जाग व्यवहार मकाक बंदर कोर्टेक्स में सूचना प्रोसेसिंग की neuropharmacology जांच के लिए एक दबाव इंजेक्शन प्रणाली

Behavior
 

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Veith, V. K., Quigley, C., Treue, S. A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex. J. Vis. Exp. (109), e53724, doi:10.3791/53724 (2016).

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Abstract

Protocol

जानवरों की देखभाल और सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं जर्मन कानूनों शासी जानवरों की देखभाल के अनुसार आयोजित की और ब्राउनश्विक, Lower Saxony, जर्मनी के जिला सरकार द्वारा अनुमोदित किया गया।

नोट: के रूप में प्रयोग विवो में किया जाता है, यह महत्वपूर्ण है उच्चतम संभव स्वच्छता मानकों को बनाए रखने के लिए। जब भी संभव हो, बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं।

1. इंजेक्शन / रिकॉर्डिंग सिस्टम तैयार कर रहा है

  1. ट्यूब सिरिंज के साथ micropipette जोड़ता है जीवाणुरहित। इंजेक्शन पंप और electrophysiological रिकॉर्डिंग सिस्टम के बीच प्रयोगात्मक सेट अप में ट्यूब संभव के कम से कम लंबाई का प्रयोग करें।
  2. साफ सफाई के तारों का उपयोग कर रिकॉर्डिंग प्रणाली की गाइड ट्यूबों। उन्हें बाँझ सिलिकॉन तेल में गिरावट और कई बार अलग-अलग गाइड ट्यूबों के माध्यम से उन्हें खिलाओ।
  3. रिकॉर्डिंग प्रणाली में से एक गाइड ट्यूब में क्वार्ट्ज गिलास micropipette डालें। चित्रा 1 ए देखें।
  4. micropipette में फिक्सिंग के बादरिकॉर्डिंग प्रणाली, micropipette की धातु पिन करने के लिए बाँझ ट्यूब देते हैं। ध्यान रखें; हालांकि micropipette प्रणाली में तय हो गई है यह आसानी से जब ट्यूब संलग्न तोड़ सकते हैं। पिन और ट्यूब पर बराबर दबाव लागू करने के लिए दो बाँझ चिमटी का प्रयोग करें।
  5. ट्यूब और micropipette के बीच जंक्शन सील करने के लिए तरल सुपर गोंद का प्रयोग करें। कम से कम 3 घंटा रुको गोंद के लिए तरल के साथ micropipette भरने से पहले कड़ा करने के लिए।
  6. पहले या micropipette प्रविष्टि के बाद microelectrodes (जैसे, क्वार्ट्ज गिलास अछूता प्लैटिनम टंगस्टन) रिकॉर्डिंग प्रणाली के अन्य पदों में डालें।

2. पदार्थ तैयारी

  1. जीवाणुरहित एक आटोक्लेव या अन्य विश्वसनीय प्रक्रिया का उपयोग कर इंजेक्शन समाधान के बाद के भंडारण के लिए 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब।
  2. इसी पदार्थ scopolamine हाइड्रोक्लोराइड वजन एक 0.1 दाढ़ समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार करने के लिए। बाँझ खारा (0.9% NaCl) में भंग।
  3. बाँझ शर्तों के तहतna हुड धूआं, समाधान पर्याप्त बड़ी ताकना व्यास के साथ एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर, जैसे, 0.2 माइक्रोन फिल्टर।
  4. धूआं हुड के तहत, scopolamine के लिए, एक ही प्रयोग के लिए पर्याप्त मात्रा में, उदाहरण के समाधान में विभाज्य बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 500 μl। प्रकाश से पदार्थ की रक्षा के लिए अंधेरे ट्यूब का उपयोग करें; वैकल्पिक रूप से, एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूबों लपेटो। scopolamine के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 14 दिनों के लिए समाधान की दुकान।

3. इंजेक्शन / रिकॉर्डिंग सिस्टम की दैनिक तैयारी

नोट: जब रिकॉर्डिंग प्रणाली में मुहिम शुरू की, इलेक्ट्रोड और micropipette रिकॉर्डिंग के बीच एक एंजाइम समाधान (Tergazyme, विआयनीकृत पानी के साथ 1% समाधान) में जमा हो जाती है। निम्नलिखित कदम हर रिकॉर्डिंग से पहले किया जाना चाहिए।

  1. पदार्थ की एक ट्यूब लीजिए इंजेक्शन जा। यह आरटी तक पहुँचने के लिए यदि प्रशीतित की अनुमति दें।
  2. एंजाइम समाधान से इंजेक्शन / रिकॉर्डिंग सिस्टम को हटा और इलेक्ट्रोड कुल्लाऔर विआयनीकृत पानी के साथ micropipette एंजाइम समाधान के लिए पूरी तरह से साफ करने के लिए।
  3. आदेश नेत्रहीन micropipette और ट्यूब के बीच सील की जाँच करने में रिकॉर्डिंग प्रणाली के सामने कवर निकालें।
  4. आदेश में निर्बाध आवाजाही के लिए प्रणाली चिकना करने के लिए गाइड ट्यूब में अंतर (चित्रा 1 ए देखें) और इलेक्ट्रोड और micropipette के सुझावों को बाँझ सिलिकॉन तेल लागू करें।
  5. एक माइक्रोस्कोप का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए वे बरकरार हैं इलेक्ट्रोड और micropipette के सुझावों की जाँच करें। खुर्दबीन के नीचे इलेक्ट्रोड और micropipette संरेखित इतना है कि वे एक ही लंबाई के साथ गाइड ट्यूबों के बाहर का विस्तार। उन्हें गाइड ट्यूबों में ड्राइव, जैसे ही वे अब नहीं दिखाई दे रहे हैं रोक नहीं सकता। यह इलेक्ट्रोड स्थिति शून्य के रूप में परिभाषित किया गया है। सॉफ्टवेयर में 0 से इलेक्ट्रोड की गहराई और micropipette सेट करें।
  6. बाँझ खारा के साथ एक बाँझ सिरिंज भरें और ट्यूब में सुई डालने, देखभाल करने के ट्यूब की दीवार बेध नहीं। विसू के लिए गाइड ट्यूब से बाहर micropipette ड्राइवपदार्थ के प्रवाह के अल नियंत्रण।
  7. फ्लश में कम से कम 2 ट्यूब और micropipette के माध्यम से मिलीलीटर बाँझ खारा कोई हवा सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज में या ट्यूब में रहता है। सिरिंज के सवार को बहुत अधिक दबाव लागू न करें। ट्यूब और micropipette के बीच जंक्शन सुनिश्चित बंद है। अगर रिसाव दिखाई दे रहा है, जंक्शन (1.5 कदम देखें) फिर से गोंद और रिकॉर्डिंग स्थगित।
  8. , भरें समाधान के साथ एक नया बाँझ सिरिंज इंजेक्शन जा खारा और सिरिंज के बैरल के साथ यह आदान प्रदान, यानी ट्यूब में खारा भरा सिरिंज की सुई रखने के लिए। सुनिश्चित करें कि कोई हवा प्रणाली में स्थानांतरित किया है सुनिश्चित करें। यह सबसे अच्छा खारा से भरे बैरल हटाने के बाद नमक के साथ सुई हब भरने के द्वारा हासिल की है।
  9. सिस्टम फ्लश के साथ समाधान के 250 μl पूरी तरह से ट्यूब से खारा हटाने के लिए आदेश में, इंजेक्शन जा।
  10. मोटर नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, कम से कम -500 माइक्रोन की गहराई guidetubesto में इलेक्ट्रोड और micropipette वापस लेना।
  11. (चित्रा 1 ए) कम करें।
  12. इथेनॉल के साथ प्रणाली का आधार है, विशेष रूप से जहां यह बंदर की रिकार्डिंग कक्ष छू जाएगा साफ करें।
  13. सामने कवर की जगह और शिकंजा कस द्वारा रिकॉर्डिंग प्रणाली को बंद करें।

4. इंजेक्शन प्रणाली के सत्यापन

नोट: हालांकि कंपनी प्रणाली calibrates, यह सामग्री (ट्यूब, सीरिंज आदि) प्रयोगात्मक सेट अप में इस्तेमाल के साथ निकली मात्रा में मान्य करने के लिए सिफारिश की है।

  1. चरण 3 में वर्णित के रूप में, इलेक्ट्रोड और micropipette गाइड ट्यूबों के बाहर बढ़ाया रखने प्रणाली तैयार करें। कम से कम 7,000 पर माइक्रोन की गहराई micropipette और इलेक्ट्रोड की बाहरी सतह के साथ आसंजन के कारण माप मात्रा के नुकसान से बचने के लिए सिफारिश की है।
  2. स्थिति यह प्रयोग के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा में रिकॉर्डिंग प्रणाली की जगह और syrin डालmicroinjection पंप में जीई। रबर बैंड और समायोज्य पकड़ का उपयोग जगह में सिरिंज फिक्स (चित्रा 1 ए देखें)। पंप के चल भाग स्लाइड जब तक यह सिरिंज के सवार के पीछे जगह में मजबूती है।
  3. सॉफ्टवेयर नियंत्रित मोटर इकाई का उपयोग करना, एक मात्रा काफी बड़े, ठीक मापा जा बेदखल जैसे।, 1000 nl। यह क्रम में कुल मात्रा बेदखल करने के लिए एक भी कदम का उपयोग करने के लिए micropipette सतह के साथ केशिका क्रिया के प्रभाव से बचने के लिए बेहतर है। बहुत कम वेग (1 nl / एस) ने भी सत्यापन प्रक्रिया के दौरान इस आशय का नेतृत्व कर सकते हैं।
  4. एक कंटेनर के नीचे रखा micropipette में कुल मात्रा लीजिए, या ध्यान micropipette की नोक से सीधे निकली बूंद इकट्ठा। निकली मात्रा एक पिपेट का उपयोग अनुमान या एक सटीक पैमाने के साथ वजन द्वारा।
  5. प्रक्रिया माप पुष्टि करने के लिए कई बार दोहराएँ।

5. तीव्र रिकॉर्डिंग

  1. XY स्थिति सेट करेंरिकॉर्डिंग प्रणाली की। इस बिंदु पर, जो गाइड ट्यूबों लंबे समय से प्रत्यारोपित रिकार्डिंग कक्ष के भीतर ड्यूरा मेटर तक पहुंचने परिभाषित करता है। यकीन गाइड ट्यूबों पूरी तरह से मुकर रहे हैं (गाइड ट्यूब Z स्थिति 0) बनाओ।
  2. स्थिति में रिकॉर्डिंग प्रणाली लाओ और microinjection पंप में सिरिंज रखें। रबर बैंड और समायोज्य पकड़ का उपयोग जगह में सिरिंज फिक्स (चित्रा 1 ए देखें)। पंप के चल भाग स्लाइड जब तक यह सिरिंज के सवार के पीछे जगह में मजबूती है। पदार्थ की एक बूंद गाइड ट्यूबों की नोक पर दिखाई दे रहा है, तो इसे ध्यान से एक बाँझ कपास कली का उपयोग कर हटा दें।
  3. रिकॉर्डिंग प्रयोगशाला की प्रक्रिया के अनुसार (उदाहरण के दिशा निर्देशों के लिए 18 देखें) के लिए पशु तैयार करें।
  4. सुरक्षित रूप से बंदर की रिकार्डिंग कक्ष पर रिकॉर्डिंग सिस्टम माउंट।
  5. धीरे-धीरे मैन्युअल रिकॉर्डिंग कक्ष तक पहुँच जाता है ड्यूरा में गाइड ट्यूबों कम है, तो मोटर कंपनी का उपयोग कर इलेक्ट्रोड ड्राइवntrol सॉफ्टवेयर।
  6. पहले इलेक्ट्रोड के साथ ड्राइव और विभिन्न गहराई में नियमित रूप से अपने impedances जाँच यह micropipette के प्रतिबाधा को मापने के लिए संभव नहीं है। बाद ड्यूरा की पैठ सफलतापूर्वक इलेक्ट्रोड को नुकसान पहुँचाए बिना किया जाता है, micropipette अग्रिम।
  7. इलेक्ट्रोड और लक्ष्य इलेक्ट्रोड गहराई जिस पर ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र में पाया जाने की संभावना है करने के लिए micropipette ड्राइव। धीरे-धीरे इलेक्ट्रोड अग्रिम जब तक यह काफी करीब एक इकाई की गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए है, के रूप में दर्ज संकेत में एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात इसका सबूत है। महत्वपूर्ण बात है, उसी गहराई में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और micropipette स्थिति इलेक्ट्रोड और micropipette के बीच न्यूनतम दूरी सुनिश्चित करने के लिए।
    1. यदि संभव हो तो, पूरी रिकॉर्डिंग के लिए इस गहराई में इलेक्ट्रोड और micropipette रहते हैं। हालांकि, अगर दर्ज सेल के संकेत गुणवत्ता बनाए रखने के लिए एक ही रास्ता इलेक्ट्रोड स्थानांतरित करने के लिए है, तो इलेक्ट्रोड और micropipette ड्राइवएक साथ उन दोनों के बीच दूरी बनाए रखने के लिए।

6. स्थानिक ध्यान कार्य

  1. स्क्रीन पर परीक्षणों की एक श्रृंखला, वर्तमान दो डॉट चलती पैटर्न में से एक है, और यह दर्ज न्यूरॉन के अन्य बाहर की ग्रहणशील क्षेत्र के भीतर तैनात एक साथ एक केन्द्र प्रस्तुत निर्धारण बिंदु पशु प्रत्येक परीक्षण के दौरान 19 foveate की है कि सभी के साथ, 20।
    नोट: बंदर cued डॉट पैटर्न में एक दिशा बदलने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए प्रशिक्षित किया जाता है (लक्ष्य घटना) अन्य डॉट पैटर्न में किसी भी दिशा परिवर्तन की अनदेखी, और एक परीक्षण 19 के हर सफल समापन के लिए तरल पदार्थ की एक बूंद के साथ पुरस्कृत किया है, जबकि, 20। एक संवेदी नियंत्रण शर्त के रूप में, बंदर निर्धारण बिंदु के एक luminance परिवर्तन रिपोर्ट करने के लिए दोनों डॉट चलती पैटर्न (कार्य की एक अधिक विस्तृत विवरण के लिए चित्र 2 देखें) की अनदेखी करते हुए दिया है।

7. औषधीय हेरफेर जबकि रिकॉर्डिंग

  1. एक इंजेक्शन ब्लॉक के दौरान नियमित अंतराल पर पदार्थ की एक पूर्वनिर्धारित राशि सुई जैसे।, 2 nl 2 nl / एस की दर से हर मिनट। इस उदाहरण के लिए, scopolamine हाइड्रोक्लोराइड का उपयोग करें। इंजेक्शन प्रक्रिया सॉफ्टवेयर है जो विभिन्न विकल्प प्रदान करता है का उपयोग कर नियंत्रित किया जाता है। उदाहरण के लिए, इंजेक्शन की मात्रा को परिभाषित है, और रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर की घड़ी के अनुसार इंजेक्शन बटन प्रेस करने के लिए हर मिनट कदम समारोह का उपयोग करें।
    नोट: इंजेक्शन ब्लॉक की सही अवधि पदार्थ है और आश्रित, 2 nl इंजेक्शन प्रत्येक मिनट प्रयोग जैसे, scopolamine उपयोग के लिए 10 मिनट (कुल 20 NL) के लिए।। यह बेहतर है इलेक्ट्रोड और micropipette Duri अग्रिम करने के लिए नहींइंजेक्शन ब्लॉक एनजी।
  2. नोट समय और जिसके दौरान पदार्थ परीक्षण इंजेक्ट किया जाता है, इलेक्ट्रोड और micropipette की गहराई, साथ ही निकली पदार्थ की राशि।
  3. एक वसूली ब्लॉक, जिसमें कोई पदार्थ इंजेक्ट किया जाता है के साथ इंजेक्शन ब्लॉक का पालन करें। वसूली ब्लॉक की अवधि पदार्थ विशिष्ट है और पूर्व परीक्षण में परिभाषित किए जाने की जरूरत है। मॉनिटर और वसूली ब्लॉक के अंत तक चयनित एकल इकाइयों की रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए।
  4. के रूप में लंबे समय के रूप रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता और बंदर की प्रेरणा की अनुमति देने के लिए तीन ब्लॉकों को दोहराएँ।

8. पोस्ट रिकॉर्डिंग प्रक्रिया

  1. डेटा रिकॉर्डिंग के बाद, गाइड ट्यूबों में इलेक्ट्रोड और micropipette वापस लेना और फिर स्वयं गाइड ट्यूबों वापस लेना। बंदर की रिकार्डिंग कक्ष से रिकॉर्डिंग प्रणाली निकालें। इंजेक्शन पंप से सिरिंज जारी है और सफाई के लिए तैयारी क्षेत्र के लिए प्रणाली हस्तांतरण।
  2. पशु संभाल(रिकॉर्डिंग कक्ष 18 वर्ष की सफाई सहित) प्रयोगशाला के मानक प्रक्रियाओं के अनुसार और यह आवास की सुविधा के लिए वापसी।
  3. हाइड्रोजन पेरोक्साइड (3%) और फिर विआयनीकृत पानी के साथ साथ गाइड ट्यूबों के बाहर कुल्ला। ड्राइव इलेक्ट्रोड और गाइड ट्यूबों के बाहर micropipette, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और फिर विआयनीकृत पानी से कुल्ला।
  4. बाँझ खारा से भरा एक सिरिंज के एक बैरल के साथ सिरिंज की नली विनिमय, ट्यूब में सुई रखते हुए। ट्यूब और खारा के 1-2 मिलीलीटर के साथ micropipette फ्लश। निस्तब्धता के बाद, बैरल हटा दें और हवा के साथ भरें। सुई में प्रति बैरल डालें और ट्यूब और धीरे हवा के माध्यम से आगे बढ़ाने के द्वारा अंदर से micropipette सूखी।
  5. स्टोर गाइड ट्यूबों, विस्तारित इलेक्ट्रोड और micropipette एंजाइम समाधान में डूबे सूखने से बचने के साथ ही जैविक सामग्री का टूटना सुनिश्चित करने के लिए।

Representative Results

चित्रा 2 स्थानिक ध्यान कार्य बंदर प्रदर्शन किया जबकि इंजेक्शन प्रक्रिया आयोजित किया गया दर्शाया गया है। बंदर या तो दर्ज न्यूरॉन के ग्रहणशील क्षेत्र के भीतर स्थित प्रोत्साहन के लिए भाग लेने (भाग लेने में), ग्रहणशील क्षेत्र के बाहर स्थित प्रोत्साहन के लिए प्रशिक्षित किया गया था (भाग लेने के बाहर) या निर्धारण बिंदु (भाग लेने-फिक्स)। इन हालात अलग attentional राज्यों में neuronal गतिविधि की तुलना अनुमति देते हैं।

चित्रा 3 एक प्रयोग scopolamine, एक मस्करीनिक कोलीनर्जिक प्रतिपक्षी का उपयोग करने में एक नमूना न्यूरॉन के एक पेरी प्रोत्साहन समय हिस्टोग्राम से पता चलता है। भूखंड कोई इंजेक्शन, जब एक पैटर्न सेल के पसंदीदा दिशा में आगे बढ़ न्यूरॉन के ग्रहणशील क्षेत्र के अंदर प्रस्तुत किया जाता है और जानवर ने भाग लिया है बनाम scopolamine इंजेक्शन के दौरान प्रतिक्रिया दमन को दर्शाता है। पहले दो चोटियों न्यूरॉन का प्रतिनिधित्व9 की राशि पर प्रतिक्रिया करने के लिए और स्थानिक क्यू है, जो अपनी ग्रहणशील क्षेत्र के अंदर प्रतीत होता है की ऑफसेट। इस चलते पैटर्न जो 500 एमएस क्यू शुरू होने के बाद स्क्रीन पर दिखाई देता है के जवाब के बाद है। ग्रे छायांकित क्षेत्र हर परीक्षण के लिए औसत फायरिंग दर की गणना करने के लिए इस्तेमाल अवधि विश्लेषण दर्शाया गया है। हरित क्षेत्र सेल की फायरिंग दर पर scopolamine इंजेक्शन की दमनकारी प्रभाव पर प्रकाश डाला गया। गहरे हरे रंग क्षेत्र विश्लेषण अवधि के भीतर दमन से पता चलता है।

चित्रा -4 ए तीन attentional शर्तों में से प्रत्येक में नमूना न्यूरॉन की औसत फायरिंग दर पर scopolamine के प्रभाव को दर्शाता है। न्यूरॉन के दो स्थानिक ध्यान स्थितियों के लिए फायरिंग दर (अंदर या रिकॉर्डिंग न्यूरॉन के ग्रहणशील क्षेत्र के बाहर ध्यान) के साथ ही के लिए संवेदी हालत (निर्धारण बिंदु पर ध्यान) इंजेक्शन ब्लॉक का पहला इंजेक्शन (ग्रे छायांकित के बाद शीघ्र ही गिरा रहेक) और इंजेक्शन के रूप में पहले ही स्तर के लिए एक देरी के बाद वृद्धि हुई वसूली ब्लॉक के दौरान।

चित्रा 4 बी एक नियंत्रण एक दूसरा नमूना न्यूरॉन से रिकॉर्डिंग में जो खारा (0.9% NaCl) इंजेक्ट किया गया था, scopolamine इंजेक्शन के लिए के रूप में ही प्रोटोकॉल का उपयोग पता चलता है। इंजेक्शन के दौरान ब्लॉक न्यूरॉन की फायरिंग दर में कोई परिवर्तन नियंत्रण ब्लॉक की तुलना में मनाया गया।

आकृति 1
चित्रा 1. सेट-अप, जबकि रिकॉर्डिंग औषधीय हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया। (ए) microinjection पंप और इलेक्ट्रोड और micropipette के साथ सुसज्जित electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रणाली दर्शाया गया है। guidetube अंतर है, जो सिलिकॉन तेल में इलेक्ट्रोड और micropipette चिकना करने के लिए डाला जाता है, बढ़े हुए दिखाया गया है। (बी) के एक उदाहरण के micropipette प्रदर्शित करता है (ऊपर)और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (नीचे)। आकार तुलना के लिए, एक यूरो प्रतिशत (व्यास: 16 मिमी)। के नीचे रखा जाता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. टास्क डिजाइन स्थानिक ध्यान मार्गदर्शन करने के लिए। बंदर cued डॉट पैटर्न में एक प्रस्ताव दिशा परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रशिक्षित किया गया। (भाग लेने में) क्यू या तो न्यूरॉन के ग्रहणशील क्षेत्र के भीतर रखा गया था, के रूप में चित्र में दिखाया गया है, या यह के बाहर (भाग लेने-आउट)। एक संवेदी नियंत्रण के रूप में, बंदर निर्धारण बिंदु के एक luminance परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रशिक्षित किया गया था (भाग लेने-फिक्स)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3. दर पर फायरिंग प्रतिपक्षी scopolamine का प्रभाव। एक नमूना न्यूरॉन के लिए पेरी प्रोत्साहन समय हिस्टोग्राम में भाग लेने में हालत इंजेक्शन ब्लॉक के दौरान और नियंत्रण ब्लॉक के दौरान (दर्ज न्यूरॉन के ग्रहणशील क्षेत्र के अंदर ध्यान) के लिए दिखाया गया है। एक्स अक्ष क्यू शुरुआत और y अक्ष के बाद मिलीसेकेंड में समय को दर्शाया गया है spikes में फायरिंग दर / सेकंड से पता चलता है। ग्रे क्षेत्र विश्लेषण अवधि (प्रोत्साहन शुरुआत के बाद 300-800 एमएस) परीक्षण औसतन फायरिंग की दर की गणना करने के लिए इस्तेमाल दर्शाया गया है। हरी छायांकित क्षेत्र दो शर्तों के पार दर फायरिंग में दमन पता चलता है। गहरे हरे रंग विश्लेषण अवधि के भीतर दमन प्रकाश डाला गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4. scopolamine और फायरिंग दर पर खारा का प्रभाव। (ए) विरोधी scopolamine इंजेक्शन। परीक्षण औसतन प्रयोग के पाठ्यक्रम पर चित्रा 3 से नमूना सेल की फायरिंग दर सभी तीन attentional की स्थिति के लिए पसंदीदा प्रोत्साहन के लिए दिखाया गया है। एक्स अक्ष मिनट में परीक्षण शुरू करने का समय दर्शाया गया है और y अक्ष सेकंड प्रति यूनिट के spikes में फायरिंग दर से पता चलता है। चिह्न ( प्लस में शामिल, वृत्त भाग लेने के लिए तय, Trianle भाग लेने के बाहर) हर सफलतापूर्वक प्रदर्शन परीक्षण में विश्लेषण अवधि के भीतर न्यूरॉन की फायरिंग दर प्रतिनिधित्व करते हैं, और क्षैतिज लाइनों (ठोस लाइन: भाग लेने में, बिंदीदार रेखा: भाग लेने ठीक है, धराशायी लाइन: भाग लेने के आउट) के लिए औसत फायरिंग दर दिखाने तीन अलग-अलग प्रयोगात्मक बीएलocks (नियंत्रण, इंजेक्शन, वसूली)। ग्रे छायांकित क्षेत्र, इंजेक्शन ब्लॉक से पता चलता पहले इंजेक्शन के साथ शुरुआत की है और पिछले इंजेक्शन के बाद 1 मिनट समाप्त। इंजेक्शन के दौरान ब्लॉक 2 नाथन 0.1 दाढ़ scopolamine के 2 nl / s का एक इंजेक्शन वेग के साथ हर पल का इंजेक्शन थे। (बी) खारा इंजेक्शन। नियंत्रण प्रयोग के पाठ्यक्रम पर एक नमूना सेल की फायरिंग दर सभी तीन attentional की स्थिति के लिए पसंदीदा प्रोत्साहन के लिए दिखाया गया है। ग्रे छायांकित क्षेत्र खारा इंजेक्शन के ब्लॉक visualizes। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ हम विस्तार से बताया है कि कैसे एक "मुस्तैद" दबाव इंजेक्शन सिस्टम के साथ विश्वसनीय और सटीक इंजेक्शन और उच्च गुणवत्ता वाले एक सेल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए। दवा वितरण की इस पद्धति पहले से बंदरों (17 में समीक्षा) से बर्ताव में इस्तेमाल किया गया है, यहाँ प्रस्तुत प्रणाली लाभ, नीचे की समीक्षा की है।

जैसा कि चित्र में सचित्र -4 ए, यहाँ वर्णित प्रणाली के साथ और रिकॉर्डिंग साइट के आसपास के क्षेत्र में प्रत्यक्ष औषधीय इंजेक्शन के बिना एक न्यूरॉन गतिविधि के स्थिर माप प्रदान कर सकते हैं। जैसा कि चित्र 4 बी में दिखाया गया है, एक नियंत्रण पदार्थ, खारा के इंजेक्शन, दर फायरिंग में एक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व नहीं किया था। यह नियंत्रण दर्शाता है कि इंजेक्शन प्रक्रिया में ही दर्ज न्यूरॉन्स की फायरिंग संपत्तियों पर कोई औसत दर्जे का प्रभाव है।

न्यूरॉन, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, और micropipette के स्थानिक विन्यास महत्वपूर्ण है की इन प्रयोगों में महत्व। हालांकि रिकॉर्डिंग के दौरान ऊतकों में उनके रिश्तेदार पदों की एक सटीक माप संभव नहीं है, हम समझते हैं और विचरण के संभावित स्रोतों के लिए नियंत्रण कर सकते हैं। सबसे पहले, मात्रा इंजेक्शन के दौरान वहाँ एक जोखिम है कि ब्याज की न्यूरॉन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से दूर विस्थापित किया जा सकता है, दर्ज संकेतों की स्थिरता प्रभावित हो रहा है। कारण है कि यह पहले और संकेत स्थिरता को सत्यापित करने के लिए इंजेक्शन ब्लॉक के बाद फायरिंग दर की तुलना करने के लिए समझदारी है। दूसरा, रिकॉर्डिंग प्रणाली की गाइड ट्यूब विन्यास इलेक्ट्रोड और micropipette के बीच की दूरी को परिभाषित करता है (जैसे।, गाढ़ा 3-चैनल प्रणाली में 305 माइक्रोन इस प्रयोग में इस्तेमाल किया)। प्रणाली इलेक्ट्रोड और ऊतकों में micropipette की गहराई के लिए सटीक स्थिति नियंत्रण प्रदान करता है, उनके बीच की दूरी को ध्यान से रिकॉर्डिंग (3.5 चरण) से पहले रिश्तेदार गहराई औजार, और रिकॉर्डिंग के दौरान एक आम गहराई में उन्हें रखने के द्वारा कम किया जा सकता है।

ईएनटी "> संभावित सीमाएं
निर्माता द्वारा घर में गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इसके अलावा, सिस्टम प्रयोगशाला की शर्तों के तहत मान्य किया जा करने के लिए, ट्यूब के विभिन्न ब्रांडों के रूप में की जरूरत है, सीरिंज आदि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अलग हो खंडों में अंतर करने के लिए ले जा सकता है। हालांकि प्रणाली प्रयोग में यहाँ दिखाया गया के रूप में बहुत छोटी मात्रा इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इन न्यूनतम मात्रा है कि एक सामान्य प्रयोगशाला वातावरण में व्यावहारिक माप सीमाओं के कारण मान्य किया जा सकता से नीचे हैं। हालांकि, बड़े इंजेक्शन की मात्रा सॉफ्टवेयर परिभाषित मात्रा और मात्रा हार्डवेयर से निकली बीच संबंध अनुमान किया जा सकता है। पारदर्शी ट्यूबों का इस्तेमाल कर रहे हैं, इंजेक्शन प्रक्रिया का एक अतिरिक्त दृश्य की जांच के लिए एक दृश्य मार्कर के विस्थापन को मापने के द्वारा संभव है।

के रूप में micropipette के व्यास से थोड़ा बड़ा है और सामग्री और अधिक नाजुक है प्रणाली में micropipette डालने, इलेक्ट्रोड प्रविष्टि की तुलना में अधिक मांग है। इसके साथ - साथ,micropipette के पिन करने के लिए ट्यूब में शामिल होने को चुनौती देने के रूप में यह micropipette के ऊपरी भाग को तोड़ने के एक उच्च जोखिम जरूरत पर जोर देता है। हालांकि, एक सफलतापूर्वक लोड micropipette के जीवनकाल में कई महीनों, यहां तक ​​कि दैनिक उपयोग के साथ है।

अभ्यास में, हम अभी तक सिस्टम की सफाई के बाद रिकॉर्डिंग के दौरान इंजेक्शन प्रणाली में एक रुकावट का सामना नहीं किया। फिर भी, कोई "ऑनलाइन" की जांच संभव है, और वहाँ एक जोखिम है कि एक भौतिक रुकावट (जैसे micropipette नोक पर ऊतक के रूप में) पदार्थ इंजेक्शन को रोकने सकता है। इसलिए यह इस तरह के आगे के विश्लेषण में केवल उन कोशिकाओं है कि प्रयोग के नियंत्रण और इंजेक्शन ब्लॉकों के बीच फायरिंग दरों में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाने के रूप में शामिल, परंपरागत ढंग से डेटा का विश्लेषण करने के लिए उचित हो सकता है।

उनके छोटे व्यास के बावजूद, microelectrodes और pipettes मस्तिष्क के ऊतकों विस्थापित होंगे और कुछ स्थानीय ऊतकों को नुकसान का कारण बन सकता है। इस मैन्युअल वीं की नोक स्थिति से कम किया जा सकताई गाइड ट्यूबों सिर्फ ड्यूरा मेटर ऊपर। इलेक्ट्रोड तो ड्यूरा घुसना और उनके intactness उनकी impedances ऑनलाइन मापने के द्वारा अनुमान लगाया जाता है। बाद में, micropipette डाला जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग कर, ड्यूरा ऊपर ऊतक का नियमित रूप से हटाने के आगे इलेक्ट्रोड या पिपेट टूटने के जोखिम को कम करने के लिए सिफारिश की है।

वैकल्पिक तरीकों की तुलना
यहां इस्तेमाल किया प्रणाली अन्य दबाव इंजेक्शन प्रणाली की तुलना में स्पष्ट लाभ से पता चलता है। एक मजबूत लाभ micropipette (लगभग 100 माइक्रोन) है, जो अन्य उपलब्ध जांच 17 के आधे आकार है का व्यास है और इसलिए तंत्रिका ऊतकों को नुकसान को कम करता है। पिछले डिजाइन के विपरीत, मौजूदा प्रणाली स्थानिक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और micropipette अलग काम करते हैं। हालांकि अन्य प्रणालियों इलेक्ट्रोड और पिपेट के बीच एक छोटी दूरी प्रदान करते हैं प्रणाली यहाँ वर्णित इलेक्ट्रोड और पिपेट, इस प्रकार permi के स्वतंत्र गहराई में परिवर्तन की अनुमति देता हैएक रिकॉर्डिंग सत्र के भीतर चर रिश्तेदार दूरी tting। महत्वपूर्ण बात, कोई रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता के संबंध में समझौते के रूप में इंजेक्शन प्रणाली की स्थापना की एक रिकॉर्डिंग डिवाइस का एक विस्तार है, किए जाने की जरूरत है। केवल एक micropipette और इस प्रकार एक पदार्थ इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, यह एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया के भीतर कई पदार्थों इंजेक्षन करने के लिए संभव है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, कई micropipettes अलग गाइड ट्यूबों में पिरोया और अलग-अलग इंजेक्शन पंप में मुहिम शुरू की सीरिंज से जुड़ा जा सकता है। अंत में, प्रणाली को नियंत्रित करने के लिए आसान है, के रूप में केवल एक कंप्यूटर प्रोग्राम इलेक्ट्रोड और micropipette अग्रिम करने के लिए, और प्रयोग के दौरान दबाव इंजेक्शन प्रदर्शन करने की जरूरत है।

योणोगिनेसिस करने के लिए दबाव इंजेक्शन की तुलना में, वहाँ रिश्तेदार फायदे और नुकसान हैं। उदाहरण के लिए, दबाव इंजेक्शन अधिक से अधिक मात्रा, योणोगिनेसिस से ऊतक में पेश होने के लिए इस प्रकार न्यूरोनल विस्थापन का खतरा बढ़ आवश्यकता है। वर्तमान आद्यकर्नल नाथन रेंज में मात्रा में प्रयोग किया जाता है, और हम शायद ही कभी एक दर्ज सेल के संकेत गुणवत्ता में उल्लेखनीय परिवर्तन का अनुभव किया। इस प्रणाली को भी अनुमति देता बड़ी मात्रा में इंजेक्शन जा, जो व्यवहार जोड़तोड़ के लिए संभावित रूप से उपयोगी है, लेकिन न्यूरोनल रिकॉर्डिंग की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है। योणोगिनेसिस पर दबाव इंजेक्शन की एक स्पष्ट लाभ के रूप में वहाँ का आरोप लगाया पदार्थों का उपयोग करने की कोई आवश्यकता नहीं है useable पदार्थों की बड़ी विविधता है। हालांकि, पीएच मान जाँच की जानी चाहिए और प्रयोगात्मक और नियंत्रण पदार्थों के बीच तुलना में (जैसे।, खारा)।

सवाल पैदा हो सकता है क्यों तंत्रिका गतिविधि से छेड़छाड़ के लिए इस तरह के optogenetics के रूप में नए तकनीक के बजाय दबाव इंजेक्शन की लंबे समय से स्थापित विधि का उपयोग करने के लिए। हालांकि अच्छी तरह से कृन्तकों में स्थापित, optogenetics अभी तक मज़बूती से रीसस बंदरों में स्थापित नहीं है। विशेष रूप से, यह अभी तक एक विशेष प्रकार के लिए न्यूरोट्रांसमीटर चयनात्मक कोशिकाओं के स्थानीय हेरफेर की अनुमति नहीं है। लंबी दौड़ में, हम देखते हैंसंज्ञानात्मक कार्यों के तंत्रिका आधार elucidating में optogentic जोड़तोड़ के फायदे के साथ औषधीय जोड़तोड़ के फायदे के संयोजन के लिए काफी संभावना।

यहाँ हम दिखाया है कि कैसे दबाव इंजेक्शन रीसस बंदरों बर्ताव, औषधीय जाग के दिमाग में एक स्थानीय स्तर पर प्रतिबंधित क्षेत्र में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमें उम्मीद है कि इस विधि के अन्य वैज्ञानिकों को प्रेरित करती है neuronal गतिविधि की गतिशीलता के लिए neuromodulatory योगदान की जांच करने के लिए।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र 889 "सेलुलर तंत्र संवेदी प्रसंस्करण के" अनुसूचित जनजाति के लिए (परियोजना C04) के माध्यम से ड्यूश Forschungsgemeinschaft का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। हम, जर्मन प्राइमेट सेंटर, डॉ Katharina Debowski और अन्ना Magerhans के स्टेम सेल यूनिट में सिना Plümer, Leonore Burchardt, डिर्क Prüsse, क्लाउस हेइसिग और तकनीकी और पशु से संबंधित समर्थन के लिए राल्फ Brockhausen और हमारे सहयोगियों को धन्यवाद में तकनीकी सहायता के लिए निस्पंदन प्रक्रिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Scopolamine hydrochloride Sigma-Aldrich 55-16-3 Mr 339.81 g/mol
NaCl 0.9%  B. Braun Melsungen AG 3079870 5ml 
Terg-a-zyme Sigma-Aldrich Z273287 enzyme detergen
Hydrogen peroxide Roth Used in 3% solution with deionized water
Ethanol Chemie-Vertieb Hannover 104642 70%
Deionized water
Injekt 40 Duo B. Braun Melsungen AG 9166432V Syringe and needle 
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber Eppendorf 0030 120.191 1,5ml 
Quarzglass micropipette Thomas Recording
Recording electrode Thomas Recording quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ  and 0.3-0.5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch Saint-Gobain Performance Plastics  3702003  Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm)
Loctite 401 Henkel 233641 Superglue
Silicon oil Thomas Recording M-1000
Minisart RC15 Sartorius 17761----------R Syringe filter
Multichannel Micro Injection System Thomas Recording multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump
McLab custom internal lab software to control stimulus presentation

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References

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