In Vivo cérébrale fonctionnelle approche d'imagerie à base de calcium Bioluminescent Indicateur GFP-aequorine

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Neuroscience

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Summary

Nous présentons ici un roman Ca 2+ -Imagerie approche utilisant un journaliste bioluminescente. Cette approche utilise une construction GFP-aequorine condensé qui se lie au Ca 2+ et émet de la lumière, éliminant le besoin d'une lumière d'excitation. Significativement cette méthode permet à long imagerie continue, l'accès à des structures profondes du cerveau et une haute résolution temporelle.

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Lark, A. R., Kitamoto, T., Martin, J. R. In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (107), e53705, doi:10.3791/53705 (2016).

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Abstract

Fonctionnelle imagerie in vivo est devenu une approche puissante pour étudier la fonction et la physiologie des cellules et des structures d'intérêt cerveau. Récemment, une nouvelle méthode de Ca 2+ -Imagerie utilisant le journaliste bioluminescente GFP-aequorine (GA) a été développé. Cette nouvelle technique repose sur la fusion des gènes GFP et l'équorine, produisant une molécule capable de lier le calcium et - avec l'ajout de son coelentérazine cofacteur - émettant une lumière vive qui peut être contrôlé par un collecteur de photons. Les lignées transgéniques portant le gène de la GFP-aequorine ont été générés pour les souris et la drosophile. Chez la drosophile, le gène GFP-aequorine a été placé sous le contrôle du système d'expression binaire GAL4 / UAS permet une expression ciblée et de l'imagerie à l'intérieur du cerveau. Cette méthode a été démontré par la suite pour être capable de détecter à la fois vers l'intérieur de Ca2 + et Ca2 + -transients -released dans les magasins internes. Et surtout, il permet une plus grande durée de l'enregistrement en continu, l'imagerie à plus grande profondeur dans le cerveau, et l'enregistrement à des résolutions temporelles élevées (jusqu'à 8,3 msec). Ici, nous présentons la méthode de base pour l'utilisation de l'imagerie bioluminescente pour enregistrer et analyser Ca 2+ -Activité dans les corps pédonculés, une structure centrale à l'apprentissage et la mémoire dans le cerveau de la mouche.

Introduction

La structuration et la fonction de l'activité dans le cerveau et ses structures discrètes fondamentale ont longtemps été un domaine d'étude intense dans le domaine des neurosciences. Peut-être que certaines des premières approches utilisées avec succès pour traiter cette question étaient mesure physiologique directe de la modification de l'activité électrique - méthodes cependant alternatives qui permettent l'imagerie en direct des changements dans les concentrations tension, pH ou de calcium (comme proxy pour l'activité) ont apporté des capacités supplémentaires à l'étude de l'activité neuronale 1. Les techniques d'imagerie comportent une large gamme d'avantages tels que l'invasivité et réduit la capacité de surveiller l'activité à l'intérieur de structures cérébrales entières. En outre, dans les animaux avec la génétique dociles dont la mouche drosophile, le développement d'indicateurs de calcium codés génétiquement, tels que Cameleon GCaMPs et autres 1 ont permis aux chercheurs de surveiller les neurones simples, populations neuronales et le cerveau entierstructures. Bien que plusieurs méthodes d'imagerie de calcium fluorescentes traditionnelles utilisant GCaMPs (GFP fusionnée à la calmoduline) ou FRET (CFP et YFP fusionnée à la calmoduline) se sont révélés être des techniques utiles offrant une bonne résolution spatiale et temporelle, le processus sous-jacent de la lumière d'excitation engendre quelques limitations sur sa expérimentale applications. En raison de la nature de la lumière d'excitation, autofluorescence, photo-blanchiment, la phototoxicité et sont inévitablement produite, ce qui limite en conséquence la profondeur des structures qui peuvent être imagés, la durée des enregistrements ainsi que la continuité de temps réel de l'enregistrement. En d'autres termes, les enregistrements doivent souvent être effectuées de façon intermittente pour éviter ces effets secondaires indésirables.

En raison de ces défis, nouvelles méthodes de rechange imagerie calcique ont été développés. Une des méthodes les plus prometteuses est l'imagerie bioluminescente, qui repose sur la lumière produite par une réaction enzymatique après liaison calcium. Bioluminescent imagerie ne nécessite pas de lumière d'excitation et par conséquent ne pas éprouver les mêmes difficultés que l'imagerie calcique conventionnelle. Le journaliste bioluminescente Aequorin - isolé de Aequorea victoria, même Jellyfish à partir de laquelle la GFP a été isolated- aussi se lie au calcium par l'intermédiaire de ses trois structures de main EF et subit un changement de conformation, conduisant à l'oxydation de sa coelentérazine cofacteur et la libération de la lumière bleue (λ = 469 nm) 2,3. Aequorine a une très faible affinité pour le calcium (K d = 10 uM) ce qui le rend idéal pour la surveillance transitoires calciques parce qu'il produit très peu de bruit de fond et ne pas interférer avec le système tampon de calcium intracellulaire 4. Bien que l'aequorine a déjà été utilisé pour surveiller le processus d'induction neurale dans l'œuf Xenopus 5 de la lumière produite est trop faible à utiliser pour l'imagerie en temps réel de l'activité neuronale. Dans un effort pour relever ce défi, Philippe Br &# 251; laisser et ses collègues de l'Institut Pasteur créé une construction génétique fusion GFP et l'équorine gènes, imitant l'état natif dans le méduses 4. Ce produit de gène de fusion se lie au calcium de nouveau par l'intermédiaire des trois structures de la main EF de l'aequorine, qui subit un changement de conformation qui conduit à l'oxydation de la coelentérazine, qui transfère l'énergie non radiatif à la GFP. Ce transfert d'énergie entraîne la libération de la lumière verte (λ = 509 nm) de la GFP, la place de la lumière bleue de l'aequorine. La fusion de la GFP et l'équorine confère également une plus grande stabilité de la protéine aider le produisent de la lumière de la protéine de fusion de 19 à 65 fois plus brillante que l'équorine seule 4. En utilisant une approche bioluminescent dans le cerveau augmente l'application expérimentale courant de l'imagerie de calcium en termes de la durée d'enregistrement continu et le nombre de structures dans le cerveau qui peuvent être enregistrées. Large dans le contexte des travaux antérieurs, cela signifie que la fois globale et une plus grandevariété de «activité» régionalisée du cerveau peut être surveillé (par le proxy des transitoires de calcium). Plus important encore l'activité peut être surveillée pendant plus longtemps, dans un temps réel et de manière continue, ce qui se prête facilement à la poursuite d'une compréhension complète de la fonction basale dans le cerveau.

Au cours des dernières années, notre laboratoire et d'autres ont développé des mouches transgéniques exprimant la GFP-aequorine sous le contrôle du système d'expression binaire (GAL4 / UAS-GFP-aequorine) 5,6. Nous avons utilisé la GFP-aequorine bioluminescence à l'activité d'enregistrement produite par des stimuli naturels tels que le parfum 7,8, ainsi que les composants cellulaires étudiés modulation Ca 2+ -Activité dans les corps pédonculés suivantes acétylcholine stimulation du récepteur nicotinique par l'application directe 9. En outre, nous avons également utilisé GFP-aequorine pour répondre à un certain nombre de questions expérimentales qui ont pas pu être abordées précédemment, comme à long termeImagerie de transitoires calciques spontanées et la visualisation des structures plus profondes du cerveau 10. Plus récemment, nous avons utilisé le système / UAS GAL4 pour exprimer le récepteur de mammifère ATP P2X 2 11 un canal de cation, dans les neurones de projection (PNS) et utilisé le système LexA pour exprimer GFP-aequorine dans les corps pédonculés (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (une gracieuseté de B. Pfeiffer, Janelia Ferme, États-Unis). Cela nous a permis d'activer les unités de raccordement par l'application de l'ATP, qui active à son tour les corps pédonculés (une cible en aval de la SNP), imitant des conditions plus naturelles, comme la réponse à un stimulus d'odeur. Globalement, cette technique combinant P2X 2 et GFP-aequorine élargit les possibilités expérimentales. Globalement, il offre la possibilité de mieux comprendre les tendances de l'activité dans le cerveau, engager de nouvelles études sur la manière dont différents stimuli et des perturbations peuvent modifier la structuration de l'activité basale.

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Protocol

1. Préparation des échantillons

  1. Préparation des solutions et mettre en place
    1. Maintenir toutes les lignes de Drosophila melanogaster à 24 ° C sur un milieu alimentaire standard. Arrière et de les garder à faible densité dans le flacon pour générer la taille et le poids normalisé de mouches.
      1. Ajouter 10 femelles vierges avec 10 hommes dans un flacon, laissez-les accoupler et les transfèrent tous les 2 jours pour un nouveau flacon. Ensuite, 10 jours plus tard, quand les mouches commencent à Eclose, récolter vol tous les jours. Gardez une trace précise de l'âge de vol et de les garder en bon état.
      2. Au jour 3, séparer les mâles des femelles et de garder les femelles 20 mouches par flacon. Enregistrez les mouches à 4 ou 5 jours-vieux.
    2. Préparer la solution de Ringer avec les concentrations suivantes: NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES 5 mM, et 36 mM de saccharose et ajuster le pH de la solution à 7,3 avec précision. Préparer des solutions de perfusion de 25 μ; M nicotine et KCl 100 mM dans une solution de Ringer.
    3. Préparer 1.000 pointe de la pipette ul: en utilisant une pointe en forme de lame de rasoir pour une inclinaison d'environ 35 ° (à partir de la fin de la pointe) et enlever l'excès de base au-delà de 1 ½ centimètres de la pointe.
    4. Boîte pour le stockage (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) de l'échantillon Préparer pendant l'incubation. Placer deux éponges (12 cm x 8 cm x 3 cm) est saturé d'eau en bas [échantillon pour empêcher la dessiccation] ci-dessous un petit appareil de grille à placer sur des échantillons que leur préparation est terminée.
    5. Préparer les échantillons de mouches afin qu'ils contiennent au moins 1 copie de l'UAS-GFP-aequorine et une copie d'une ligne Gal4 pour conduire l'expression de la GFP-aequorine. Ligne OK107 Gal4 (une expression de la ligne de conduite principalement dans les corps pédonculés) est croisé avec UAS-GFP-aequorine dans cette préparation.
      NOTE: L'intérieur de la boîte doit être imperméable à l'eau et l'extérieur doit bloquer la lumière de la boîte d'entrer à prévenir la dégradation de coelentérazine pendant l'incubation.
  2. Préparationaration d'échantillons
    1. Ice anesthésier la drosophile en le transférant à un flacon de verre et de garder sur la glace pendant 2 min avant d'être déplacé vers la boîte de Pétri réfrigérés pour le positionnement dans la pointe de la pipette. Préparer des embouts de pipette sur du papier filtre légèrement humide dans 100 ml boîte de Pétri sur de la glace sous le microscope de dissection.
    2. Délicatement avec une pince lieu voler à l'intérieur de la pointe de la pipette.
    3. Utiliser une brosse pousser doucement et aligner mouche sorte que la tête est complètement passé au bord de la pointe et de la région dorsale est partiellement exposé par la section enlevée pendant la pointe de mise en forme (figure 2B).
    4. Combinez une petite (environ 3-4 pi) des parties des deux composants de la colle dentaire. Appliquer la colle soigneusement autour de l'avant et à l'arrière tête et du cou vers le bas et autour du bord de la pointe de pipette - en évitant la couronne de la tête. Laisser sécher la colle pendant 2 min.
    5. Lieu pointe de la pipette à la mouche collée dans le trou de chambre d'enregistrement (figure 2D) et genappuyez sur tly pour sécuriser en place.
    6. Combiner les deux composants de la colle de silicium (environ 3-4 pi). Appliquez de la colle sur le côté plat de la chambre le long du bord où la chambre et embout de pipette se rencontrent pour empêcher la fuite de la solution de Ringer. Laisser sécher la colle pendant 2 min.
  3. Dissection
    1. Apposez du ruban adhésif sur le canal de perfusion, bord court et se prolongeant à l'arrière de la chambre.
    2. Placez la chambre à la mouche sur le bloc de dissection sous microscope tour sur lampe fluorescente. Pipet 1 ml de la solution de Ringer dans la chambre.
    3. Utilisez bistouri fin pour enlever la cuticule. Faire des incisions parallèles à l'arrière de la tête à la région antennaire. Ensuite, couper le long du bord de l'œil puis faire une incision verticale au-dessus antenne reliant les incisions précédentes. Faire une incision finale parallèle à celle à l'arrière de la tête. Utilisez la pince pointe fine pour enlever la cuticule (figure 2C).
    4. Utilisez une pince pointe fine pour saisir délicatement uneD déblayer exposée tissu respiratoire jusqu'à ce que le cerveau et [fluorescent] corps de champignon est clairement visualisées.
    5. Utilisez une pince ultra-forte à saisir attentivement et pincer le tissu neuroépithéliale couvrant le cerveau pour permettre la perméation de l'coelentérazine.
      NOTE: Vous pouvez également papaïne peut être utilisé pour perméabiliser la neuroepithelia 9.
    6. En utilisant une pipette, laver deux fois avec la solution de Ringer pour enlever tous les débris de la dissection et placer l'échantillon dans la boîte noire.
    7. Pipet 1 ml de la solution de Ringer contenant 5 uM benzyl-coelentérazine dans la chambre. Fermez la boîte et laisser incubation avec coelentérazine à température ambiante pendant un minimum de 2 heures.

2. Imaging

  1. Installer
    1. Commencez système d'enregistrement: allumer microscope, ordinateur, caméra et système de drainage et mis en chambre contrôles environnementaux à 25 ° C.
    2. Ouvrir mesure et le programme Automation Explorer sur l'ordinateur. Cliquer sur “ Périphériques et interfaces ", puis double-cliquez sur" Périphériques mouvement Ni "et cliquez enfin à droite sur" PCI-7334 "et sélectionnez" dispositif initialiser ".
    3. Ouvrez Photon Imager. Créer un nouveau dossier et le nom premier fichier d'enregistrement. Caméra doit atteindre -80 ° C avant que le système fonctionnera.
    4. Mettre en place le système de perfusion - ajouter KCl, la nicotine, et la solution de Ringer à des réservoirs et d'ajuster ainsi les décharges chaque solution à 2 ml / min. Laver avec une solution de Ringer avant de commencer l'expérience.
  2. Préparer l'échantillon
    1. Lieu imagerie montage plat de bloc sur le mont sous le microscope au grossissement 5X et insérer le tube de perfusion dans le canal à travers la ponction.
    2. Réglez microscope en mode fluorescent puis centre et apporter corps pédonculés (MBS) dans le foyer. Réglez à 20X et re-centre et de concentration.
    3. Drainage appareil de Position sur la piscine de drainage, réglez la hauteur de la dérivation de drainage pour que la pointe est juste Abovpiscine e, et exécuter la solution de Ringer pendant 30 secondes afin d'assurer un drainage adéquat.
    4. Déroulez bouclier pour sceller l'appareil de la lumière. En utilisant le système automatisé de photons imageur effectuer des réglages fins à la mise au point et de prendre une image fluorescente de référence de la MBS.
  3. Enregistrement
    1. Régler la vitesse de photons à la vitesse d'enregistrement désirée (de 50 msec jusqu'à 1 seconde ou plus). Sélectionnez le mode de photons et de l'obturateur ouvert. Génotype d'enregistrement, le sexe, l'âge, et le nombre d'échantillons dans les entrées de journal. Ajustez la position des boîtes de ROI plus calice et les corps cellulaires (BCC) et des lobes médians en cliquant sur les boîtes de retour sur investissement et en faisant glisser tout en maintenant le contrôle.
    2. Base de registre pour environ 5 à 10 minutes (selon vos besoins).
    3. Appliquer la nicotine pendant 1 min. Remarque démarrer / arrêter dans le journal. Laver avec la solution de Ringer pendant 5 min.
    4. Attendez 5 min pour la récupération et préparer KCl entrée et de minuterie journal.
    5. Appliquer KCl pendant 1 min. Remarque démarrer / arrêter dans le journal. Laver avec la solution de Ringer pendant 1 min.
    6. Interrupteuren mode fluorescent, prendre dernière image fluorescente, et éteignez la solution de Ringer.
    7. Appuyez sur «Stop». La boîte de dialogue vous demandera d'éteindre le système. Sélectionnez «Non» pour continuer l'enregistrement.
    8. Ouvrir bouclier, système de drainage de déplacement, objectif de l'interrupteur à 5X, retirer le tube de perfusion. Retirer l'échantillon / boîte d'enregistrement de l'étape, nettoyer l'objectif 20X d'un rinçage et d'essuyer la lentille à deux reprises avec de l'eau.
    9. Appuyez sur le bouton blanc de jeu en haut de la fenêtre du programme pour lancer l'enregistrement suivant.

3. Analyse et Création vidéo

  1. Extraire des valeurs de photons
    1. Ouvrez le programme d'analyse de photons (par exemple, Photon Viewer) et le fichier de tableur premier échantillon est ouvert.
    2. Sélectionnez l'onglet de commande d'affichage. Sélectionnez le ROI en cliquant sur la région tout en maintenant le contrôle. Ajuster la taille, l'orientation et la forme de régions d'intérêt pour englober GFP CCB illuminée et lobes médians.
    3. Ajouter un ajoutal ROI en cliquant sur "Définir ROI" et en cliquant et en faisant glisser sur l'écran pour créer la nouvelle ROI.
    4. Sélectionnez l'onglet «Movie» à jouer photons vidéo. Réglez "largeur de sec» et «étapes de SEC» comme vous le souhaitez. Réajuster le placement de ROI que nécessaire.
    5. Sélectionnez des captures d'écran représentatives de fluorescence de la GFP, la réponse à la nicotine et la réponse de KCl. Screenshots des cultures et l'image de la pâte dans une diapositive de présentation pour une analyse ultérieure et la comparaison.
    6. Ajuster à la fois la "largeur de sec» et «étape de s" à la vitesse d'enregistrement en secondes. Sélectionnez la longueur de l'analyse en déplaçant les marqueurs gris sur le panneau supérieur à la région de support avant de relance l'initiation et juste après la fin de la réponse.
    7. Sélectionnez «Suspendre vues tout en jouant" presse "<< REW" et appuyez sur "PLAY>". Sélectionnez l'onglet "Cadence de comptage Graphique" et ajuster les éléments souhaités et que les couleurs des lignes pour correspondre à la couleur de ROI.
    8. Lorsque l'analyse est terminée, Appuyez sur "Exporter comte Data Rate". Sélectionnez des captures d'écran de combiné enregistrements CCB et la région du lobe médial de l'intérêt de chaque côté. Screenshots de récoltes et image de coller dans un diaporama avec les images de réponse. Cette diapositive sera utilisé plus tard dans l'analyse finale.
  2. Analyse Exemple: une méthode pour l'analyse des données de photons extraits détaillés
    1. Ouvrez les fichiers de tableur dans le dossier "Count exportations de taux".
    2. Reformater les cellules de la première colonne intitulée temps pour afficher l'heure en heures et minutes.
    3. Référence de la glissière correspondante pour l'échantillon. Retirer toutes les valeurs sauf les colonnes pour le temps et les deux représentant ROI.
    4. Déterminer la nicotine heure de début de la stimulation - disponible dans le fichier d'entrée de journal dans le principal dossier- supprimer des données supplémentaires avant de commencer ou de la valeur de surbrillance.
    5. Trouver plus haute valeur / pic à la fois pour la BCC et le lobe médial et marque / highlight.
    6. Déterminer début de réponse et de fin pour les deuxCCB et le lobe médial en créant une estimation en utilisant le point de temps de réponse correspondant graphiquement sur la diapositive et sélectionnez valeur réelle par le changement dans les valeurs à proximité de ces points. Mettez en surbrillance la région entre ces deux points dans la BCC et lobes médians. Vous pouvez également utiliser une macro 9.
    7. Mélanger tous les échantillons d'un groupe expérimental sur une nouvelle feuille de calcul.
    8. Aligner sur la visière en déterminant la valeur de la ligne est pour chaque valeur de crête de la BCC. Soustraire les valeurs inférieures de la valeur de la ligne la plus élevée pour déterminer la valeur approximative de la ligne où les données que les échantillons doivent être recopiés à. Vérifiez que toutes les valeurs de crête sont alignés.
    9. Copiez la feuille à deux reprises et supprimer soit les colonnes du lobe médial ou les colonnes de la création de pages de CCB ne CCB ou des valeurs de bossage médian.
    10. Supprimer les données après les toutes les réponses CCB ont terminé. Créez quatre rangées étiquetés Nombre de photons, longueur de réponse (durée), Amplitude de crête, et la latence de réponse. Copiez et collez ce nouveau ci-dessous les originaux.
    11. Utilisez la fonction SOMME pour déterminer photons totales au cours de la réponse. Utilisez la fonction COUNT pour déterminer la longueur de la réponse. Copier et lier la cellule de valeur la plus élevée pour déterminer la valeur d'amplitude crête. Utilisez la fonction COUNT - sélectionnez depuis le début de la perfusion de nicotine pour le début de la réponse - pour déterminer la latence de réponse.
    12. Valeurs de copie à l'aide de la fonction de liaison et se multiplient (tous sauf amplitude crête) en enregistrant la vitesse en quelques secondes.
    13. Graphiques bar / boîte peuvent être créés pour les paramètres calculés tels que Total des photons, Amplitude de crête, et réponse de la longueur, si désiré (ex .: figure 5B, C, D).
    14. Dans la colonne après la réponse brute de photons de données, la moyenne des points de données brutes pour chaque point de temps en utilisant la fonction moyenne. Si désiré suivi d'une colonne à déterminer l'erreur standard de la moyenne (SEM), pour chacune des valeurs moyennes des photons à un point de temps.
    15. Utilisez la colonne de la moyenne de construire un profil de réponse moyene [Graphique] pour le groupe de l'échantillon de la BCC. Pour ce faire, sélectionnez la colonne spécifiant le temps que les valeurs de l'axe des x et la colonne des valeurs moyennes de photons que l'axe des ordonnées et enfin sélectionner l'outil de création graphique de nuage de points.
    16. Répéter ce procédé d'analyse avec les données provenant des lobes médians.
  3. Création d'images pour la vidéo
    1. Ouvrir spectateur de photons.
    2. Sélectionnez l'onglet de commande d'affichage. Cliquez sur le ROI tout en maintenant le contrôle pour sélectionner, supprimer et / ou minimiser.
    3. Modifier "largeur de sec" (temps d'accumulation) comme vous le souhaitez afin de déterminer le contenu de chaque trame.
    4. Modifier "étape de sec» pour définir le chevauchement de chaque trame.
    5. Sélectionnez "vues d'exportation tout en jouant" presse "<< REW", puis sur "PLAY>". Les images de la vidéo seront exportés vers le dossier "vue des exportations" comme une série de fichiers .png.
  4. Utilisation de Virtual Dub à faire de la vidéo: une méthode pour la vidéo création détaillée
    1. Créer un nouveau dossier nommé "resultats" dans le dossier vue des exportations contenant les images.
    2. Apportez Script (renommer.VBS) dans le dossier d'images.
    3. Double-cliquez sur renommer.VBS à exécuter.
    4. Images seront automatiquement renommés numériquement et copiés dans le dossier «resultats".
    5. Ouvrir VirtualDub.exe.
    6. Sélectionnez le fichier vidéo ouvert - Sélectionnez première image (images suivantes se chargeront automatiquement).
    7. Sélectionnez une vidéo - select frame rate ajuster comme vous le souhaitez.
    8. Sélectionnez une vidéo - sélectionner une compression sélectionner le codec Cinepak par le rayon.
    9. Dans le fichier sélectionnez Enregistrer sous AVI la vidéo sera automatiquement créé.

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Representative Results

La fusion de la GFP à l'aequorine permet de visualiser la région d'intérêt à l'imagerie bioluminescente préalable par excitation de la GFP en mode fluorescent sur ​​le microscope (Figure 3A, 4A, 6A, 6E). Une des façons les plus simples pour stimuler les corps pédonculés est par l'activation des récepteurs nicotiniques ionotropes de l'acétylcholine. Bien que l'acétylcholine est le ligand endogène de ce récepteur, nous avons trouvé que la nicotine produit des réponses plus reproductibles dans les corps de champignon. Ceci est en partie parce qu'ils expriment spécifiquement les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine, et donc en utilisant la nicotine, nous pouvons éviter l'activation des récepteurs muscariniques de l'acétylcholine exprimées ailleurs dans le cerveau. En outre, la nicotine est plus stable que l'acétylcholine, et permet ainsi une meilleure et plus fiable le contrôle du stimulus. Une réponse typique commence avec l'activation rapide des deux le calice, cell-organismes (CCB) et des lobes médians (ML) (voir la figure 4A l'image de l'étiquette). En général, la réponse du RCC dure plus longtemps et présente une réponse bioluminescente plus grand que les lobes comme montré sur les panneaux séquentiels de la réponse (Figure 3C-H). La figure 4B montre une accumulation de 10 secondes de photons enregistrés à une résolution temporelle de 100 ms (10 Hz) pendant le pic de la réponse à une perfusion de 1 min 25 uM de nicotine. Après une période de 10 minutes une seconde stimulation d'une perfusion de 1 min 100 mM de KCl est initié (figures 4C, E) qui nous permet de confirmer la viabilité de notre échantillon lavage et la récupération. Les réponses quantitatives peuvent être analysées par analyse au cours de la sélection d'un retour sur investissement dans photon spectateur. Exécution de l'analyse photons spectateur produit à la fois des graphiques affichant le nombre de photons émis dans ROI sélectionnée au fil du temps (figure 4D et E) ainsi que des feuilles de calcul exportables de ces valeurs. Figure 4D est une Exemple des graphiques produits par photon spectateur traçant les photons émis dans le ROI 2 [verte] (à droite CCB) et le ROI 4 [bleu] (lobes médians droite). Des données similaires pour la réponse KCl représenté dans la figure 4E. Les données exportées peuvent être utilisés pour reconstruire la courbe de la réponse (figure 5A), ainsi que pour extraire des données supplémentaires sur différents paramètres tels que la durée, l'amplitude de crête, et la réponse totale (Figure 5B-D). Récemment en utilisant les systèmes de Gal4-UAS et LexA nous avons mis au point un procédé pour provoquer une réponse plus naturelle. En bref, le canal de cations ATP-dépendant P2X 2 est exprimé dans les neurones de projection (PNS) et GFP-aequorine (GA) est exprimée dans les corps pédonculés - une cible des CP; ce qui nous permet d'exciter sélectivement les CP si l'application de l'ATP, qui peut à son tour, produire une réponse dans les organes de champignons (Figure 6).

Figure 1 Figure 1. Caractéristiques des bioluminescentes Reporters (GFP-aequorine). (A) Schéma de la GFP et l'équorine gène de fusion avec la séquence d'activation en amont. (B) Modèle d'émission de lumière bleue par équorine en réponse à des niveaux élevés de Ca 2+. (C) Modèle de vert émission de lumière par GFP-aequorine en réponse à des niveaux élevés de Ca 2+. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. expérimental mis en place. (A) Fly positionné dans pipette. (B) Une illustration de technique de collage adéquate stabiliser la tête et la région d'étanchéité entre le corps de la mouche et pipette. (C) Schéma de la dissection d'ouvrir la capsule de la tête. (D) 1 ml chambre sur la tenue de bloc avec le tube de perfusion inséré. Total des dimensions de la chambre: longueur: 7,4 cm, largeur: 2,7 cm, hauteur: 0,55 cm. Dimensions de la chambre intérieure: longueur: 1,7 cm, largeur: 1,4 cm, hauteur: 0,35 cm, et le rayon du trou de la chambre: 0,1 cm. (E) Vue de la tête de mouche montrant signal GFP-positives dans les Mo: faible lumière tamisée avec la fluorescence provenant de OK107 axée GFP-aequorine après le retrait de la cuticule. (F) Microscope avec caméra de photons et le système de perfusion. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. réponse représentatif de 25 uM de nicotine dans les corps de champignon. (A) de l'image fluorescente del'expression de la GFP-aequorine dans les corps pédonculés dans GA2 / +; OK107 / + (barre d'échelle = 50 um) volée de contrôle du cerveau. (B) de réponse bioluminescente de pointe dans les corps pédonculés. (C) avant la stimulation. (D) Début de réponse. (E) la réponse de crête. (F) a continué réponse CCB. (G) Tomber réponse CCB. (H) Fin de la réponse (BH: barre d'échelle = 33 um). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Analyse Représentant de l'enregistrement de l'échantillon (A) de l'image fluorescente du corps de champignons de la GA2 / +;. OK107 / + contrôle voler avec quatre sélectionnés au cours des CCB et médial lobes (les ba échelle de ROIr = 50 um). (B) d'accumulation de 10 secondes de la réaction bioluminescente à 25 uM de nicotine - réponse de photons enregistrés à 100 ms. (C) d'accumulation de 10 secondes de réaction bioluminescente à 100 mM de KCl enregistré à 100 ms. (D) Graphique de nombre enregistré de photons émis lors de la réponse à la nicotine dans les ROI 2 et 4 portant sur ​​le droit CCB et des lobes médians respectivement. (E) Graphique de nombre enregistré de photons émis pendant la réponse KCl dans les couvrant de 2 et 4 ROI les CCB et médial lobes droite, respectivement. En d et e, l'axe Y gauche correspond au nombre total de photons au sein de l'ensemble du champ de vue, tandis que l'axe Y de droite correspond aux photons dans le ROI. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

"Figure Figure 5. Les paramètres représentatifs de l'analyse de l'échantillon d'enregistrement représentatif excel analyse de la réponse à l'activation bioluminescent nicotinique du corps de champignon dans la GA2 / +;. OK107 / + volantes de commande. Réponse (A) Photon fil du temps dans la BCC et les lobes médians. (B) la durée des réponses à la BCC et lobes médians. (C) valeur la plus haute de photons (amplitude maximale) pendant la réponse au sein de la CCB et des lobes médians. (D) Total des photons au sein de la BCC et des lobes médians de réponse entière. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Deux réponse différente au sein des organes de champignons après stimulation des CP Through ATP et P2X 2. Echantillon 1 mouche exprimant P2X 2 dans PNS et GFP-aequorine à corps pédonculés (GH146 / +; P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (ad) (A) de l'image fluorescente des corps pédonculés avec (l'échelle de retour sur investissement. bar = 50 um). (B) l'image bioluminescente de la réponse de crête dans les organes de champignons après l'activation des unités de raccordement par P2X 2 stimulées avec 500 uM d'ATP, observées principalement dans les lobes médians. (C) d'image bioluminescente de la réponse maximale de KCl. (D ) Bien sûr Durée de l'émission de photons dans les régions de retour sur investissement, tout au long de l'Exemple de réponse 2 mouche exprimant P2X 2 dans PNS et GFP-aequorine à corps pédonculés (GH146 / +;. P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (hein ). (E) l'image fluorescente avec (la barre d'échelle de ROI = 50 um). (F) Bioluminescent l'image de la réponse induite dans les corps pédonculés la suite d'unectivation des CP par P2X 2 stimulée avec 1 mM ATP, dans les deux lobes et CCB. (G) de l'image bioluminescente de la réponse maximale de KCl. (H) cours du temps de l'émission de photons dans les régions de retour sur investissement, tout au long de la réponse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'approche de la GFP-aequorine basé bioluminescent-développé récemment présenté ici permet in vivo enregistrement fonctionnel de Ca2 * -Activité à différents neurones, ainsi que le cas échéant, dans d'autres types de cellules telles que des cellules de rein étoilées tel que rapporté dans Cabrero et al. 2013 5.

Modifications, tir ennuis, des composants supplémentaires, et les étapes critiques

Drosophila Elevage

GFP-aequorine transgène (pG5A) 4 a été inséré dans le vecteur pUAST de créer trois lignées transformantes 6 indépendants. Toutes les lignées ont été testées pour leur bioluminescence, et tous ont été en mesure de répondre à l'in vivo Ca2 * -Activité 6. Cependant des expériences plus récentes ont souligné que la ligne ZB2 inséré sur le troisième chromosome génère un signal plus robuste que l'o ligne de GA1 insérén le deuxième chromosome. Ici, les résultats représentatifs ont été obtenus en utilisant des SAMU-GA2 croisés avec les OK107 de ligne MB-spécifique. De plus, récemment B. Pfeiffer a généré une construction d'équorine-GFP placé sous le contrôle d'un élément régulateur 20XUAS (20X-2-G5A) et cette construction a été validée dans notre laboratoire. En bref, il donne un signal très fort, plus fort que notre GA2 standard, qui devrait donc être plus efficace et plus utile de continuer à surveiller l'-Activité Ca 2+ dans les structures profondes du cerveau, telles que l'ellipsoïde-corps. En outre, il peut également être utile pour l'imagerie de petites quantités de neurones ou dans les terminaisons axonales (contacts synaptiques).

Préparatifs pour l'imagerie

Bien que la mouche doit être anesthésiée glace pendant le positionnement et le collage, il est important de minimiser le temps sur la glace. Les mouches doivent être transférés à un flacon de verre et conservés sur de la glace pendant 2 minutes avant d'être déplacé vers la boîte de Pétri réfrigéréspour le positionnement de la pointe de la pipette. Nous avons remarqué que période de temps prolongée de l'anesthésie réduit la viabilité de l'échantillon et peut atténuer la réponse. Idéalement, nous gardons le temps de l'anesthésie de glace en dessous de 5-10 min.

Taping et le collage sont des étapes importantes. Il est crucial pour fixer la tête de mouche en place pour la dissection et l'imagerie ainsi que pour empêcher la fuite de la solution de Ringer dans la pointe de la pipette et / ou hors de la chambre d'enregistrement. Colle dentaire (et dans une moindre mesure la colle de silicium) deviendra collant et commencer à sécher par la suite, dès que les deux composants sont combinés. Par conséquent, il est essentiel d'appliquer la colle rapidement pour éviter l'agglutination faible collage et de la colle. Dans certains cas, nous avons remarqué que les variétés alternatives de ruban adhésif et de colle, lorsqu'il est en contact avec la solution de Ringer, peut libérer des contaminants dans la solution de Ringer qui peuvent affecter la volée et sa réponse, particulièrement pour les expériences dédiées à til étudier de système olfactif, en utilisant différentes odeurs. Par conséquent, soyez prudent ici si les matériaux remplaçant (voir matériaux pour les variétés spécifiques que nous utilisons).

Plusieurs formes différentes de coelentérazine ont été développés afin d'optimiser son activité tels que la vitesse d'émission de lumière, Ca 2+ -affinity (sensibilité), ou de l'intensité d'émission de lumière 12. Par exemple, le coelentérazine natif est plus stable, donc plus approprié d'imagerie longue terme que plusieurs heures, tandis que le benzyl-coelentérazine (également nommé h-coelentérazine) entraîne une émission de lumière plus rapide et plus élevé avec une demi-vie plus courte. Pour plus d'informations sur les différentes formes de coelentérazine, consultez l'adresse Web dans la liste des matières.

Imagerie

Des signaux de bioluminescence peuvent être surveillés avec un appareil multiplicateur d'électrons à CCD (CCD-EM, refroidi à -80 ° C) monté sur un microscope. Cette configuration doit be logé à l'intérieur d'une boîte étanche sombre pour éviter toute (ambiante) la contamination de la lumière indésirable. La configuration décrite dans ce manuscrit utilise une lentille 20X immersion objectif permettant un champ de vision de 400 x 400 um (512 x 512 pixels). Pour améliorer le rapport signal sur bruit, les données ont été acquises avec un temps d'intégration 0,100 sec (10 Hz), et 2 x 2 Binning a été utilisé (1 pixel = 1,2 x 1,2 um). X d'acquérir et de stocker des données, chaque photon détecté a été attribuée, ordonnées et un point de temps. Entre 500 et 600 nm de longueur d'onde, la caméra EM-CCD (voir description précise dans la liste Matériaux) a un rendement quantique de 96%.

L'un des paramètres les plus importants pour l'imagerie du cerveau fonctionnel in vivo est la résolution temporelle. Jusqu'à présent, la majorité de la technique à base de fluorescence de Ca2 + comme GCaMP -Imagerie caméléon et fournit une résolution temporelle de l'ordre de 4 Hz (250 msec / trame). Récemment, avec base de bioluminescence-GFP-aequorine nous avons été en mesure de Raise le temps jusqu'à 100 ms / de cadre avec la caméra EMCCD et même jusqu'à 120 images / s (8,3 ms / frame) avec l'appareil photo de ICDD multiplicateur d'électrons 10 acquisition. À ce que la résolution temporelle des approches techniques électrophysiologiques (dans la plage d'environ 1 ms). Bien que la résolution temporelle est à la fois informatif et crucial pour les études consacrées à la transmission synaptique et de l'activité de stimulation induite, étendu plus lent mais essentiel Ca 2+ -kinetics se produit également dans les neurones, par exemple la libération de Ca 2+ des Ca2 + intracellulaire -stores (pour une revue: Berridge et al, 2003 13.). Pour ce dernier type, une résolution temporelle plus lente est encore acceptable, tandis que inversement, ils nécessitent généralement une meilleure -affinity Ca2 + à partir du capteur à détecter. Cette exigence a été atteinte avec GFP-aequorine à détecter la libération de Ca2 + intracellulaire des -stores au niveau du terminal de l'axone de la récept olfactifors neurones 7,8. En variante, en fonction des conditions expérimentales souhaitées, temps d'acquisition plus lent peut être utilisé. Par exemple, dans la longue O / N enregistrements, nous avons utilisé un temps d'intégration de 2 sec en raison du grand nombre de points de données recueillies (Minocci et al., 2013). En bref, une caractéristique pratique avec la bioluminescence est que la résolution temporelle peut être facilement ajustée selon les conditions expérimentales souhaitées.

Chambres alternatifs (la mouche de configuration de) ont été développés pour faciliter les objectifs de l'expérience. Par exemple, pour les études basées sur des mesures de relance odeur naturelle, l'antenne doit être libre, donc une approche comme celle développée par A. Fiala 14 est le mieux adapté (nous avons utilisé une approche similaire pour Murmu et al., 2010). En bref, dans cette approche, la mouche est attaché (collé) sur un axe de minuties au niveau du cou, qui est collée sur une lamelle en plastique contenant un petit trou. Un joint est crééautour du sommet de la tête de la mouche. Par la suite, une goutte de sonnerie est déposé sur la tête, et la capsule de la tête est disséqué. De cette manière, les antennes sont maintenus libres et sont disponibles pour détecter des odeurs. De même, pour l'enregistrement à long terme, comme O / N ou même quelques jours 10 la mouche doit être aussi libre de contrainte, donc, dans certains cas, alimenté (par exemple: avec un papier capillaire trempé dans un glucose à 5% Solution). Dans ces circonstances, l'approche de Fiala est également plus approprié que l'approche de la pointe de pipette bleu (méthode de la plongée en apnée).

Toutes les demandes de médicaments peuvent être contrôlés à l'aide de l'extérieur d'un système multi-soupapes gravité de perfusion à 6 voies. Le débit peut être contrôlé à l'aide de régulateurs de perfusion volumétriques calibrés avant chaque session d'enregistrement pour un débit de 2 ml / min. Dispositif d'écoulement de liquide extrait à un débit de 2 ml / min à partir de la chambre d'enregistrement par l'intermédiaire d'une pompe péristaltique permettant l'écoulement continu.

Danscertaines conditions, en raison de coût élevé de la drogue et / ou de la quantité de médicament à utiliser, on voudrait appliquer que de petites quantités de composés. Ainsi, il est nécessaire d'appliquer directement dans le bain plutôt que par le système de perfusion. Dans ce cas, le volet doit être fermé pendant ce processus pour éviter la contamination de la lumière.

Méthodes d'analyse

Coups par sec ou de comptages par seconde par de coordonnées ont tous deux été utilisés par notre groupe pour l'analyse. Coups par seconde est peut-être mieux adaptés pour les réponses claires dans les structures entières alors que les comptes par seconde et par coordonnées (ce qui représente une normalisation des réponses à la taille de la ROI) est le mieux adapté et précis pour les petites populations de cellules. Deux d'entre eux peuvent être facilement sélectionnés dans le logiciel d'analyse.

Un des principaux avantages de l'utilisation de l'approche de la bioluminescence est la façon dont sont acquis et stocké les données (x, y, t paramètres dechaque photons émis). En effet, tandis que d'autres techniques d'imagerie utilisées en mode standard comme une image complète acquise (généralement dans un format TIFF), avec ce système, nous ne acquiert le signal pertinent et significatif en ne stockant que les coordonnées des pixels qui ont été activés par la lumière pendant une durée pré-déterminée de temps (ce qui correspond au temps d'acquisition ou résolution temporelle). Par conséquent, le stockage des données est vraiment "la lumière" par rapport à la mémoire une image complète, et par conséquent, il est plus facile d'analyser les données. Pour l'analyse des données, nous utilisons un logiciel connexe (photon spectateur), qui permet de régler le temps d'accumulation comme souhaité. Ensuite, l'affichage d'une image des signaux peut être réglé comme on le souhaite dans un but de présenter les données de façon convaincante. En parallèle, les résultats sont quantifiés en même temps de résolution que leur temps d'acquisition.

Importance et applications biologiques de l'imagerie bioluminescente

Comme mentionné ci-dessus imagerie calcique bioluminescente offre trois avantages principaux à des techniques d'imagerie de calcium fluorescent: (1) une des régions profondes du cerveau peuvent être imagées, (2) l'imagerie peut se produire en continu pour des durées plus longues que plusieurs heures que O / N et même dans certains cas jusqu'à deux jours, et (3), plus récemment, avec une résolution temporelle plus élevée, jusqu'à 120 images / sec (8,3 ms). La principale limitation de l'approche bioluminescente est due à son incompatibilité avec éclairage confocal, qui par conséquent ne nous permet pas de déterminer la profondeur précise (z-régime) des structures ou des neurones activés.

Le premier avantage de l'imagerie bioluminescente, imagerie de régions profondes du cerveau, a déjà été démontré en 2007 par l'imagerie d'une réponse de calcium induite élevée de potassium dans le corps ellipsoïde (eb), une structure profonde située dans le milieu du cerveau, sans préalable rapports électrophysiologiques ou fonctionnelles 6 2+ -Activité spontanée dans le eb après l'application de la picrotoxine (un bloqueur des récepteurs ai GABA A) démontrant que les GABAergiques anneau-neurones du eb sont des neurones inhibiteurs effet (décrit dans :. Couches et al, l'article soumis).

Le deuxième avantage, plus longue et l'enregistrement en temps continu, a été exploité dans plusieurs études de notre laboratoire. Stimulation de l'odeur a été utilisé pour examiner l'activité des neurones du cerveau dans des études antérieures 11,15,16. En utilisant l'imagerie de plus long terme, toutefois, notre laboratoire a été en mesure de montrer des changements non signalés précédemment dans la cinétique dans les neurones récepteurs olfactifs aux odeurs. La première étude par Murmu et al. (2010) ont montré que tandis que des stimuli court d'odeur (03.01 sec) présentaient une cinétique similaire et une différence moyenne de l'amplitude, un stimulus plus d'odeurs (5 secondes) a provoqué une plus grande amplitude ainsi qu'un changer dans la cinétique / structure de la réponse qui a été attribué à des magasins de calcium intracellulaire. Une étude subséquente a montré que, bien que 5 des applications successives de 1 sec impulsions d'odeur à intervalles de 5 minutes ne changent pas leur réponse du calcium, ce qui augmente la durée de l'impulsion de 5 s conduit à une atténuation progressive de la réponse, ce qui suggère un processus d'adaptation. En outre, ce phénomène d'adaptation semble être ouvert par le règlement GABAergique des réserves de calcium précédemment identifiés 8. Surtout ces données prouve également que, dans cette condition expérimentale, Ca 2+ de -Capteur de la GFP-aequorine peut détecter et suivre le calcium libéré des Ca2 + intracellulaire -stores. Une étude supplémentaire unique de notre laboratoire utilise l'imagerie bioluminescente O / N pour enregistrer l'activité basale (spontanée) dans l'ensemble des populations neuronales et gliales dans le cerveau ainsi que l'activité dans les corps pédonculés 10. Ces enregistrements ont révélé une activité spontanée surprenant fourmicentre Ennal mécanosensorielle et le moteur (AMMC) et lobe antennaire. En outre, la cellule inattendue activité autonome dans la glie survenant tout au long de la nuit. Dans le corps de champignon l'étude a identifié deux activités ponctuées et deux pics distinctifs, une courte et une longue dont l'incidence a changé avec l'âge 10.

Dans l'étude la plus récente dans notre laboratoire, nous avons utilisé l'imagerie bioluminescente pour examiner les effets de la manipulation de molécules de signalisation secondaires impliqués dans la mémoire, et comment ils affectent la réponse de calcium dans les corps pédonculés 9. En effet, bien cancre et le rutabaga ont été identifiés il ya plus de 30 ans et sont connus pour réguler le niveau d'AMPc, leurs effets in vivo sur les mécanismes cellulaires et physiologiques et en particulier sur le -response Ca 2+ restent encore largement inconnus. Avec l'approche de la GFP-aequorine, nous avons été en mesure d'enregistrer simultanément le calice (la structur dendritiques) et les corps cellulaires, ainsi que les projections axonales au niveau des lobes, et ce qui permet de corréler le niveau et la cinétique de la réaction dans les différents compartiments de cette structure très complexe.

L'application la plus récente nous développons imite une réponse naturelle à travers les populations neuronales activation artificiellement présynaptiques à la structure d'intérêt. Pour ce faire, nous exprimons le récepteur P2X 2, un canal de cations un ligand qui est sensible à l'ATP, dans le neurone présynaptique et expriment la GFP-aequorine dans la population neuronale post-synaptique. La séparation de ces deux éléments dans les différentes populations neuronales nécessite deux systèmes d'expression différents. À cette fin, une construction contenant LexA GFP-aequorine a été créé. Dans nos expériences préliminaires avec ce système, nous avons exprimé P2X 2 dans un sous-ensemble des unités de raccordement à l'aide de la Gal4-UAS-GH146 avec P2X 2-GFP et l'équorine dans le corps de champignonen utilisant la ligne LexA MB247 combiné avec LexA-13X-GFP-aequorine. Nous avons enregistré avec succès des réponses de calcium dans le corps de champignon avec des stimulations de 1 mM d'ATP au récepteur P2X 2 dans les unités de raccordement (figure 6).

En conclusion, l'approche de la GFP-aequorine bioluminescence a prouvé pour être utile dans l'enregistrement de la relance induite Ca 2+ -Activité, analogue à d'autres Ca 2+ -Indicateurs. Mais plus important encore, il permet également la détection de Ca 2+ -Activité spontanée dans le cerveau. Cette approche ouvre des possibilités futures pour les expériences à long terme et l'imagerie du cerveau entier qui peuvent augmenter la profondeur de notre compréhension des phénomènes physiologiques et les modèles d'activité dans le cerveau.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S3014
CaCl2 Merck 1023911000
HEPES Sigma-Aldrich 7365-45-9
KCl prolabo 26 764.298 normapur
MgCl2 prolabo 25 108.295 normapur
sucrose Sigma-Aldrich S0389
Nicotine Sigma-Aldrich N3876
ATP Sigma-Aldrich A2383 Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine Prolume, nanolight  Cat #301 Coelenterazine h http://www.prolume.com/
dental glue 3M ESPE™ 46954 Protemp IV
silicon glue 3M ESPE™ 36958 Express 2 Regular Body Quick
tape 3M Scotch 122s 3M Scotch Magic Tape
pipette tips Corning Incorporated 4868 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage) hand made
incubation box hand made
forceps (No. 5) Fine Science Tools 11252-00 Micro-dissecting forceps
curved forceps Sigma-Aldrich F4142 Micro-dissecting forceps
glue applicator  hand made 
knife Fine Science Tools 10316-14 5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera  Andor DU-897E-CS0-#BV iXon (cooled to -80 °C)
Microscope Nikon Eclipse-E800
immersion objective lens Nikon 20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence Leica MZ Fl III leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box Science Wares Custom built by Science Wares
peristaltic pump  Gilson Minipuls 2
tubing Fisher Scientific depends on thickness Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system Warner 64-0135  (VC-66CS) Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators Leventon 201108 Dosi-flow 3
measurement and automation explorer Sciences Wares & National Instruments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager  Science Wares & National Instruments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer Science Wares & National Instuments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel Microsoft N/A software https://www.microsoft.com
virtual dub open access  N/A software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2 Martin et al., 2007, Ref. 1  N/A No stocks {currently} publicly available 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP   B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.  (STOCK #1117340) pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2 Lima and Misenboeck, Ref. 11  N/A No stocks {currently} publicly available 
OK107 Bloomington stock center 854 http://flystocks.bio.indiana.edu/

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References

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