्टर के 12.5 μl मिश्रण। ध्यान दें कि आगे प्राइमर यहां बताया, जिसके लिए JUNV सी # 1 विशिष्ट है, NT मूल रूप से सूचना दी प्राइमर अनुक्रम 38 है, जो उग्र JUNV तनाव रोमेरो लक्ष्य से 1 से अलग है।
    2. धीरे समाधान मिश्रण है और फिर अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 20 qPCR μl जोड़ें। उचित qPCR कुओं के लिए प्रत्येक आरटी प्रतिक्रिया के 5 μl जोड़ें। प्रत्येक नमूना परीक्षण के लिए तीन प्रतियों में qPCR आचरण। ध्यान दें कि पीसीआर प्रतिक्रिया मात्रा के रूप में छोटा रूप में 12.5 μl को कम किया जा सकता है अगर जरूरत है।
      नोट: के साथ जुड़े सॉफ्टवेयरqPCR मशीन प्लाज्मिड JUNV सी # 1 एनपी जीन है, जो qPCR प्राइमर का लक्ष्य है एन्कोडिंग के मानक dilutions की एक श्रृंखला के लिए प्रत्येक अज्ञात नमूना के मूल्य की तुलना द्वारा JUNV सी # 1 एस खंड जीनोमिक शाही सेना के पूर्ण प्रतिलिपि संख्या उत्पन्न होगा और जांच की स्थापना की। qPCR परख केवल मूल्यों है कि मानक वक्र की सीमा के भीतर गिर के लिए quantitation प्रदान कर सकते हैं। 5, 50, 5 एक्स 10 3, अच्छी तरह से 5 एक्स 10 5, और 5 10 x 7 प्रतियां प्रति: इस कारण से, प्लाज्मिड की निम्न मात्रा (तीन प्रतियों कुओं में) शामिल हैं।
  4. thermocycler में qPCR प्लेट लोड करके निम्न स्थितियों की प्रतिक्रिया चलाने: 10 मिनट और 15 सेकंड और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र के लिए 95 डिग्री सेल्सियस।
    1. लीजिए और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक नमूने में वायरल शाही सेना वर्तमान की मात्रा निर्धारित करने के लिए डेटा का विश्लेषण।
  5. प्लाज्मिड के एक नव शुद्ध नमूना qPCR टार युक्त का उपयोग कर एक मानक स्थापित करने के लिए वक्रअनुक्रम मिलता है, इस घोल में प्लाज्मिड नकल संख्या का निर्धारण।
    1. प्लाज्मिड की आणविक वजन की गणना। पूरे प्लाज्मिड के अनुक्रम में जाना जाता है, तो यह निम्न सूत्र का उपयोग गणना: मेगावाट = ([एक * ३१२.२] [जी * ३२८.२] [सी * 288.2] [टी * ३०३.२] - 61.13)। एक विशेष न्यूक्लियोटाइड डबल असहाय प्लाज्मिड के हर कतरा पर पाया की कुल संख्या शामिल करने के लिए याद रखें।
    2. प्लाज्मिड के आकार में जाना जाता है लेकिन उसका सही अनुक्रम नहीं है, तो इस धारणा है कि प्रत्येक dsDNA आधार जोड़ी 600 मेगावाट की एक मेगावॉट की गणना के तहत है।
      नोट: pCAGGS-JUNV सी # 1 एनपी यहां इस्तेमाल किया प्लाज्मिड 4.2 x 10 6 के एक मेगावाट है।
    3. एक बार जब प्लाज्मिड की मेगावाट निर्धारित किया गया है, की गणना कैसे μl प्रति कई प्रतियां शेयर प्लाज्मिड समाधान में मौजूद हैं।
    4. सबसे पहले समाधान में प्लाज्मिड की कुल माइक्रोग्राम गणना, तो प्लाज्मिड के मोल्स इस परिवर्तित (जैसे प्लाज्मिड के 69 माइक्रोग्राम पानी के 300 μl, तो 6.9 एक्स 1 में समाहित कर रहे हैं, तोप्लाज्मिड * 1 तिल के 0 -5 जी / प्लाज्मिड के 4.2 x 10 = 6 ग्राम प्लाज्मिड के 1.6 x 10 -11 मोल्स) है, जो संख्या में कॉपी करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है (उदाहरण के 1.6 x 10 -11 प्लाज्मिड के मोल्स * ६.०२२ x 10 23 अणुओं / मोल = 9.8 x 10 12 अणुओं (या प्रतियां))।
    5. (जैसे 9.8 x 10 12 प्रतियां / 300 μl = 3.28 x 10 10 प्रतियां) है कि समाधान की मात्रा द्वारा प्लाज्मिड समाधान में प्लाज्मिड की कुल प्रतियां फूट डालो μl प्रति प्रतियां प्राप्त करने के लिए।
    6. इस समाधान उचित रूप से पतला तो यह है कि 5 μl मात्रा में पीसीआर थाली पर लोड किया जा सकता प्रतिलिपि मानक वक्र स्थापित करने की जरूरत की संख्या की सीमा देने के लिए।

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Representative Results

प्रोटोकॉल की धारा 4 में वर्णित के रूप में संवेदनशीलता और qPCR परख के गतिशील रेंज को प्रदर्शित करने के लिए, एक प्लाज्मिड JUNV सी # 1 (रेंज 5-5 10 x 7 प्रतियां) की एनपी जीन एन्कोडिंग के ज्ञात मात्रा qPCR के अधीन थे। परख संवेदनशील है और मज़बूती से लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड की 5 प्रतियां (चित्रा 2) के रूप में कुछ पता लगा सकते हैं। इसके अलावा, परख के गतिशील रेंज में बड़े रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है, टेम्पलेट के कम से कम 7 लॉग कवर कर सकते है और। जबकि नहीं दिखाया गया है, हम न्यूक्लिक एसिड की प्रतियां कई के रूप में 5 एक्स 10 9 के रूप में पहचान की है।

प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में JUNV सी # 1 कण लगाव की माप के लिए परख की उपयोगिता को वर्णन करने के JUNV सी # 1 विभिन्न मात्रा वेरो E6 कोशिकाओं को prebound थे। दूर अपार कणों धोने के बाद, कोशिकाओं आरएनए शुद्धि के लिए lysed थे और जिसके परिणामस्वरूप शाही सेना के नमूने qRT के अधीन थे-PCR। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, परख के रूप में कुछ 20 के रूप में या के रूप में कई के रूप में 2 x 10 6 PFU, जो 0.0004 और 40 क्रमश MOIs करने के लिए अनुवाद का उपयोग कर वायरल लगाव घटनाओं का पता लगाने कर सकते हैं।

जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, यह प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए न केवल वायरल लगाव को मापने के लिए संभव है, लेकिन यह भी जीनोम समय के साथ भेजे गए वायरल कणों में निहित प्रवर्धन की दर। इस संशोधित दृष्टिकोण निर्धारित करने के लिए वायरल प्रविष्टि (जैसे कण endocytosis और / या संलयन और कोशिका द्रव्य में वायरल जीनोम की रिहाई) के बचे हुए चरणों में आगे दोष उत्पन्न हो सकता है कि क्या एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। दिलचस्प है, वायरल जीनोम की मात्रा 6 घंटा पहले निम्नलिखित लगाव है, जो पता चलता है कि भेजे गए वायरल जीनोम के एक हिस्से को अपमानित दौरान कम करने के लिए प्रकट होता है। यह कणों कि सेल में रखा जाना असफल और extracell में नीचा करने के लिए हो सकता हैular अंतरिक्ष या शायद endolysosomal नेटवर्क के भीतर गिरावट की वजह से। दिखाया गया डेटा दर्शाता है कि 12 या 18 घंटा के बाद संक्रमण सक्रिय जीनोम प्रतिकृति के लिए स्क्रीन करने के लिए इष्टतम बार होगा।

आकृति 1
चित्रा 1:। कार्यप्रवाह प्रोटोकॉल का चित्रण वायरस-सेल लगाव परख के प्राथमिक चरण 1) 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के साथ वायरस कणों की ऊष्मायन अपार वायरस को दूर करने के लिए वायरस-सेल लगाव washes के द्वारा पीछा होने के लिये अनुमति के लिए कर रहे हैं, 2) शुद्धि कोशिकाओं से वायरल शाही सेना के, 3) रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) JUNV एस खंड जीनोमिक आरएनए (vRNA) सीडीएनए में, और 4) qPCR वायरस-सेल लगाव का एक उपाय के रूप में JUNV एस vRNA की प्रतियां गणना करने के लिए परिवर्तित करने के लिए। यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।


चित्रा 2:। JUNV एस खंड जीनोम का पता लगाने के लिए qPCR परख संवेदनशील है और एक बड़ी गतिशील रेंज पर इस्तेमाल किया जा सकता JUNV एस खंड qPCR प्राइमर जांच सेट सही ज्ञात मात्रा को मापने के लिए अपनी क्षमता का परीक्षण किया गया था (5, 16.6, 50, 5 एक्स 10 3, 5 x 10 5 या 5 10 x 7 एक डीएनए मानक नियंत्रण लक्ष्य अनुक्रम एन्कोडिंग प्लाज्मिड की प्रतियां)। चित्रित प्रवर्धन भूखंडों (ए) और मानक वक्र फिट लाइनों (बी) कर रहे हैं। आर 2, किताब-जांच सेट के सहसंबंध गुणांक। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: JUNV-सेल लगाव परख मज़बूती के उपायकण के रूप में कुछ के रूप में 20 PFU। वेरो E6 कोशिकाओं का उपयोग लगाव 2 एक्स 10 2, 2 एक्स 10 3, 2 एक्स 10 4, 2 x 10 5, या 2 के JUNV सी # ज्ञात मात्रा 1 (2 एक्स 10 1 के साथ prebound थे, एक्स 10 6 pfu) 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए। अनबाउंड कणों धोने से हटा दिया गया है, कोशिकाओं आरएनए निकासी के लिए lysed रहे थे, और जिसके परिणामस्वरूप शाही सेना के नमूने JUNV सी # 1 एस खंड vRNA वेरो E6 कोशिकाओं को कण लगाव का एक उपाय के रूप में पता लगाने के लिए QRT- पीसीआर के अधीन थे। डेटा ± SEM के डुप्लिकेट कुओं से अच्छी तरह से प्रति मतलब नकल संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 4
चित्रा 4:। संक्रमण के बाद JUNV सी # 1 जीनोम प्रतिकृति के काइनेटिक्स वेरो E6 कोशिकाओं के साथ 2 एक्स 10 3 JUNV की PFU सी # 1 (0.04 के MOI) 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए incubated रहे थे। ठंडा पीबीएस में कई washes के बाद, कोशिकाओं या तो तुरंत काटा गया (0 घंटा समय बिंदु)या संग्रह से पहले संकेत समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम। प्रत्येक मामले में, कुल शाही सेना कोशिकाओं से निकाले और QRT- पीसीआर के अधीन JUNV सी # 1 एस खंड vRNA पता लगाने के लिए किया गया था। मान ± SEM के डुप्लिकेट कुओं से अच्छी तरह से प्रति के रूप में मतलब प्रतियां सूचीबद्ध हैं।

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Discussion

प्रोटोकॉल का वर्णन हम सीधा है और मजबूत निम्नलिखित महत्वपूर्ण विचार मनाया जाता है प्रदान की है। सबसे पहले, सख्त पूर्व पीसीआर तकनीक नियोजित किया जाना चाहिए (एक उत्कृष्ट समीक्षा के लिए 28 देखें)। यह आवश्यक है कि सभी अभिकर्मकों और उपकरणों प्रवर्धित डीएनए qPCR लक्ष्य अनुक्रम युक्त के लिए स्वतंत्र हैं और कहा कि उचित नियंत्रण इस तरह के प्रदूषण को पता लगाने के लिए जगह में हैं। दूसरा, प्रोटोकॉल, वायरस, कोशिकाओं, और मीडिया के वायरस-सेल लगाव हिस्से के लिए सतह बाध्य virions की endocytosis को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए। तीसरा, शाही सेना निकासी के लिए एकत्र की कोशिकाओं की मात्रा आरएनए शुद्धि फिल्टर की शाही सेना बाध्यकारी क्षमता अधिक नहीं होनी चाहिए। चौथा, शुद्ध वायरल शाही सेना के नमूने nuclease मुक्त अभिकर्मकों और उपकरणों के उपयोग के माध्यम से और उन्हें बर्फ पर रखते हुए जब thawed द्वारा ribonuclease की मध्यस्थता गिरावट से संरक्षित किया जाना चाहिए। पांचवां, मानक वक्र की सीमा qPCR परख में शामिल पर्याप्त बड़ी होना चाहिएसभी मूल्यों अज्ञात नमूनों से मनाया कब्जा करने के लिए। छठी, तकनीकी प्रतिकृति परख के दोनों वायरस-सेल लगाव हिस्से के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत शाही सेना के नमूने की qPCR के लिए शामिल किया जाना चाहिए। सातवीं, नियंत्रण (जैसे सेल लाइनों है कि hTfR1 व्यक्त करते हैं या नहीं) परख की विशिष्टता के लिए नियंत्रित करने के लिए शामिल किया जा सकता है। अंत में, सभी कर्मियों को उचित जैव सुरक्षा प्रशिक्षण और संस्थागत अनुमोदन को संभालने के लिए संक्रामक JUNV सी # 1 या अन्य रोगजनक arenaviruses होना चाहिए।

एक qPCR जांच मुख्य रूप से सुनिश्चित करने के लिए उत्पाद की विशिष्टता पीसीआर प्रतिक्रिया के प्रत्येक चरण के दौरान परिलक्षित किया जा रहा प्रोटोकॉल की qPCR भाग कहता है। परख की लागत कम किया जा सकता है, तथापि, एक और qPCR रसायन है कि इस मामले की जांच की आवश्यकता नहीं है के पक्ष में इस qPCR जांच को नष्ट करने से (जैसे विषम डाई SYBR ग्रीन मैं 25 का उपयोग) और / या की मात्रा कम करने से qPCR प्रतिक्रिया मिश्रण का इस्तेमाल किया। एक जांच स्वतंत्र qPCR एप्लिकेशन हैंरोच का इस्तेमाल किया जाता है, यह सत्यापित करने के लिए कि प्रतिक्रिया की स्थिति पर्याप्त कड़े qPCR प्राइमरों की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा। यह भी पता है कि arenavirus शाही सेना, कोशिकाओं या virions से निकाले गए हैं, nonspecifically एक वायरस-विशिष्ट आरटी प्राइमर 12 के अभाव में आरटी दौरान सीडीएनए फार्म के लिए primed किया जा सकता है के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, एक vRNA विशेष आरटी प्राइमर का उपयोग सख्ती से आरटी प्राइमर द्वारा लक्षित सिर्फ vRNA प्रजातियों को प्रतिबिंबित नहीं करते पता चला संख्या कॉपी। या जीनोम के लिए विशिष्टता antigenome की आवश्यकता है, हम biotinylated आरटी प्राइमर और streptavidin मोतियों 12 के उपयोग के माध्यम से इस अविशिष्ट भड़काना घटना को नाकाम करने के लिए एक साधन को सूचित किया है तो।

इस परख की एक महत्वपूर्ण शक्ति अपने चरम संवेदनशीलता है। अन्य arenavirus-सेल लगाव की विशेषता assays radioactively लेबल 22, 20 या biotinylated fluorescently लेबल 21 कणों की 0.2 MOIs, 100, या 1000 के लिए आवश्यक है, संबंधितLy। जबकि अच्छा संवेदनशीलता में radioactively लेबल कणों परिणामों का उपयोग करते हैं, यह जो इस विशेष परख के साथ जुड़े साजो जटिलता और सुरक्षा चिंताओं को बढ़ाता है रेडियोधर्मिता का उपयोग करते हैं, जरूरी है। यहाँ वर्णित qPCR आधारित पद्धति की आवश्यकता है (एक 48 अच्छी तरह से थाली में से MOI ~ 0.0004) के रूप में छोटा रूप में 20 PFU और मज़बूती से MOIs की एक बड़ी गतिशील रेंज पर कुर्की का पता लगाने कर सकते हैं (0.0004 से जैसे MOIs करने के लिए कम से कम 40) (चित्रा 3 )। इस परख के मजबूत संवेदनशीलता यह संभव मानक संक्रामक वायरस से उत्पादक बाध्यकारी घटनाओं की अधिक सटीक माप के लिए कम MOIs का उपयोग करने के लिए बनाता है। उच्च संवेदनशीलता भी काफी, परख के लिए आवश्यक वायरस की मात्रा कम कर देता है और ऐसा करने में सीमा से निपटने के लिए अतिरिक्त कदम है कि virions की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं (परख में इस्तेमाल किया जा रहा virions की जैसे पॉलीथीन ग्लाइकोल आधारित वर्षा, साथ virions लेबलिंग fluorophores या रेडियोधर्मी आइसोटोप और / या virio की सुक्रोज बैंडिंगएन एस)। इसके अतिरिक्त, qPCR परख खुद को बेहद सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रदर्शन करने के लिए सरल है।

सेल लगाव परख वर्णित वायरल कण endocytosis के साथ ही वायरस संलयन के अंतिम कदम है, जो कोशिका द्रव्य में वायरल जीनोम की रिहाई सहित वायरल प्रविष्टि के अतिरिक्त चरणों को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है। कण endocytosis मापने के लिए, लगाव प्रोटोकॉल का एक ही कदम 2.5 कदम है, जो 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं के कणों की कुर्की के माध्यम से पालन किया जाएगा। कोशिकाओं तो वायरल कणों, endocytosed जा करने के लिए किसी भी बाह्य बाध्य virions के रूप में वर्णित है कि 22,24 endocytosed नहीं थे पट्टी करने के लिए एक प्रोटीज के साथ उपचार के बाद अनुमति देने के लिए गरम किया जाएगा। धारा 3 और इस प्रोटोकॉल के 4 तब वायरल शाही सेना को निकालने और endocytosis के एक उपाय के रूप में वायरल जीनोमिक शाही सेना की प्रतियां quantitate करने के बाद किया जाएगा। वायरल और endosomal झिल्ली के विलय के बाद जीनोम uncoating मापने के लिए, कोशिकाओं के साथ prebound किया जाएगा4 डिग्री सेल्सियस पर वायरस, (endocytosis और फ्यूजन की अनुमति के लिए) गरम और बाहरी कणों की छीन लिया, और उसके बाद के विश्लेषण के लिए एकत्र। एक दृष्टिकोण में, कोशिकाओं intracellular पुटिकाओं संरक्षित करने के लिए, और फिर 2 भागों में विभाजित कर एक isotonic बफर में lysed किया जा सकता है: एक है कि (Uncoated वायरल आरएनए गिरावट की संभावना है) RNases के एक कॉकटेल के साथ इलाज किया जाएगा और दूसरे यह है कि नहीं होगा 39 । वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं साइटोसोलिक या endosomal अंशों 40 में विभाजित किया जा सकता है। दोनों ही मामलों में, QRT- पीसीआर वायरल जीनोम uncoating के एक उपाय के रूप में कोशिका द्रव्य में वायरल जीनोम quantitate करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। पिछले है, QRT- पीसीआर परख आसानी से वायरस लगाव, endocytosis, या आरटी पीसीआर अभिकर्मकों ब्याज के नए वायरस के अनुरूप रहे हैं प्रदान की अन्य वायरस के लिए फ्यूजन अध्ययन करने के लिए (उदाहरण 24-27 को देखने के लिए) को संशोधित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

हम अनुदान T32 AI055402 (जे), R21 AI088059 (जेबी), और P20RR021905 के माध्यम से उपयोगी विचार विमर्श और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान इन अध्ययनों के समर्थन के लिए (जेबी) के लिए मार्कस थाली, नाथन रॉय, क्रिस्टोफर Ziegler, एमिली ब्रूस, और बेंजामिन राजा धन्यवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11965-118
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163 100x
HEPES Buffer Solution Life Technologies 15630-130 100x
PBS pH 7.4 Life Technologies 10010-023 1x
Vero E6 cells American Type Culture Collection CRL-1586
Costar 48-well plate Corning 3548
RNeasy mini kit Qiagen 74106 do not mix buffers RLT or  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizer Qiagen 79654
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) Life Technologies 4311235
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) Life Technologies N808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution Life Technologies N808-0010
RNase Inhibitor (5000U/100 µl) Life Technologies N808-0119
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3’
Integrated DNA Technologies 250 nmol DNA oligo standard desalting
Forward qPCR primer  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ Life Technologies 4316033 HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) Life Technologies 4346906
StepOnePlus Real-Time PCR System Life Technologies 4376598 or other qPCR instrument

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