In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

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Neuroscience

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Summary

Qui vi presentiamo un romanzo di Ca 2+ approccio -imaging utilizzando un reporter bioluminescente. Questo approccio viene utilizzato un costrutto fuso GFP-equorina che si lega al Ca 2+ ed emette luce, eliminando la necessità di luce di eccitazione. Significativamente questo metodo permette di imaging lungo continuo, l'accesso alle strutture cerebrali profonde e alta risoluzione temporale.

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Lark, A. R., Kitamoto, T., Martin, J. R. In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (107), e53705, doi:10.3791/53705 (2016).

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Abstract

Funzionale imaging in vivo è diventato un approccio efficace per studiare la funzione e la fisiologia delle cellule e strutture di interesse cerebrali. Recentemente è stato sviluppato un nuovo metodo di Ca 2+ -imaging utilizzando il reporter bioluminescenti GFP-aequorina (GA). Questa nuova tecnica si basa sulla fusione dei geni GFP e equorina, producendo una molecola in grado di legare il calcio e - con l'aggiunta del suo cofattore coelenterazine - emettono luce che può essere monitorato attraverso un collettore fotone. Linee transgeniche che trasportano il gene GFP-equorina sono stati generati per entrambi i topi e Drosophila. In Drosophila, il gene GFP-equorina è stato posto sotto il controllo del sistema di espressione binario GAL4 / UAS consentendo espressione mirata di imaging e nel cervello. Questo metodo è stato successivamente dimostrato di essere in grado di rilevare sia verso l'interno di Ca 2+ -transients e Ca 2+ -released dai depositi interni. Soprattutto consente una maggiore durata nel registrazione continua, imaging a maggiori profondità all'interno del cervello, e la registrazione ad alta risoluzione temporale (fino a 8,3 msec). Qui vi presentiamo il metodo di base per l'utilizzo di imaging bioluminescente per registrare e analizzare Ca 2+ -Attività in seno agli organi di funghi, una struttura centrale di apprendimento e la memoria nel cervello mosca.

Introduction

Il patterning e la funzione di attività all'interno del cervello e le sue strutture discrete fondamentali sono stati a lungo una zona di intenso studio nel campo delle neuroscienze. Forse alcuni dei primi approcci di successo utilizzati per risolvere questo problema sono stati la misura fisiologica diretta della variazione dell'attività elettrica - metodi tuttavia alternativi che consentano l'imaging dal vivo di cambiamenti nelle concentrazioni di tensione, di pH o di calcio (come proxy per attività) hanno portato ulteriori funzionalità a lo studio dell'attività neuronale 1. Tecniche di imaging trasportare una vasta gamma di vantaggi, come riduzione invasività e la possibilità di monitorare l'attività all'interno delle strutture intere del cervello. Inoltre, in animali con la genetica trattabili compreso moscerino della frutta Drosophila, sviluppo di indicatori di calcio geneticamente codificati, come Cameleon, GCaMPs e altri 1 hanno permesso ai ricercatori di monitorare singoli neuroni, popolazioni neuronali e tutto il cervellostrutture. Mentre altri metodi di imaging di calcio fluorescenti tradizionali utilizzando GCaMPs (GFP fusa al calmodulina) o FRET (PCP e YFP fuso con calmodulina) hanno dimostrato di essere le tecniche utili che forniscono una buona risoluzione spaziale e temporale, il processo alla base dell'eccitazione luce genera alcune limitazioni sulla sua sperimentale applicazioni. A causa della natura della luce di eccitazione, autofluorescenza, fotometabolismo e fototossicità vengono inevitabilmente prodotte, che limita di conseguenza la profondità delle strutture che possono essere esposte, la durata della registrazione e la continuità tempo reale della registrazione. In altre parole, registrazioni devono spesso essere eseguite in modo intermittente per evitare questi effetti collaterali indesiderati.

A causa di questi problemi, sono stati sviluppati metodi alternativi aggiuntivi calcium imaging. Uno dei metodi più promettenti è l'imaging bioluminescente, che si basa sulla luce prodotta attraverso una reazione enzimatica dopo il legame del calcio. Bioluminescent di imaging non necessita di eccitazione luce e di conseguenza non sperimentare le stesse difficoltà di imaging di calcio tradizionale. Il reporter bioluminescente equorina - isolato da Aequorea victoria, la stessa Medusa da cui GFP è stato isolated- anche lega il calcio attraverso le sue tre strutture a mano EF e subisce un cambiamento conformazionale, che porta alla ossidazione del suo coelenterazine cofattore e il rilascio di luce blu (λ = 469 nm) 2,3. Equorina ha una bassa affinità per il calcio (K d = 10 mM) che lo rende ideale per il monitoraggio transienti di calcio perché produce poco rumore di fondo e non interferisce con il sistema tampone calcio intracellulare 4. Anche se equorina è stato precedentemente utilizzato per monitorare il processo di induzione neurale nell'uovo Xenopus 5 la luce prodotta è troppo debole da utilizzare per l'imaging in tempo reale di attività neuronale. Nel tentativo di affrontare questa sfida, Philippe Br &# 251; affitto e colleghi presso l'Istituto Pasteur ha creato un costrutto genetico fusione GFP e equorina geni, imitando lo stato nativo all'interno del meduse 4. Questo prodotto del gene di fusione lega nuovo calcio attraverso le tre strutture mano EF di equorina, che subisce un cambiamento conformazionale che porta alla ossidazione del coelenterazine, che trasferisce l'energia non radiativamente alla GFP. Questo trasferimento di energia provoca il rilascio di luce verde (λ = 509 nm) da GFP, invece di luce blu da equorina. La fusione di GFP e equorina conferisce anche una maggiore stabilità proteica aiutare la proteina di fusione producono luce da 19 a 65 volte più luminosa aequorina solo 4. Usando un approccio bioluminescente nel cervello espande l'attuale applicazione sperimentale dell'imaging calcio sia in termini di durata di registrazione continua e il numero di strutture all'interno del cervello che può essere registrato. Ampiamente nel contesto di lavoro precedente significa che sia globale e una maggiorevarietà di regionalizzato "attività" del cervello può essere monitorato (attraverso il proxy di transienti di calcio). Ancora più importante attività può essere monitorato per più, in un tempo reale e base continua, che si presta facilmente al perseguimento di una completa comprensione della funzione basale nel cervello.

Negli ultimi anni, il nostro laboratorio e altri hanno sviluppato mosche transgeniche esprimenti GFP-equorina sotto il controllo del sistema di espressione binario (GAL4 / UAS-GFP-equorina) 5,6. Abbiamo usato GFP-equorina bioluminescenza all'attività disco prodotto da stimoli naturali come profumo 7,8, nonché studiato i componenti cellulari modulanti Ca 2+ -Attività nei corpi fungo seguenti acetilcolina recettore stimolazione per applicazione diretta nicotinico 9. Inoltre, abbiamo utilizzato anche GFP-aequorina ad affrontare una serie di questioni sperimentali che non hanno potuto essere affrontate in precedenza, come a lungo terminel'imaging di transienti di calcio spontanee e visualizzazione delle strutture cerebrali profonde 10. Più di recente, abbiamo utilizzato il sistema / UAS GAL4 per esprimere il recettore dei mammiferi ATP P2X 2 11 un canale cationico, nei neuroni di proiezione (PN) e utilizzato il sistema LexA di esprimere GFP-aequorina nei corpi di funghi (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (una per gentile concessione di B. Pfeiffer, Janelia Fattoria, Stati Uniti d'America). Questo ha permesso di attivare l'PN per applicazione di ATP, che a sua volta attiva i corpi fungo (un bersaglio a valle del PN), simulando condizioni più naturali, come la risposta ad uno stimolo odore. Nel complesso questa tecnica che unisce P2X 2 e GFP-aequorina espande le possibilità sperimentali. In linea di massima, offre la possibilità di capire meglio i modelli di attività nel cervello, avviando nuovi studi su come i diversi stimoli e perturbazioni possono alterare il patterning basale di attività.

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Protocol

1. Preparazione dei campioni

  1. Preparazione di soluzioni e impostare
    1. Mantenere tutte le linee di Drosophila melanogaster a 24 ° C sulla media cibo standard. Posteriore e tenerli a bassa densità nel flacone di generare formato standardizzato e peso di mosche.
      1. Aggiungere 10 femmine vergini con 10 maschi in un flaconcino, farli combaciare e trasferirli ogni 2 giorni per una nuova fiala. Poi 10 giorni più tardi, quando le mosche iniziano a Eclose, raccogliere linea ogni giorno. Tenere un registro preciso dell'età delle mosche e conservarli in buone condizioni.
      2. Al giorno 3, separare i maschi dalle femmine e tenere le femmine 20 mosche per flaconcino. Registrare le mosche a 4 o 5 giorni di età.
    2. Preparare la soluzione di Ringer alle seguenti concentrazioni: 130 mM NaCl, KCl 5 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM CaCl 2 saccarosio, 5 mM HEPES e 36 mM e regolare il pH della soluzione a 7,3 con precisione. Preparare le soluzioni di perfusione di 25 μ; M nicotina e KCl 100 mM in soluzione di Ringer.
    3. Preparare 1.000 puntale microlitri: con una punta forma lama di rasoio per un taglio (circa 35 ° rispetto alla fine della punta) e rimuovere la base in eccesso oltre 1 ½ centimetri dalla punta.
    4. Preparare scatola per la conservazione (23 cm x 17 cm x 8.5 cm) di campione durante l'incubazione. Inserire due spugne (12 cm x 8 cm x 3 cm) saturo di acqua in fondo [per prevenire l'essiccamento del campione] sotto una piccola apparecchiatura rastrelliera per posizionare campioni come loro preparazione è completata.
    5. Preparare mosche campioni in modo che contengano almeno 1 copia del UAS-GFP-equorina e una copia di una linea GAL4 a guidare l'espressione di GFP-aequorina. Linea OK107 Gal4 (un'espressione linea guida soprattutto nei corpi fungo) è attraversata con UAS-GFP-aequorina in questa preparazione.
      NOTA: L'interno della scatola deve essere impermeabile e l'esterno deve bloccare luce di entrare scatola impedire il degrado del coelenterazine durante l'incubazione.
  2. Preparazione dei campioni
    1. Ice anestetizzare Drosophila trasferendo in un flacone di vetro e tenere in ghiaccio per 2 minuti prima di essere trasferiti al piatto freddo Petri per il posizionamento nella punta della pipetta. Preparare i puntali delle pipette su carta da filtro leggermente inumidito in 100 ml di capsula di Petri sul ghiaccio sotto il microscopio dissezione.
    2. Delicatamente con una pinza posto volare all'interno del puntale.
    3. Utilizzando un pennello spingere delicatamente e allineare fly tale che la testa è completamente oltre il bordo della punta e la regione dorsale è parzialmente esposta dalla sezione rimosso durante punta sagomatura (Figura 2B).
    4. Combinare un piccolo (circa 3-4 mL) porzioni dei due componenti della colla dentale. Applicare la colla con cautela intorno alla parte anteriore e posteriore testa e il collo verso il basso e intorno al bordo punta della pipetta - evitando la parte superiore della testa. Lasciate asciugare la colla per 2 minuti.
    5. Punta pipetta con la mosca incollato attraverso il foro nella camera di registrazione (Figura 2D) e Gently premere per fissarlo in posizione.
    6. Combinare i due componenti della colla di silicio (circa 3-4 ml). Applicare la colla sul lato piatto della camera lungo il bordo dove la camera e pipetta punta si incontrano per prevenire fuoriuscita di soluzione del Ringer. Lasciate asciugare la colla per 2 minuti.
  3. Dissezione
    1. Applicare nastro sopra il canale di perfusione, lato corto e si estende verso la parte posteriore della camera.
    2. Posizionare camera con la mosca sul blocco dissezione al microscopio accendere lampada fluorescente. Dispensare 1 ml di soluzione di Ringer nella camera.
    3. Utilizzare bene bisturi per rimuovere la cuticola. Effettuare incisioni parallele dalla parte posteriore della testa a regione antenne. Poi tagliare lungo il bordo dell'occhio poi fare un'incisione perpendicolare sopra antenna collegare le incisioni precedenti. Effettuare una incisione finale parallela a quella nella parte posteriore della testa. Utilizzare le pinze taglienti multa per rimuovere la cuticola (Figura 2C).
    4. Utilizzare pinza sottile affilati per afferrare con delicatezza und sgombrare esposto tessuto respiratorio fino al cervello e [fluorescenti] corpo fungo è chiaramente visualizzati.
    5. Utilizzare pinze ultra-sharp di cogliere con attenzione e un pizzico di tessuto che copre neuroepiteliale cervello per consentire permeazione del coelenterazine.
      NOTA: In alternativa papaina può essere utilizzato per l'permeabilize neuroepiteli 9.
    6. Utilizzando una pipetta, lavare due volte con la soluzione di Ringer per rimuovere eventuali residui da dissezione e il campione posto nella scatola buia.
    7. Dispensare 1 ml di soluzione di Ringer contenente 5 mM benzilico-coelenterazine nella camera. Chiudere la finestra e lasciare incubazione con coelenterazine a temperatura ambiente per un minimo di 2 ore.

2. Imaging

  1. Impostare
    1. Avviare il sistema di registrazione: accendere il microscopio, computer, macchina fotografica e sistema di drenaggio e la sala impostare controlli ambientali di 25 ° C.
    2. Aprire Misurazione e programma Automation Explorer sul computer. Clicca su &#8220, Dispositivi e Interfaces ", quindi fare doppio clic su" NI Motion Devices "e, infine, fare clic destro su" PCI-7334 "e selezionare" inizializzare dispositivo ".
    3. Aprire Photon Imager. Crea nuova cartella e il nome del primo file di registrazione. Fotocamera deve raggiungere -80 ° C prima che il sistema funzionerà.
    4. Impostare sistema di perfusione - aggiungere KCl, nicotina, e la soluzione di Ringer ai serbatoi e regolare in modo che i ogni soluzione scariche a 2 ml / min. Lavare con soluzione di Ringer prima di iniziare esperimento.
  2. Preparare campione
    1. Luogo di imaging montaggio piatto blocco sul monte al microscopio a ingrandimento 5X e inserire il tubo perfusione in canale attraverso la puntura.
    2. Impostare microscopio per la modalità a fluorescenza poi il centro e portare corpi di funghi (MB) a fuoco. Regolare a 20X e ri-center e messa a fuoco.
    3. Apparecchio drenaggio posizione sopra piscina drenaggio, regolare l'altezza dello shunt di drenaggio in modo che la punta è appena Above piscina, ed eseguire la soluzione di Ringer per 30 secondi al fine di garantire un adeguato drenaggio.
    4. Abbassare scudo per sigillare apparecchio dalla luce. Utilizzando il sistema automatizzato di fotoni imager effettuare regolare con precisione la messa a fuoco e prendere una immagine di riferimento fluorescente dei MB.
  3. Registrazione
    1. Regolare la velocità dei fotoni a velocità di registrazione desiderata (da 50 msec fino a 1 sec). Selezionare la modalità di fotoni e otturatore aperto. Record genotipo, sesso, età e numero del campione nelle voci di registro. Regolare la posizione di scatole ROI oltre calice e corpi cellulari (CCB) e lobi mediali cliccando sulle caselle ROI e trascinando mentre si tiene il controllo.
    2. Registra base per circa 5 a 10 min (come desiderato).
    3. Applicare nicotina per 1 min. Nota avviare / arrestare in log. Lavare con soluzione di Ringer per 5 min.
    4. Attendere 5 minuti per il recupero e la preparazione KCl voce di registro e il timer.
    5. Applicare KCl per 1 min. Nota avviare / arrestare in log. Lavare con soluzione di Ringer per 1 minuto.
    6. Interruttorealla modalità fluorescente, prendere l'immagine fluorescente finale, e spegnere la soluzione di Ringer.
    7. Premere il tasto "Stop". Finestra di dialogo chiederà di spegnere il sistema. Selezionare "No" per continuare la registrazione.
    8. Scudo aperto, sistema di drenaggio mossa, passare obiettivo obiettivo a 5X, rimuovere il tubo perfusione. Rimuovere campione / piatto registrazione da palcoscenico, pulire lente 20X con il risciacquo e pulire la lente due volte con acqua.
    9. Premere il tasto play bianca nella parte superiore della finestra del programma di avviare la registrazione successiva.

3. Analisi e creazione di video

  1. Estrarre i valori fotone
    1. Aprire il programma di analisi del fotone (ad esempio, Photon Viewer) e aprire il file foglio di calcolo di primo campione.
    2. Selezionare la scheda di controllo del display. Selezionare la ROI facendo clic sulla regione, mentre detiene il controllo. Regolare le dimensioni, l'orientamento e la forma delle regioni di interesse per comprendere GFP CCB illuminato e lobi mediali.
    3. Aggiungere un'aggiuntaal ROI facendo clic su "Definisci ROI" e cliccando e trascinando sullo schermo per creare il nuovo ROI.
    4. Selezionare la scheda "Movie" per riprodurre video fotone. Regolare "width sec" e "passi SEC", se lo desideri. Regolare il posizionamento del ROI, se necessario.
    5. Seleziona scatti rappresentativi dello schermo di fluorescenza GFP, la risposta nicotina e risposta KCl. Screenshot delle colture e immagine di pasta in una diapositiva della presentazione per una successiva analisi e comparazione.
    6. Regolare sia il "width sec" e "sec step" per la velocità di registrazione in secondi. Selezionare la lunghezza di analisi spostando marcatori grigio sul pannello superiore per regione staffa prima di stimolo iniziazione e solo dopo la fine di risposta.
    7. Selezionare "Sospendere viste durante la riproduzione di" premere "<< REW" e premere "PLAY>". Selezionare la scheda "Frequenza di conteggio Grafico" e regolare le unità come desiderato e colori di linea per abbinare il colore del ROI.
    8. Quando termine dell'analisi, Premere il tasto "Export Count Data Rate". Selezionare le schermate del combinato registrazioni CCB e regione del lobo mediale di interesse da ogni lato. Screenshot delle colture e immagine di pasta in una diapositiva con immagini di risposta. Questa diapositiva sarà poi utilizzata in ultima analisi.
  2. Esempio Analisi: un metodo per l'analisi dei dati di fotoni estratti dettagliati
    1. Aprire i file di foglio di calcolo nella cartella "Frequenza di conteggio esportazioni".
    2. Riformattare le celle della prima colonna etichettata volta per visualizzare l'ora in ora e minuti.
    3. Riferimento diapositiva corrispondente per il campione. Rimuovere tutti i valori tranne le colonne per il tempo e le due rappresentative ROI.
    4. Determinare nicotina ora di inizio stimolazione - disponibile nel file di voce di registro nella principale cartella- rimuovere dati aggiuntivi prima di avviare o valore di luce.
    5. Trova valore più alto / di picco sia per il BCC e del lobo mediale e segno / luce.
    6. Determinare inizio di risposta e di fine per entrambiCCB e del lobo mediale con la creazione di una stima utilizzando punto di tempo da corrispondente graficamente risposta sul vetrino e selezionare il valore effettivo cambiamento di valori in prossimità di questi punti. Evidenziare la regione tra questi punti sia nel CCB e lobi mediali. In alternativa, utilizzare una macro 9.
    7. Unire tutti i campioni di un gruppo sperimentale su un nuovo foglio di calcolo.
    8. Allineate sul picco determinando il valore di riga è per ogni valore di picco BCC. Sottrarre i valori più bassi dal valore più alto riga per determinare il valore approssimativo riga in cui che i dati di esempio devono essere ricopiati a. Verificare che tutti i valori di picco sono allineati.
    9. Copiare il foglio due volte ed eliminare sia le colonne lobo mediale o le colonne CCB la creazione di pagine di solo BCC o valori lobo mediale.
    10. Rimuovere i dati dopo le tutte le risposte CCB sono finiti. Crea quattro file etichettati Fotoni totali, Risposta lunghezza (durata), picco di ampiezza e risposta latenza. Copia e incolla questo nuovo sotto gli originali.
    11. Utilizzare la funzione SOMMA per determinare fotoni totali durante risposta. Utilizzare la funzione COUNT per determinare la lunghezza della risposta. Copia e collegare più alto cella valore per determinare il valore di ampiezza di picco. Utilizzare la funzione COUNT - selezionare dall'inizio della perfusione di nicotina per l'inizio della risposta - determinare Response latenza.
    12. I valori di copia utilizzando la funzione di collegamento e si moltiplicano (tutti tranne ampiezza di picco) registrando velocità in pochi secondi.
    13. Bar / box grafici possono essere creati per i parametri calcolati, come Fotoni totali, picco di ampiezza e la risposta intera, se lo si desidera (es .: figura 5B, C, D).
    14. Nella colonna dopo la prima risposta fotone dati, la media dei punti di dati grezzi per ogni punto di tempo usando la funzione media. Se follow desiderata con una colonna determinazione dell'errore standard della media (SEM), per ciascuno dei valori medi di fotoni in un punto temporale.
    15. Utilizzare la colonna media per costruire un profilo di risposta medioe [Grafico] per il gruppo campione di CCB. Per fare ciò selezionare la colonna specificando il momento in cui i valori dell'asse x e la colonna dei valori medi di fotoni come l'asse Y e infine selezionare lo strumento di creare un grafico a dispersione.
    16. Ripetere questa procedura di analisi con i dati provenienti dai lobi mediali.
  3. Creazione di immagini per il Video
    1. Aprire spettatore fotone.
    2. Selezionare la scheda di controllo del display. Clicca sul ROI mentre si tiene di controllo per selezionare, rimuovere e / o ridurre al minimo.
    3. Modifica "width sec" (tempo di accumulazione) come desiderato per determinare il contenuto di ciascun frame.
    4. Modifica "sec passo" per definire la sovrapposizione di ogni fotogramma.
    5. Seleziona "vista esportazioni durante la riproduzione di" premere "<< REW" poi "PLAY>". Le immagini per il video verranno esportati nella cartella "vista esportazioni" come una serie di file .png.
  4. Utilizzando Virtual Dub per rendere il video: un metodo per il video creation dettagliata
    1. Creare una nuova cartella denominata "resultats" nella cartella vista esportazioni contenente le immagini.
    2. Portate di script (renommer.VBS) nella cartella di immagini.
    3. Fare doppio clic su renommer.VBS per l'esecuzione.
    4. Le immagini verranno automaticamente rinominati numericamente e copiati nella cartella "resultats".
    5. Aperto VirtualDub.exe.
    6. Selezionare il file video aperto - selezionare prima immagine (immagini successive vengono caricati automaticamente).
    7. Selezionare il video - selezionare il frame rate regolare, se lo desideri.
    8. Selezionare il video - selezionare compressione selezionare Cinepak Codec per il raggio.
    9. Nel file di selezionare Salva come AVI il video verrà creato automaticamente.

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Representative Results

La fusione della GFP di equorina ci permette di visualizzare la nostra regione di interesse prima di imaging bioluminescente con eccitazione di GFP in modalità fluorescenti sul microscopio (Figura 3A, 4A, 6A, 6E). Uno dei modi più semplici per stimolare gli organi fungo è attraverso l'attivazione dei recettori nicotinici ionotropici. Sebbene acetilcolina è il ligando endogeno di questo recettore abbiamo trovato che la nicotina produce risposte più riproducibili nei corpi fungo. Questo è in parte perché specificamente esprimono i recettori nicotinici, e quindi utilizzando la nicotina si può evitare l'attivazione dei recettori muscarinici espressi altrove nel cervello. Inoltre, la nicotina è più stabile del acetilcolina, e consente quindi una migliore e più affidabile controllo dello stimolo. Una risposta tipica inizia con l'attivazione rapida di entrambe le calice, cellula-corpi (CCB) e lobi mediali (ML) (vedi figura 4Una per un'immagine più marcato). Generalmente la risposta BCC dura più a lungo e presenta una risposta bioluminescente superiore ai lobi come mostrato nei pannelli sequenziali della risposta (Figura 3C-H). La figura 4B mostra un accumulo 10 sec di fotoni rilevati ad una risoluzione temporale di 100 msec (10 Hz) durante il picco di una risposta a un 1 min perfusione di 25 pM nicotina. A seguito di un periodo di washout e recupero di 10 minuti viene avviata una seconda stimolazione di un 1 min di perfusione di KCl 100 mm (figure 4C, E) che ci permette di confermare la vitalità del nostro campione. Le risposte quantitative possono essere analizzati selezionando ROI durante l'analisi nel visore fotone. Esecuzione del analisi spettatore fotone produce entrambi i grafici che mostrano il numero di fotoni emessi in ROI selezionato nel tempo (Figura 4D e E), così come i fogli di calcolo esportabili di quei valori. La figura 4D è un example dei grafici prodotti da spettatore fotone tracciando i fotoni emessi nella ROI 2 [verde] (a destra CCB) e ROI 4 [blu] (lobi mediali a destra). Dati simili per la risposta KCl rappresentata nella figura 4E. I dati esportati possono essere utilizzati per ricostruire la curva della risposta (Figura 5A), nonché per estrarre dati aggiuntivi sui vari parametri quali la durata, ampiezza di picco, e la risposta totale (Figura 5B-D). Recentemente utilizzando i sistemi di GAL4-UAS e Lexa abbiamo ideato un metodo di suscitare una risposta più naturale. In breve, il P2X 2 canali cationico ATP-dipendenti è espressa nei neuroni di proiezione (PN) e GFP-aequorina (GA) è espresso nei corpi di funghi - un obiettivo di PN; questo ci permette di eccitare selettivamente le PN comunque applicazione di ATP, che possono a loro volta, producono risposta a corpi di funghi (Figura 6).

Figura 1 Figura 1. Caratteristiche del Bioluminescent Reporters (GFP-aequorina). (A) Schema di GFP e gene equorina fusione con la sequenza di attivazione a monte. (B) Modello di emissione di luce blu da equorina in risposta ad elevati livelli di Ca 2+. (C) Modello di emissione di luce verde da GFP-aequorina in risposta ad elevati livelli di Ca 2+. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. sperimentale istituito. (A) Fly posizionato in punta della pipetta. (B) Un esempio di un'adeguata tecnica di incollaggio stabilizzare la testa e sigillare la regione tra il corpo volo e punta della pipetta. (C) Schema di dissezione per aprire testa capsula. (D) 1 ml camera sulla tenuta blocco con tubo perfusione inserito. Totale Dimensioni camera: lunghezza: 7.4 cm, Larghezza: 2,7 cm, Altezza: 0.55 cm. Dimensioni interne della camera: lunghezza: 1,7 cm, Larghezza: 1,4 cm, Altezza: 0.35 cm, e il raggio del foro camera: 0,1 centimetri. (E) Visualizzazione della testa di volare mostrando segnale GFP-positive nei MB: bassa penombra con fluorescenza derivato da OK107-driven GFP-aequorina dopo la rimozione della cuticola. (F) Microscopio con fotocamera fotone e sistema di perfusione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Rappresentante risposta a 25 micron nicotina nei corpi di funghi. (A) immagine fluorescente dil'espressione GFP-aequorina nei corpi fungo in GA2 / +; OK107 / + (barra della scala = 50 micron) di controllo fly cervello. (B) risposta bioluminescente picco nei corpi di funghi. (C) Prima di stimolazione. (D) Inizio della risposta. (E) risposta di picco. (F) Continua risposta CCB. (G) caduta risposta CCB. (H) Fine della risposta (BH: barra della scala = 33 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. analisi Rappresentante di registrazione del campione (A) immagine fluorescente del corpo fungo della GA2 / +;. OK107 / + controllo fly con quattro selezionato sopra i lobi CCB e mediale (BA scala di ROIr = 50 micron). (B) 10 sec accumulo della risposta bioluminescente a 25 pM nicotina - Risposta fotone registrati a 100 msec. (C) 10 sec accumulo di risposta bioluminescente di KCl 100 mM registrato a 100 msec. (D) Grafico di numero registrato di fotoni emessi durante la risposta alla nicotina all'interno ROI 2 e 4 che coprono la BCC destra e lobi mediali rispettivamente. (E) Grafico di numero registrato di fotoni emessi durante la risposta KCl all'interno di 2 ROI e 4 che copre le giuste CCB e mediale lobi, rispettivamente. In d ed e, l'asse Y di sinistra corrisponde al numero totale di fotoni nell'intero campo visivo, mentre la destra asse Y corrisponde ai fotoni all'interno della ROI. Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

"Figura Figura 5. parametri rappresentativi analisi di registrazione del campione analisi Rappresentante excel della risposta bioluminescente all'attivazione nicotinico del corpo funghi nel GA2 / +;. OK107 / + fly controllo. Risposta (A) Photon nel tempo CCB e lobi mediali. (B) Durata risposte nel CCB e lobi mediali. (C) il valore più alto di fotoni (ampiezza massima) durante risposta entro il CCB e lobi mediali. (D) Totale fotoni all'interno di BCC e lobi mediali di intera risposta. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Due risposta diversa nei corpi di funghi dopo la stimolazione della PN through ATP e P2X 2. Esempio 1 fly esprimendo P2X 2 a PN e GFP-aequorina nei corpi di funghi (GH146 / +; P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (ad) (A) immagine fluorescente di corpi di funghi con (scala di ROI. bar = 50 micron). (B) immagine Bioluminescent della risposta di picco nella corpi fungo seguito attivazione dei PN di P2X 2 stimolati con 500 mM ATP, osservati soprattutto nei lobi mediali. (C) immagine Bioluminescent del picco risposta KCl. (D ) Naturalmente il tempo di emissione di fotoni all'interno delle regioni del ROI, in tutta la risposta di esempio 2 fly esprimere P2X 2 a PN e GFP-aequorina nei corpi di funghi (GH146 / +;. P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (eh ). (E) l'immagine fluorescente con ROI (barra della scala = 50 micron). (F) immagine Bioluminescent della risposta indotta nei corpi fungo a seguito di unactivation delle PN da P2X 2 stimolati con 1 mM ATP, in entrambi i lobi e BCC. (G) Bioluminescent immagine del picco risposta KCl. (H) Tempo di emissione di fotoni all'interno delle regioni del ROI, in tutta la risposta. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'approccio GFP-equorina basato bioluminescenti-recentemente sviluppato qui presentato permette in vivo registrazione funzionale Ca 2+ -Attività in neuroni diversi, così come se lo si desidera, in altri tipi di cellule, come le cellule stellate rene come riportato in Cabrero et al. 2013 5.

Modifiche, guasti, componenti aggiuntivi e passaggi critici

Drosophila Zootecnica

GFP-equorina transgene (pG5A) 4 è stato inserito nel vettore pUAST per creare tre linee trasformanti indipendenti 6. Tutte le linee sono stati testati per la loro bioluminescenza, e tutti erano in grado di rispondere al in vivo Ca 2+ -Attività 6. Tuttavia più recenti esperimenti hanno evidenziato che la linea GA2 inserito il terzo cromosoma genera il segnale più robusto del o linea GA1 inseriton il secondo cromosoma. Qui, i risultati rappresentativi sono stati ottenuti utilizzando UAS-GA2 attraversata con la OK107 linea di MB-specifica. Inoltre, recentemente B. Pfeiffer ha generato un costrutto GFP-aequorina posto sotto il controllo di 20XUAS elemento normativo (20X-G5A-2) e questo costrutto è stato convalidato nel nostro laboratorio. Brevemente, dà un segnale molto forte, più forte della nostra GA2 standard, che quindi dovrebbe essere più efficiente e utile per monitorare ulteriormente il Ca 2+ -Attività in strutture più profonde del cervello, come l'ellissoide corpo. Inoltre, può anche essere utile per l'imaging piccole quantità di neuroni o nei terminali degli assoni (contatti sinaptici).

I preparativi per Imaging

Sebbene la mosca deve essere anestetizzato ghiaccio durante il posizionamento e incollaggio, è importante minimizzare il tempo sul ghiaccio. Mosche dovrebbero essere trasferiti in un flacone di vetro e conservati in ghiaccio per 2 minuti prima di essere trasferiti al piatto freddo Petriper il posizionamento nella punta della pipetta. Abbiamo notato che prolungato periodo di anestesia riduce la vitalità del campione e può attenuare la risposta. In modo ottimale, teniamo il tempo di anestesia ghiaccio sotto 5-10 min.

Taping e incollaggio sono passaggi critici. È fondamentale bloccare la testa mosca in posto per la dissezione e imaging e per evitare la fuoriuscita della soluzione del Ringer nella pipetta e / o dalla camera di registrazione. Colla dentale (e in misura minore la colla di silicio) diventerà appiccicoso e successivamente iniziare a secco non appena i due componenti sono combinati. Pertanto è fondamentale per applicare la colla rapidamente per evitare legame debole e aggregazione della colla. In alcuni casi abbiamo notato che le varietà alternati di nastro adesivo e colla, a contatto con la soluzione di Ringer, possono rilasciare sostanze contaminanti nella soluzione del Ringer che possono influenzare la mosca e la sua risposta, in modo particolare per gli esperimenti dedicati a tegli studia di sistema olfattivo, con diversi odori. Di conseguenza, prestare attenzione qui se sostituire i materiali (vedi materiali per varietà specifiche che usiamo).

Diverse forme di coelenterazine sono stati sviluppati per ottimizzare la sua attività come la velocità di emissione luminosa, Ca 2+ -affinity (sensibilità), o l'intensità di emissione luminosa 12. Ad esempio, il coelenterazine nativo è più stabile, quindi più adatto dell'imaging lungo termine come diverse ore, mentre il benzil-coelenterazine (chiamato anche h-coelenterazine) comporta una maggiore emissione di luce più velocemente e con più breve emivita. Per ulteriori informazioni sulle diverse forme di coelenterazine, consultare l'indirizzo web nella lista dei materiali.

Imaging

Segnali bioluminescenza può essere monitorato con una telecamera CCD moltiplicatore di elettroni (EM-CCD, raffreddati a -80 ° C) montata su un microscopio. Questa configurazione deve be ospitato all'interno di una scatola scuro stretto per evitare qualsiasi (ambiente) la contaminazione luce indesiderata. La configurazione descritta in questo manoscritto utilizza una lente 20X immersione obiettivo consentendo un campo visivo di 400 x 400 micron (512 x 512 pixel). Per migliorare il rapporto segnale rumore, i dati sono stati acquisiti con un tempo di integrazione 0,100 sec (10 Hz), e 2 x 2 binning stato utilizzato (1 pixel = 1.2 x 1.2 micron). X Per acquisire e memorizzare i dati, ogni fotone rilevato è stato assegnato, y le coordinate e un punto di tempo. Tra 500 e 600 nm di lunghezza d'onda, la telecamera EM-CCD (vedi descrizione precisa in Materials List) ha una efficienza quantica del 96%.

Uno dei parametri più importanti per l'imaging funzionale del cervello in vivo è la risoluzione temporale. Fino ad ora, la maggior parte di base fluorescenza Ca 2+ -imaging tecnica come GCaMP e cameleon fornisce una risoluzione temporale di circa 4 Hz (250 msec / frame). Recentemente, con base di bioluminescenza-GFP-aequorina siamo stati in grado di RAISe il tempo fino a 100 msec / telaio con la fotocamera EMCCD e anche fino a 120 fotogrammi / sec (8.3 msec / telaio) con la fotocamera ICDD moltiplicatore di elettroni 10 acquisizione. A questa risoluzione temporale approcci che delle tecniche elettrofisiologiche (nell'intervallo di circa 1 msec). Mentre ad alta risoluzione temporale è sia informativo e di fondamentale importanza per gli studi dedicati alla trasmissione sinaptica e l'attività di stimolo indotto, prorogato più lento ma essenziale Ca 2+ -kinetics si verifica anche all'interno dei neuroni, per esempio il rilascio di Ca 2+ dalle intracellulari di Ca 2+ -stores (per una rassegna: Berridge et al, 2003 13.). Per quest'ultimo tipo, risoluzione temporale lento è ancora accettabile, mentre inversamente, in genere richiedono una migliore Ca 2+ -affinity dal sensore da rilevare. Questo requisito è stato raggiunto con GFP-equorina per rilevare il rilascio di Ca2 + intracellulare -stores al terminale assone della recept olfattivaors neuroni 7,8. In alternativa, a seconda delle condizioni sperimentali desiderati, potrebbe essere utilizzato più lento tempo di acquisizione. Ad esempio, nel lungo O / N registrazioni, abbiamo usato un tempo di integrazione di 2 secondi a causa del gran numero di punti di dati raccolti (Minocci et al., 2013). In breve, una caratteristica pratica con la bioluminescenza è che la risoluzione temporale può essere facilmente regolata a seconda delle condizioni sperimentali desiderati.

Camere alternativi (configurazione di volo) sono stati sviluppati per facilitare gli obiettivi dell'esperimento. Ad esempio, per gli studi basati su stimolo odore naturale, l'antenna deve essere mantenuta libera, quindi, un approccio come quello sviluppato da A. Fiala 14 è la più adatta (abbiamo usato un approccio simile per Murmu et al., 2010). Brevemente, in questo approccio, la mosca è legato (incollato) su un perno minutien al collo, che è incollata ad un vetrino di plastica contenente un piccolo foro. Un sigillo è creatointorno alla parte superiore della testa della mosca. Successivamente, una goccia di suoneria viene depositato sulla testa, e la capsula testa è sezionato. In tal modo, le antenne sono mantenuti liberi e sono disponibili per rilevare odori. Analogamente, per la registrazione a lungo termine, come O / N o anche paio di giorni 10 fly deve essere mantenuto libero di costrizione possibile, e in alcuni casi alimentati (ad esempio: con un documento capillare imbevuto di glucosio 5% soluzione). In queste circostanze l'approccio di Fiala è anche più adatto rispetto all'approccio nella punta della pipetta blu (metodo snorkeling).

Tutte le applicazioni di droga possono essere controllati dall'esterno utilizzando una 6 modo multi-valvole sistema di perfusione a gravità. Il flusso può essere controllato utilizzando regolatori perfusione volumetrici calibrate prima di ogni sessione di registrazione per un flusso di 2 ml / min. Apparecchiatura Drenaggio estrae liquido ad una velocità di 2 ml / min dalla camera di registrazione tramite pompa peristaltica permettendo un flusso continuo.

Inalcune condizioni, a causa costoso costo del farmaco e / o la quantità di farmaco da utilizzare, si vorrebbe applicare solo piccole quantità di composti. Pertanto, è necessario applicare direttamente nel bagno piuttosto che attraverso il sistema di perfusione. In questo caso l'otturatore deve essere chiuso durante questo processo per evitare la contaminazione della luce.

Metodi di analisi

Conti al secondo o conteggi al secondo per di coordinate sono stati entrambi utilizzati dal nostro gruppo per l'analisi. Conteggi al secondo è forse più adatto per le risposte luminosi in strutture invece i conteggi al secondo e per coordinare (che rappresenta una normalizzazione delle risposte alle dimensioni della ROI) è più adatto e preciso per piccole popolazioni di cellule. Entrambi possono essere facilmente selezionata nel software di analisi.

Uno dei principali vantaggi di utilizzare l'approccio bioluminescenza è il modo in cui vengono acquisiti e memorizzati i dati (x, y, t parametri diogni fotoni emessi). Infatti, mentre altre tecniche di imaging utilizzate modalità standard come immagine piena acquisita (generalmente in formato TIFF), con questo sistema, si acquisisce solo il segnale rilevante e significativa memorizzando solo le coordinate dei pixel che sono stati attivati ​​dalla luce in un durata prefissata di tempo (che corrisponde al tempo di acquisizione o risoluzione temporale). Di conseguenza, la memorizzazione dei dati è molto "leggero" rispetto alla memorizzazione un'immagine completa, e di conseguenza, rende più facile l'analisi dei dati. Per l'analisi dei dati, usiamo un software correlato (visualizzatore fotone), che permette di impostare il tempo di accumulo, se lo desideri. Poi la visualizzazione di un'immagine dei segnali può essere regolato come desiderato in un obiettivo per presentare convincente dati. In parallelo i risultati sono quantificate contemporaneamente risoluzione del loro tempo di acquisizione.

Significato e applicazioni biologiche dell'imaging bioluminescente

Come accennato in precedenza Calcio Imaging bioluminescente offre tre vantaggi principali per le tecniche di imaging di calcio fluorescente: (1) una più profonda regioni del cervello possono essere esposte, (2) l'imaging si può verificare in continuo per periodi più lunghi, come diverse ore come O / N e anche in alcuni casi fino a due giorni, e (3) più recentemente, con una risoluzione temporale superiore, fino a 120 frame / sec (8.3 msec). Il limite principale dell'approccio bioluminescente è dovuto alla sua incompatibilità con illuminazione confocale, che di conseguenza non ci permette di determinare la precisa profondità (z-plan) delle strutture o neuroni attivati.

Il primo vantaggio dell'imaging bioluminescente, imaging regioni cerebrali profonde, è stato precedentemente dimostrato nel 2007 dal imaging elevata potassio risposta di calcio indotta nel corpo ellissoide (EB), una struttura profonda situata al centro del cervello, senza precedente rapporti elettrofisiologici o funzionali 6 2+ -Attività nel eb successiva applicazione di picrotoxin (un bloccante dei recettori GABA A) dimostrando che i GABAergici ring-neuroni della eb sono neuroni effettivamente inibitori (descritto in :. Diaper et al, articolo presentato).

Il secondo vantaggio, più a lungo e la registrazione in tempo continuo, è stata sfruttata in diversi studi dal nostro laboratorio. Stimolazione odore è stato utilizzato per esaminare l'attività dei neuroni del cervello negli studi precedenti 11,15,16. Utilizzando immagini a più lungo termine, tuttavia, il nostro laboratorio è stato in grado di mostrare i cambiamenti precedentemente non dichiarata nella cinetica all'interno dei neuroni olfattivi di odori. Il primo studio di Murmu et al. (2010) hanno mostrato che, mentre stimoli breve odore (1-3 sec) esposti cinetiche simili e una differenza di ampiezza moderata, uno stimolo odore più lungo (5 sec) ha causato una maggiore ampiezza nonché cambiare nel cinetica / structure della risposta che è stato attribuito ai negozi di calcio intracellulare. Uno studio successivo ha dimostrato che, mentre 5 successive applicazioni di impulsi odore 1 sec ad intervalli di 5 min non cambiano la loro risposta di calcio, aumentando la lunghezza dello stimolo per 5 sec portato alla progressiva attenuazione della risposta, suggerendo un processo di adattamento. Inoltre questo fenomeno adattamento sembrava essere avviato dal regolamento GABAergici di negozi di calcio precedentemente identificati 8. È importante sottolineare che questi dati dimostra anche che, in questa condizione sperimentale, della GFP-equorina Ca 2+ -sensor può rilevare e seguire il calcio rilasciato dalle intracellulari Ca 2+ -stores. Uno studio unico aggiuntivo dal nostro laboratorio utilizzato bioluminescente di imaging O / N per registrare basale (spontanea) di attività in tutta la popolazioni neuronali e gliali del cervello così come l'attività nei corpi fungo 10. Queste registrazioni hanno rivelato attività spontanea sorprendente in formicaEnnal centro meccanosensoriali e motore (AMMC) e del lobo antenne. Inoltre, cellule inaspettato attività autonoma nel glia che si verificano durante la notte. All'interno del corpo fungo lo studio ha identificato sia l'attività puntata e due picchi distinti, uno corto e uno lungo la cui incidenza è cambiato con 10 anni.

Nello studio più recente nel nostro laboratorio, abbiamo usato l'imaging bioluminescente per esaminare gli effetti della manipolazione delle molecole di segnalazione secondari implicati in memoria, e come influenzano la risposta di calcio in seno agli organi di funghi 9. Infatti, sebbene somaro e rape sono stati identificati più di 30 anni fa, e sono noti per regolare il livello di cAMP, i loro effetti in vivo sui meccanismi cellulari e fisiologici e in particolare sul Ca2 + -response rimangono in gran parte sconosciute. Con l'approccio GFP-equorina, siamo stati in grado di registrare simultaneamente sia il calice (il structur dendritichei) e le cellule corpi, nonché le proiezioni assonale a livello dei lobi, e quindi consentendo di correlare il livello e la cinetica della risposta nei diversi comparti di questa struttura altamente complessa.

L'applicazione più recente stiamo sviluppando imita una risposta naturale attraverso artificialmente attivando popolazioni neuronali presinaptiche alla struttura di interesse. Per fare questo esprimiamo la P2X recettore 2, un canale cationico ligando-dipendenti, che è sensibile in ATP, nel neurone presinaptico ed esprimiamo GFP-aequorina nella popolazione neuronale post-sinaptico. La segregazione di questi due elementi in differenti popolazioni neuronali richiede due sistemi di espressione separati. A tal fine un LexA costrutto contenente GFP-aequorina è stato creato. Nei nostri esperimenti preliminari con questo sistema abbiamo espresso P2X 2 in un sottoinsieme di PN che utilizzano il GAL4-GH146 con UAS-P2X 2 e GFP-aequorina nel corpo fungoutilizzando la linea LexA MB247 combinata con LexA-13X-GFP-aequorina. Noi abbiamo registrato con successo le risposte di calcio nel corpo funghi con stimoli di 1 mM ATP al recettore P2X 2 nella PN (Figura 6).

In conclusione, l'approccio GFP-equorina bioluminescenza ha dimostrato di essere utili nella registrazione del Ca 2+ stimolo indotto -Attività, analogo ad altri Ca 2+ -indicators. Ma soprattutto, permette anche l'individuazione di Ca 2+ spontanea -Attività all'interno del cervello. Questo approccio apre nuove possibilità future per gli esperimenti a lungo termine e tutta imaging cerebrale che possono aumentare la profondità della nostra comprensione dei fenomeni fisiologici e modelli di attività all'interno del cervello.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S3014
CaCl2 Merck 1023911000
HEPES Sigma-Aldrich 7365-45-9
KCl prolabo 26 764.298 normapur
MgCl2 prolabo 25 108.295 normapur
sucrose Sigma-Aldrich S0389
Nicotine Sigma-Aldrich N3876
ATP Sigma-Aldrich A2383 Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine Prolume, nanolight  Cat #301 Coelenterazine h http://www.prolume.com/
dental glue 3M ESPE™ 46954 Protemp IV
silicon glue 3M ESPE™ 36958 Express 2 Regular Body Quick
tape 3M Scotch 122s 3M Scotch Magic Tape
pipette tips Corning Incorporated 4868 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage) hand made
incubation box hand made
forceps (No. 5) Fine Science Tools 11252-00 Micro-dissecting forceps
curved forceps Sigma-Aldrich F4142 Micro-dissecting forceps
glue applicator  hand made 
knife Fine Science Tools 10316-14 5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera  Andor DU-897E-CS0-#BV iXon (cooled to -80 °C)
Microscope Nikon Eclipse-E800
immersion objective lens Nikon 20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence Leica MZ Fl III leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box Science Wares Custom built by Science Wares
peristaltic pump  Gilson Minipuls 2
tubing Fisher Scientific depends on thickness Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system Warner 64-0135  (VC-66CS) Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators Leventon 201108 Dosi-flow 3
measurement and automation explorer Sciences Wares & National Instruments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager  Science Wares & National Instruments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer Science Wares & National Instuments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel Microsoft N/A software https://www.microsoft.com
virtual dub open access  N/A software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2 Martin et al., 2007, Ref. 1  N/A No stocks {currently} publicly available 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP   B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.  (STOCK #1117340) pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2 Lima and Misenboeck, Ref. 11  N/A No stocks {currently} publicly available 
OK107 Bloomington stock center 854 http://flystocks.bio.indiana.edu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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