Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Biology

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Summary

Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil adaptados usando o corante de fluorescência diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) para en face detecção simultânea e visualização de óxido nítrico intracelular (NO) e ânion superóxido (O 2 .- ), respectivamente, em aortas isoladas de fresco intactas de um modelo de rato de obesidade.

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Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries. J. Vis. Exp. (108), e53718, doi:10.3791/53718 (2016).

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Abstract

óxido nítrico derivado do endotélio (NO) produzido a partir de NO endotelial (eNOS-sintetase) é um dos mais importantes moléculas vasoprotetores na fisiologia cardiovascular. Disfuncional eNOS tais como desacoplamento da eNOS conduz à diminuição da biodisponibilidade do NO e aumento no anião superóxido (O2 .-) produção, e por sua vez promove a doenças cardiovasculares. Portanto, a medida apropriada de NO e O 2 .- níveis nas células endoteliais são fundamentais para a pesquisa sobre doenças cardiovasculares e complicações. Devido à natureza extremamente lábil de NO e O2 .-, é difícil de medir NO e O2 .- directamente num vaso sanguíneo. Diversos métodos foram desenvolvidos para medir NO e O 2 .- produção. É, no entanto, seja insensível, ou não específica, ou tecnicamente exigente e requer equipamento especial. Aqui nós descrevemos uma adaptaçãoo método de fluorescência de corante para a detecção simultânea PT rosto e visualização de intracelular NO e O2 .- usando a célula permeável diaminofluorescein 2-diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE), respectivamente, em aortas intactas de um modelo de rato de obesidade induzida pela alimentação rica em gordura com a dieta. Pudemos demonstrar diminuição intracelular NO e O reforçada 2 .- níveis nas aortas intactas recentemente isolados de rato obesidade, em comparação com o mouse magra controle. Nós demonstramos que este método é uma técnica fácil para detecção direta e visualização de NO e O 2 .- nos vasos sanguíneos intactos e podem ser amplamente aplicada para investigação da função endotelial (dis) em (fisio) condições patológicas.

Introduction

As células endoteliais vasculares manter a integridade funcional e estrutural vascular pela liberação de fatores vasoativos 1. Entre estes factores, o óxido nítrico derivado do endotélio (NO) produzido a partir de L-arginina através de NO endotelial (eNOS-sintase) é o factor mais importante e mais bem caracterizado na fisiologia cardiovascular 2. NO provoca relaxamento do músculo liso e inibe a proliferação celular, inibe a agregação plaquetária e aderência de células inflamatórias e infiltração no espaço subendotelial, por conseguinte, proteger contra o desenvolvimento de doenças vasculares 3. Sob muitas condições fisiológicas e patológicas, incluindo envelhecimento, hipertensão, diabetes, hiperlipidemia, etc, disfunção endotelial caracterizada pela diminuição da biodisponibilidade do NO e aumentou a produção de O2 .- está presente e promove a patogénese da aterosclerose 2. Estudos realizados em anos recentes demonstram que o desacoplamento da eNOS é ummecanismo importante para a disfunção endotelial, em que a enzima eNOS gera O2 .-, em vez de NO, de acordo com as várias condições acima mencionadas 1,4. Portanto, a análise da função endotelial, em particular, a produção de NO endotelial e O 2 .- geração é crucial para a pesquisa experimental sobre as doenças cardiovasculares e as complicações.

Há várias abordagens metodológicas que têm sido desenvolvidos para analisar e medir a produção de NO em amostras biológicas. Devido à natureza extremamente lábil de NO que é facilmente oxidado a NO 2 - e NO 3 - com uma semi-vida de 3 a 6 segundos, é difícil de medir directamente NO. Portanto, a determinação de NO 2 - / NO3 - nas amostras de fluido foi utilizada como um índice de NO libertado a partir de células ou tecidos 5. Embora o procedimento é relativamente fácil, o método é, no entanto, eAsily afectados pela alta fundo do NO estável 2 - / NO3 - contido na solução. Porque NO estimula a guanilato ciclase solúvel para produzir monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) 6, o nível de cGMP celular também foi determinada para estimar a libertação de NO 7. Mais uma vez, esta é uma estimativa indirecta e não pode ser específico, uma vez que alguns factores derivados do endotélio tais como a-peptídeo natriurético tipo C (CNP) também pode aumentar os níveis de cGMP por meio de activação de ciclase de guanilato em partículas 8. O NO é produzido a partir de L-arginina com a geração de L-citrulina como um sub-produto 9, a medição da produção de L-citrulina é, por conseguinte, também utilizada como um método indirecto para estimar a produção de NO. As principais desvantagens deste método são que ele é radioativo e não medir os níveis de NO bioativos, pois NÃO Autorização poderia ser rapidamente inactivado pelo O 2 .-; Além disso, a L-citrulina pode ser reciclado para L-arginina 10. Outros métodos químicos, tais como detecção de quimiluminescência 11, elétron de spin ressonância 12, ou porfirínico eletroquímico NO sensor de 13 são utilizados por vários investigadores. Estes métodos geralmente não são fáceis em funcionamento, procedimentos de detecção e requer equipamento especial. É também de referir que muitos estudos aplicar experiências banho de órgãos com os vasos sanguíneos isolados com ou sem o endotélio para avaliar a função endotelial e indiretamente Medida mediada relaxamentos vasculares derivados do endotélio. No entanto, este método, embora seja principalmente perto de situação fisiológica, mas estritamente a dizer, não mede NO função, em vez avalia respostas vasomotores mediada pelo endotélio em geral que refletem efeitos líquidos da função eNOS, a produção de outra relaxante derivado do endotélio factores e factores contratantes derivado do endotélio, a produção de O2 .-, e também as respostas das células musculares lisasa estes factores. A análise específica da função eNOS ou nenhuma produção é geralmente necessária 3.

Muitos grupos de investigação, incluindo o nosso, nos últimos anos usaram o método do corante de fluorescência para detectar a produção intracelular de NO 14-19. Neste método, a célula indicadora fluorescente permeável diaminofluorescein 2-diacetato (DAF-2DA) foi usada para medir a função NÃO livre e NOS em células e tecidos in vitro ou ex vivo vivo. O princípio é que nas células vivas, DAF-2DA é desacetilada por esterase intracelular para não-fluorescente de 4,5-diaminofluorescein (DAF-2), que foi depois convertida a fluorescente DAF 2-triazole (DAF-2T) fazendo reagir com NO . A fluorescência a partir de DAF-2T podem ser observados sob um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal de fluorescência 14. Por conseguinte, a intensidade de fluorescência intracelular reflecte a produção de NO intracelular nas células do endotélio ou de um vesse no sangue intactoeu. Combinado com um corante fluorescente específico, tal como dihydroethidium (DHE), pode-se avaliar simultaneamente intracelular NO e O2 .- geração nas células ou nos vasos sanguíneos 14. Da mesma forma, a DHE é também um composto de células-permeável que é oxidado por O 2 .- interior das células, e, em seguida, o produto oxidativo intercala com ácidos nucleicos para emitir uma cor vermelho brilhante detectável quantitativamente por microscopia fluorescente ou de fluorescência microscópio confocal. A DHE é um corante muito específico para a detecção de O 2 .- a partir de amostras biológicas, que detecta essencialmente radicais superóxido, é mantida assim por células, e pode mesmo tolerar fixação suave 20. Uma das vantagens deste método de fluorescência do corante é que ele detecta e visualiza NO e / ou de O 2 .- en face directamente sobre a camada endotelial intacta de um vaso sanguíneo de estar.

Nesse papel,descrevemos este método de fluorescência de corantes para detectar NO e O 2 .- que temos adaptado para en detecção de face de NO e O 2 .- em aortas intactas de um modelo de rato obesidade induzida por alta gordura com a dieta (HFD) alimentação. Nós demonstramos que este método poderia com sucesso e de forma confiável medir NO e O 2 .- níveis e avaliar a função eNOS (dis) na camada endotelial de aortas de rato intactas recém-isoladas em obesidade.

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Protocol

animal de trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética do Veterinário de Fribourg, Suíça. O protocolo segue as orientações sobre cuidados com os animais e experimentação em nossa instituição.

1. Preparação de um Set-up para a incubação de Isolated Artérias

  1. Construção de um sistema de banho de órgãos que pode ser aquecida a 37 ° C e arejada com 95% de O2 e 5% de CO 2 a partir de um tanque de gás de carbono.
  2. Preparar de forma muito tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer, conforme necessário, com a concentração de a composição seguinte: (NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, CaCl 2 2,5, MgSO 4 1,2 mM, 1,2 mM de KH 2 PO 4, mM de NaHCO 25 3, 0,026 mM de EDTA e mM de D-glicose 11,1).
  3. Manter o tampão de estoque em gelo e arejar o tampão com 95% de O2 e 5% de CO 2.
  4. Ligar o sistema de banho de órgãos, ajustar a temperatura a 37 ° C, adicionam-se 5 ml do tampão de pronto-para-uso para cada câmarae manter o arejamento do tampão com 95% de O2 e 5% de CO 2.
  5. Lavam-se as câmaras de uma vez com tampão de Krebs-Ringer durante 30 min.
  6. Adicionar 5 ml de tampão de Krebs-Ringer a cada câmara e cobrir a câmara para evitar a evaporação.

2. Isolamento de rato aortas

  1. Injectar pentobarbital que é dissolvido em NaCl a 0,9% por via intraperitoneal, na concentração de 150 mg / kg de sacrificar os ratinhos.
  2. Coloque o mouse passivamente em uma placa cirúrgica.
  3. Pulverizar a pele da região do peito, com 70% de etanol para fins de sanitização e umidade.
  4. cavidade torácica aberta cortando em torno da costela para expor o coração e os pulmões, e remover os pulmões.
  5. Remover o sangue na cavidade torácica suavemente com um toalhete de papel.
  6. Segure o coração delicadamente com uma pinça e retire da aorta torácica, cortando o tecido adiposo perivascular entre a aorta e da coluna com uma tesoura cirúrgica.
  7. imediatamente mergulhe o whole tecidos em gelo frio (4 ° C) tampão Krebs-Ringer.
  8. Remover o coração e o arco aórtico sob um microscópio de dissecção e manter o segmento da aorta torácica no buffer.
  9. Dissecar a aorta livre de aderir tecido perivascular sob um microscópio com uma tesoura cirúrgica e uma pinça.
  10. Segure a borda final da aorta com uma pinça, e lave o sangue na luz vascular por lavagem suavemente tampão Krebs-Ringer com um 26 G × 1 / 2" seringa.
  11. Corte os anéis de aorta limpas em longos segmentos de 3 mm.
    Nota: Preste atenção nesta etapa para não danificar camada endotelial.

3. DHE e DAF-2DA Coloração

  1. Transferir os segmentos aórticos limpa com um fórceps para as câmaras de banho de órgãos cheios com o tampão de Krebs-Ringer a 37 ° C arejada com 95% de O2 e 5% de CO 2.
    Nota: Toque apenas o lado adventícia dos anéis de aorta com uma pinça e não prender a bvasos Lood.
  2. Equilibrar as artérias na câmara de banho de órgãos durante 30 min.
  3. Adicionar a acetilcolina (ACh) ao banho de órgãos para a concentração final de 1 uM, e incuba-se as artérias, durante 10 min.
  4. Prepare 1 ml de solução de DHE / DAF-2DA (5 uM de cada corante, diluiu-se a partir de 1,000 × estoque) com tampão Krebs-Ringer pré-aquecida em 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Enrole o tubo de microcentrífuga com papel alumínio para evitar a exposição à luz.
  5. Após a estimulação, transferir os anéis de aorta a partir de banho de órgãos para a solução de DHE / DAF-2DA num tubo de microcentrífuga a 37 ° C arejada com 95% de O 2 e CO 2 a 5% e incuba-se os anéis aórticos em 30 min.
    Nota: A partir desta etapa, mantenha as aortas sempre no escuro.
  6. Transferir os anéis aórticos para um novo tubo de microcentrifugação com tampão de Krebs-Ringer para lavar e repetir a lavagem três vezes dentro de 1 min.
  7. Transfira os anéis de aorta de solução de paraformaldeído a 4% para fixação para 30min.
  8. Prepare 1 ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) solução (300 nM, diluiu-se a partir de 1,000 × estoque) com tampão fosfato salino (PBS) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Contracoloração as aortas durante 3 min.
  9. Transferir as aortas para novo tubo de microcentrifugação com tampão PBS para lavagem durante 1 min. Repetir a lavagem três vezes.
    Nota: Preste atenção para não prender os anéis de aorta ou danificar o endotélio.

4. Rosto En Montagem

  1. Adicionar uma gota de meio de montagem para a corrediça.
  2. Corte os anéis de aorta longitudinalmente com uma tesoura de microcirurgia sob o microscópio, faça as aortas enroladas plano e montá-lo en rosto no meio de montagem com o endotélio virado para baixo na lâmina de vidro. Não mova as aortas e para trás.
  3. Cobrir a lâmina com tampa de deslizamento e selar o slide com unha polonês.
  4. Após secagem ao ar sob a proteção de luz, use os slides para imagens directly dentro de horas ou armazená-los a -20 ° C para próximos dias.

5. confocal microscópica de imagem

  1. Usar um microscópio confocal para detectar os sinais de fluorescência. Ligue a máquina e otimizar as configurações de imagem, como ampliação, velocidade de digitalização, a resolução, Z-stack.
    1. Para este protocolo, usar um 200 Hz velocidade de digitalização, resolução de 1.024 × 1.024 pixels e tamanho Z-passo de 0,25 mm. Excita a fluorescência da DAF-2DA com laser de argônio de 488 nm e detectar a 515 nm, enquanto que excita a fluorescência da DHE a 514 nm e detectar a 605 nm de emissão.
  2. Use 10X ampliações para focar a amostra até que o sinal DAPI é claro com os raios ultravioletas, e depois ajustar o objetivo de 40X ampliações.
  3. Definir a gama da camada endotelial, ajustando a posição de Z do painel de controlo. Os sinais de núcleos corados-DAPI são pontos ovais ou redondas na camada endotelial.
  4. Digitalização a partir do topo(Camada endotelial no lúmen da fronteira) da amostra através de toda a espessura de imagens de sinal e ficha endoteliais. Escolha pelo menos 3 campos diferentes para a digitalização de cada amostra.

6. Análise de Imagens

  1. Use software para abrir os dados digitalizados por microscopia confocal. Escolha três imagens consecutivas por campo para análise e avaliar, pelo menos, 3 campos diferentes por amostra. Exportar as imagens escolhidas e salvá-los como arquivos JPEG.
  2. Quantificar as imagens de DAF-2DA, DHE e DAPI coloração com software de processamento de imagem. Para a imagem da coloração DAPI, escolha 'Plugins' → 'Analisar' → 'Counter celular' para contar o número de núcleos DAPI positivo.
    1. Para as imagens da DAF-2DA e coloração DHE, escolha "Analisar" → "medida" para analisar a intensidade dos sinais, e tomar o valor "médio" como a intensidade relativa do sinal. Presente, então os resultados como a relação de DAF-2DA anúcleos positivos DAPI ou o prolongamento de DHE para DAPI. Para cada amostra, tomar o valor médio de cada imagem e de campo.
  3. Dividir o resultado de cada amostra por a média do grupo de controlo para obter a mudança de dobragem. A análise estatística foi realizada com o teste t de Student não pareado ou ANOVA com Dunnett ou pós-teste de Bonferroni. Dê dados como média ± SEM. Considerar as diferenças nos valores médios como significativo p <0,05 14.

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Representative Results

A obesidade é um importante fator de risco de doença cardíaca isquêmica coronariana e está associada à diminuição endoteliais biodisponibilidade, uma característica da doença vascular aterosclerótica 21. eNOS desacoplamento foi demonstrado ser um importante mecanismo de disfunção endotelial sob várias condições fisiológicas e patológicas, incluindo envelhecimento 22, aterosclerose, obesidade e 14. Portanto, aqui vamos comparar os ratos magros e obesos para mostrar o resultado representativo de NO e O 2 .- níveis nas aortas.

Começando com a idade de 7 semanas, os ratinhos macho (C57BL / 6J) tiveram acesso livre durante 14 semanas, quer um dieta normal (NC; teor de energia: 10,6% de gordura, de proteína de 27,6%, e 57% de hidratos de carbono, fibra 4,8% ) ou uma dieta rica em gordura (DFH, o conteúdo de energia: 55% de gordura, 21% de proteína e 24% de hidratos de carbono). Após 14 semanas de ratos HFD foramsacrificados e as aortas torácicas foram dissecadas e limpos de tecidos aderentes. Antes DAF-2DA DHE e coloração passo, os inibidores da eNOS LN L -Nitroarginine metil éster (L-NAME) (1 mM) foi adicionado à câmara do banho durante 1 h para bloquear a atividade da eNOS 14. Os resultados representativos confocal de fluorescência foram mostrados na Figura 1. A cor azul no painel superior representa o núcleo das células endoteliais coradas com DAPI. No painel do meio, a cor verde é o sinal de fluorescência a partir de DAF-2T convertido a partir do DAF-2 não-fluorescente por NO, o que significa que, se a intensidade do sinal verde é mais elevado, existem mais NO nas células. Da mesma forma, a cor vermelha no painel inferior é o sinal de fluorescência a partir de DHE oxidado por O 2 .-, de modo que a amostra de cor que mostra mais vermelha tem mais de O 2 .- nas células.

microscopia de fluorescência confocal revelou diminuiçãod a produção de NO (DAF-2DA coloração) e aumentou-L-NAME sensível O2 .- geração (coloração DHE) na camada endotelial aórtica de ratos alimentados HFD quando comparada com a dos ratos alimentados NC (Figura 1) 14, sugerindo eNOS desacoplamento da obesidade. Os sinais foram quantificados e apresentados nos gráficos de barras 14.

figura 1
Figura 1. eNOS-desacoplamento da obesidade. Microscópico confocal en detecção de face de NO e O 2 .- por DAF-2DA e coloração DHE, respectivamente. n = 5; *** p <0,005 vs NC; ††† p <0,005 vs grupo HFD. Barra de escala = 0,1 mm. (Os dados foram provenientes de referência 14) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Detecção de NO ou O 2 .- com corantes fluorescentes era frequentemente usado em muitos estudos em células endoteliais cultivadas e também em criosecções tecido 23. Aqui nós estendemos este método para os vasos sanguíneos de vida intacta, ou seja, en detecção de face de NO e O 2 .- níveis na camada endotelial com DAF-2DA e DHE, respectivamente, o que é eficaz, relativamente simples e intuitiva. Em comparação com o método no criosecções vasculares, este método mostra fundo inferior e é mais quantitativa, uma vez que as fibras elásticas nos meios de comunicação de uma artéria particularmente a aorta nas criosecções dar sinais de autofluorescência muito fortes, que possam interferir com o NO ou O 2 específico. - sinais gerados em células endoteliais. Além disso, ó específica 2 .- geração de NADPH-oxidase ou outras enzimas nas células musculares lisas mediais também possa interferircom os sinais em células endoteliais na secção vascular, o que representa o inconveniente de o método com criocortes vasculares. Em contraste, o método de coloração PT cara especificamente detecta os sinais a partir da camada endotelial de um segmento de vaso sanguíneo intacto e, por conseguinte, dá uma análise mais precisa. Uma máquina de criostato para a preparação criocorte também é um investimento caro. Comparando com outros métodos bioquímicos, a principal limitação deste método é menos quantitativa, mas é uma boa escolha para comparação relativa entre as amostras. Além disso, o requisito de um microscópio confocal que é caro pode também ser uma limitação deste método. O sistema de câmara múltipla de órgãos é conveniente e, se este não está disponível no laboratório, pode-se facilmente estabelecer um sistema com banho de água e tubos que estão ligados a um tanque de gás de carbono com o sistema de regulação, de modo que os vasos sanguíneos nos tubos são mantida a 37 ° C e arejada com 95% de O2 e 5% de CO

Há vários passos críticos que se tem que prestar atenção. Certifique-se de que o tecido perivascular é limpo para montagem fácil. Os coágulos de sangue na luz vascular deve ser lavada fora, porque eles podem causar sinais artificiais e interferir com os sinais de fluorescência. Durante todo o processo de preparação dos vasos sanguíneos, incubação, lavagem, de corte e de fixação, tem de ser extremamente cuidadoso para não danificar a camada endotelial dos vasos sanguíneos. Não deixe que a seca dos vasos sanguíneos durante todo o processo de preparação. DHE e DAF-2DA são ambas as sondas fluorescentes, de modo que a partir do passo de coloração as aortas devem ser sempre protegidos contra a exposição à luz. Antes da fixação passo as células endoteliais de aorta deve ser vivo, de modo que as aortas deve ser sempre mantido no tampão de Krebs-Ringer arejada com 95% de O2 e 5% de CO 2. Imagens das amostras devem ser tomadas o mais rapidamente possível após a preparação. a fluorescênciasinal nce ficarão mais fracos em poucos dias, mesmo com a protecção do meio de montagem, o que pode afetar a precisão dos resultados. O método pode não se aplicar para os vasos sanguíneos com a parede vascular muito grosso.

Este método permite a imaginação simultânea de NO e O2 .- da produção da camada endotelial de vasos sanguíneos intactas, se os dois corantes foram adicionados para os vasos sanguíneos em conjunto. Pode-se também usar este método para avaliar os efeitos farmacológicos das drogas sobre NO e O 2 .- produção in vitro nos vasos sanguíneos isolados. Para este efeito, a aorta é feita normalmente cortada em duas partes, uma para o controlo e a outra é para o tratamento de drogas, e a droga deve ser adicionado ao tampão de incubação, após o equilíbrio antes de DAF-2DA DHE e coloração passo. É particularmente útil, se este método for utilizado em conjunto com um outro método, por exemplo, com a análise das respostas vasomotoras de sangue isolado vessels, uma função fisiológica de células endoteliais pode ser confirmada. Este método será também adequado para análise de qualquer função endotelial (dis) nos vasos sanguíneos intactos de modelos de doença e os mecanismos subjacentes.

Em resumo, foi apresentado um protocolo simples para detectar simultaneamente NO e O2 .- produção na camada endotelial de vasos sanguíneos intactas com um microscópio confocal de fluorescência. Nós mostramos como esse método funcionou com sucesso em modelo de rato obesidade. Este método é uma técnica útil na investigação de NO endotelial e O 2 .- produção sob muitas condições de doença vascular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dihydroethidium (DHE) Invitrogen D 1168 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) Calbiochem 251505 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D 1306 dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium Vector labor. (reactolab) H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) Sigma-aldrich N5751
Pentobarbital Sigma-aldrich P3636
Multi-Myograph System  Danish Myo Technology A/S Model 610M
Microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope  Leica  DM6000 
Image processing software National Institute of Health (NIH) Image J 
Surgical scissors  S&T AG SDC-11
Microsurgical scissors  F.S.T 15000-01
Forceps S&T AG JF-5
Coverslip round diameter 15 mm VWR 631-1579
Tips 1 ml VWR RFL-1200c 
Tips 200 μl VWR 613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml Eppendorf  30120086
Acetylcholine chloride Sigma-aldrich A-6625

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References

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