A Magnetic Microbead Oclusión Modelo para inducir hipertensión ocular dependiente de glaucoma en ratones

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Summary

Aquí, se presenta un protocolo para inducir hipertensión ocular en el ojo murino que resulta en la pérdida de células ganglionares de la retina tal como se observa en el glaucoma. microperlas magnéticas se inyectan en la cámara anterior y atraídos por el ángulo iridocorneal usando un imán para bloquear el flujo de salida del humor acuoso.

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Ito, Y. A., Belforte, N., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice. J. Vis. Exp. (109), e53731, doi:10.3791/53731 (2016).

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Abstract

El uso de modelos de roedores de glaucoma ha sido esencial para comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la fisiopatología de esta enfermedad neurodegenerativa multifactorial. Con la llegada de numerosas líneas de ratones transgénicos, hay un creciente interés en modelos murinos inducible de la hipertensión ocular. A continuación, presentamos un modelo de oclusión de glaucoma basado en la inyección de microperlas magnéticas en la cámara anterior del ojo usando una microaguja modificado con un bisel facetado. Las microperlas magnéticas son atraídos por el ángulo iridocorneal usando un imán de mano para bloquear el drenaje de humor acuoso de la cámara anterior. Esta alteración en la dinámica de resultados acuosas en una elevación constante de la presión intraocular, que posteriormente conduce a la pérdida de células ganglionares de la retina, como se observa en los pacientes con glaucoma humanos. El modelo microbead oclusión se presenta en este manuscrito es simple en comparación con otros modelos inducibles de glaucoma y también altamenteeficaz y reproducible. Es importante destacar que las modificaciones que se presentan aquí a minimizar los problemas comunes que surgen a menudo en los modelos de oclusión. En primer lugar, el uso de una microaguja de vidrio biselado evita el reflujo de microperlas y asegura que se produce el mínimo daño a la córnea durante la inyección, reduciendo así los efectos relacionados con la lesión. En segundo lugar, el uso de microperlas magnéticas asegura la capacidad de atraer la mayoría de perlas al ángulo iridocorneal, reduciendo efectivamente el número de perlas flotantes en la cámara anterior evitando el contacto con otras estructuras (por ejemplo., Iris, cristalino). Por último, el uso de un imán de mano permite flexibilidad al manipular el ojo pequeño ratón para dirigir eficientemente las microperlas magnéticas y asegurarse de que hay poco de reflujo de las microperlas de los ojos cuando se retira la microaguja. En resumen, la oclusión modelo de ratón de microperlas que aquí se presenta es una herramienta de investigación de gran alcance para estudiar los cambios neurodegenerativos que se producen durante el inicio y la progresión de glaucoma.

Introduction

El glaucoma es una enfermedad progresiva e irreversible cegadora que afectará a un estimado de 80 millones de personas en todo el mundo para el año 2020 1. En los pacientes con glaucoma, pérdida de la visión es causada por la muerte selectiva de las células ganglionares de la retina (CGR), las neuronas de salida que transmiten la información visual del retina al cerebro. El glaucoma es una enfermedad neurodegenerativa asociada a la edad con muchos factores de riesgo de los cuales el más común es la presión intraocular (PIO) elevada. De hecho, la PIO es el único factor de riesgo modificable en el glaucoma y los tratamientos actuales se centran exclusivamente en la gestión de la presión ocular. Sin embargo, múltiples factores genéticos, celulares y ambientales afectan a la aparición y progresión de esta enfermedad. Por lo tanto, la comprensión de los diversos mecanismos que contribuyen en última instancia, a la muerte neuronal es esencial para desarrollar tratamientos efectivos para el glaucoma.

Los modelos animales de glaucoma son esenciales para estudiar la fisiopatología de la enfermedad y para identificar y pruebaterapias prometedoras. La creciente disponibilidad de líneas de ratones transgénicos que incluyen cepas de ratones knock-out condicionales y que llevan los marcadores fluorescentes codificadas genéticamente ha impulsado la necesidad de modelos murinos con glaucoma inducibles. Varios modelos de roedores de glaucoma se han desarrollado durante los años (revisado en 2,3). En muchos de estos modelos, el glaucoma se induce mediante la interrupción de la dinámica del humor acuoso, lo que resulta en la elevación de la PIO. Modelos de oclusión, en el que se inyectan microperlas u otras sustancias en la cámara anterior del ojo para bloquear el drenaje acuoso, han ganado popularidad en los últimos años, en parte debido a su relativa facilidad para aumentar la IOP 4-14.

El modelo de microperlas oclusión de glaucoma, llevado a cabo primero en primates 12, conejos y ratas 8, 4,9,11, fue adaptado recientemente para su uso en ratones 5,6,10. En estos estudios, la inyección intracameral de microperlas de poliestireno, solo o encombinación con un material viscoelástico, dio lugar a elevación de la PIO que conduce a la posterior muerte de CGR 6,10. Sin embargo, el reflujo cuando la aguja se retira del ojo y se salga de microperlas a partir del ángulo iridocorneal son problemas comunes que surgen durante el procedimiento. Para reducir al mínimo estos inconvenientes, los imanes se han utilizado para atraer las microperlas magnéticas para el ángulo iridocorneal del ojo 4,9.

El protocolo se describe aquí es un procedimiento modificado basado en estudios previos 9,10 que utilizan microperlas magnéticas y un imán de mano adaptado para el ojo de ratón (Figura 1). Varias modificaciones importantes se han introducido en el protocolo para asegurar aumento de la PIO eficaz y reproducible en ratones. En primer lugar, la inyección de microperlas se hace usando una microaguja de vidrio cuidadosamente preparada con un bisel facetado. Las superficies lisas resultantes de la microaguja, así como su punta afilada se asegura de que un daño mínimo esinfligido ya que perfora la córnea. El uso de este microaguja de vidrio también se traduce en un mayor control cuando la punta de microagujas entra en la cámara anterior, reduciendo así el riesgo de las estructuras cercanas perjudiciales tales como el iris y la lente. Además, la pequeña lesión inyección facilita la auto-reparación de la córnea y reduce los efectos no deseados relacionados con la lesión.

En segundo lugar, la inyección de microperlas magnéticas y el uso de un imán de mano permiten un control preciso para atraer a las perlas para el ángulo iridocorneal en el ojo pequeño ratón. microperlas magnéticas que son 4,5 m de diámetro se utilizaron porque este tamaño de microperlas no obstruye la abertura de microagujas preparado y lo más importante, una vez inyectado, estas microperlas bloquearon eficazmente el drenaje del humor acuoso. Este enfoque no sólo reduce el reflujo de las microperlas inyectados, pero también asegura que un número máximo de microperlas se acumula en el área de destino para bloquear efectivamente el drenaje del humor acuoso. Furthermore, esta estrategia también reduce el número de cuentas que flotan en la cámara anterior evitando el contacto con otras estructuras, tales como el iris y la lente, y el paso de la prevención a la cámara posterior. En conjunto, estas modificaciones aseguran que la cirugía de inyección de microperlas se lleva a cabo con relativa facilidad y de una manera oportuna que resulta en una inducción altamente reproducible, eficaz y sostenida de la hipertensión ocular en ratones.

Protocol

El siguiente procedimiento se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales para el Uso de Animales Experimentales y de la Declaración para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visual de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO).

1. Preparación de la microaguja para anterior intracameral Inyección

  1. Con un extractor, generar una microaguja a partir de un capilar de vidrio de borosilicato
  2. Bajo el microscopio, utilizar una hoja afilada cuidadosamente para crear una abertura en la punta de la microaguja. La apertura resultante debe tener una forma elíptica con un diámetro mayor y eje menor de aproximadamente 190 micras y 70 micras, respectivamente. Medir el área de la abertura de microagujas preparado por primeras imágenes que adquieren con una regla colocada bajo el microscopio seguido por la cuantificación usando software de análisis de imágenes.
  3. En el sistema de biselado micropipeta, coloque la microaguja en un 20 degree ángulo respecto a la placa de biselado de manera que la abertura de microagujas está en contacto con la placa. Bevel durante aproximadamente 10 min hasta que los bordes son plana y lisa. Añadir unas cuantas gotas de agua destilada para ayudar en el proceso.
  4. Girar la microaguja para biselar los dos bordes que rodean la abertura hasta que la punta está afilada.
  5. Limpiar toda la suciedad y el agua de la abertura de la punta de microagujas usando un plumero de aerosol.
  6. Examine cuidadosamente la microaguja acabada con un microscopio. microagujas de descarte con fracturas para reducir al mínimo el riesgo de que se rompa durante la cirugía de microagujas.
  7. Esterilizar la microaguja enjuagando primero con etanol, luego con solución salina equilibrada estéril (BSS).

2. Preparación de la solución Microbead Magnética

Nota: Las microperlas magnéticas utilizadas en este estudio se recubren con grupos epoxi. Para evitar los efectos adversos, tales como la aglutinación de las perlas y las interacciones moleculares deseados, estos grupos epoxi debeprimero ser retirado de las microperlas antes de proceder con la cirugía de la inyección.

  1. La eliminación de los grupos epoxi de perlas magnéticas
    1. Preparar una solución de hidróxido de sodio 0,02 M (NaOH, MW 39.997 g / mol) en 10x tampón Tris (MW 121.14 g / mol).
    2. Vórtice suavemente el stock de solución microbead magnética (4,5 m de diámetro, 4 x 10 8 perlas / ml) hasta que las perlas se suspendieron de manera uniforme en la solución.
    3. pipetear rápidamente 1 ml de solución de perlas magnéticas en 50 ml de NaOH 0,02 M en tampón 10x Tris.
    4. Rotar durante 24 horas a RT para eliminar los grupos epoxi de las perlas.
    5. Recoger las perlas asegurando un imán a la parte inferior del tubo. Oriente el tubo horizontalmente para asegurar que todos los granos son atraídos por el imán. Gire durante 4 horas adicionales a temperatura ambiente.
    6. Con una micropipeta, retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento de perlas.
    7. vórtice suavemente el sedimento en 50 ml de 10x Tris tampón hasta que las cuentas están bien suspendidos.
    8. Repita los pasos 2.1.4 a 2.1.6.
  2. La concentración y la resuspensión de las microperlas magnéticas en solución salina equilibrada estéril

Nota: Es necesario concentrar el stock de solución de perlas magnéticas en solución salina equilibrada estéril (BSS) para alcanzar una concentración final de 1,6 x 10 6 perlas / l de modo que 2,4 x 10 6 perlas pueden ser inyectados en la cámara anterior en una volumen final de 1,5 l, que es apropiado para el ojo pequeño ratón.

  1. Lavar las perlas en 5 ml de agua ultra pura de grado de laboratorio mediante agitación suave durante 2 min.
  2. Recoger las perlas por atraer a la parte inferior del tubo con un imán.
  3. Con una micropipeta, retirar con cuidado el agua sin alterar el sedimento de perlas.
  4. Repita los pasos 2.2.1 a 2.2.3 tres veces más.
  5. En una campana de flujo laminar, lavar las perlas con 500 l de NBS por pipetting arriba y hacia abajo. Realice los pasos restantes de esta sección en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.
  6. Recoger las perlas por atraer a la parte inferior del tubo con un imán.
  7. Con una micropipeta, retirar con cuidado el BSS sin perturbar el sedimento de perlas.
  8. Repita los pasos 2.2.5 a 2.2.7 tres veces más.
  9. Volver a suspender pipeteando las cuentas arriba y hacia abajo en 250 l de BSS.
  10. Asegúrese de que la solución de bolas está bien homogeneizada. Entonces, rápidamente alícuota de 25 l de la suspensión en recipientes estériles de tubos de 0,5 ml. La concentración final de la solución madre de perlas es de 1,6 x 10 6 perlas / l.
  11. Almacenar a 4 ° C.

3. La inducción de la hipertensión ocular

Nota: La sección 3 es una operación de dos personas. En el caso de que una acción específica debe ser realizada por una persona específica, se identifica a la persona adecuada. En general, la Persona 1 maneja el ratón bajo el microscopio, mientras que la Persona 2 es responsable para manipular la bomba microjeringa. La duración total del procedimiento quirúrgico debe ser inferior a 10 min (pasos 3.9 a 3.17).

  1. Realizar procedimientos en ratones C57BL / 6 adultos. Los ratones domésticos en un entorno estándar con acceso a comida y agua ad libitum. En este papel, utilice la hembra C57BL / 6 ratones de entre 3 y 4,5 meses de edad. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar a los machos y ratones de diferentes edades, así como otras cepas de ratón, incluyendo ratones transgénicos y knockout.
  2. Medir la PIO basal en ratones despiertos antes de la inyección de anestesia y microbead utilizando un tonómetro de rebote calibrado. Aplicar una gota de clorhidrato de proparacaína en la córnea.
    1. frenar suavemente el ratón mediante la celebración de la piel entre las orejas. Coloque el ratón en la mesa de trabajo de modo que el animal está cómodo y los ojos son accesibles. Mantenga el tonómetro perpendicular a la superficie de la córnea y tomar al menos tres series de diez lecturas consecutivas por cada ojo para obtener unala media de la PIO. Se prefiere la medición de la PIO en ratones despiertos para eludir los efectos relacionados con la anestesia en la PIO. Alternativamente, se puede medir IOP en ratones anestesiada después de la etapa 3.4.
  3. Preparar una mezcla de anestesia cóctel stock ratón compuesta de 20 mg / ml de ketamina, 2 mg / ml de xilazina y 0,4 mg / ml de acepromazina.
  4. Inducir la anestesia en el ratón mediante la administración intraperitoneal de la mezcla de cóctel (1 l / g de peso corporal). El uso de un cóctel anestésico inyectable se prefiere sobre los anestésicos de gas (por ejemplo, isoflurano), ya que permite flexibilidad al manipular la cabeza de ratón como el animal no está conectado a una máscara de inhalación. Además, el periodo de recuperación más largo requerido con un anestésico inyectable se asegura de que las microperlas se depositan en el ángulo iridocorneal sin desplazar de nuevo en la cámara anterior.
  5. Administrar 0,05 mg por kg de peso corporal por vía subcutánea de buprenorfina.
  6. Tratar el ojo con una ey tropicamidae soltar para inducir dilatación de la pupila. Debido al tamaño pequeño de la cámara anterior murino, el alumno debe ser dilatado para visualizar fácilmente el posicionamiento y el avance de la microaguja durante la inyección.
  7. Aplicar la pomada tópica en el ojo contralateral (no operada) para evitar la desecación de la córnea durante el procedimiento.
  8. Adjuntar una microaguja limpia para el conjunto de inyección de la bomba microjeringa. Vuelva a colocar la microaguja después de cada operación para evitar la contaminación cruzada de los animales.
  9. Persona 1: Transferir el ratón anestesiado a la plataforma operativa. Bajo el microscopio, asegúrese de que la pupila está completamente dilatado y que los músculos oculares están relajados de modo que no hay movimiento del ojo. La ausencia de movimientos oculares asegura la estabilidad durante la inyección. limpie con cuidado el colirio de tropicamida del ojo utilizando hisopos absorbentes.
  10. Persona 2: Mezclar la solución microbead magnética pipeta hacia arriba y hacia abajo.
  11. El uso de la bomba microjeringa, cargar inmediatamente el microneedle (preparado en el apartado 1) con 1,5 l de la solución homogeneizada microbead magnética (2,4 x 10 6 bolas). Asegurarse de que las burbujas de aire están ausentes en la punta de la microaguja. Una vez cargado el microagujas, realice los pasos 3.12 a 3.13 lo más rápido posible para que la solución microbead magnética permanece en una suspensión homogénea.
  12. Coloque la microaguja cargado en un ángulo de 45 °, colocado en sentido anterior con relación al limbo. Persona 1: apoyar el ojo con unas pinzas de plástico. Asegúrese de que el ángulo entre la microaguja y las pinzas de plástico es de aproximadamente 90 °.
  13. Persona 2: Con la microaguja cargado, perfore suavemente la córnea de modo que la punta de la microaguja penetra en la cámara anterior. Asegúrese de que la microaguja cargado se mantiene en un ángulo de 45 ° con relación al limbo durante la punción. Evitar cualquier contacto con la lente o el iris. Asegúrese de que la microaguja no entra en la cámara posterior. Persona 1: continúan apoyando el ojoutilizando pinzas de plástico.
  14. Persona 1: Sin mover la cabeza de ratón, coloque el imán al lado del ojo, frente a la punta de microagujas, para atraer a las perlas magnéticas en la cámara anterior y minimizar el contacto de las perlas con la superficie interior de la córnea. Persona 2: El uso de la bomba Inyectar 1,5 l de la solución de perlas magnéticas en la cámara anterior. La solución de microperlas se inyecta durante un periodo de 15 a 30 seg. Persona 1: Continúe sujetando el imán opuesto a la punta de microagujas durante toda la duración de la inyección.
  15. Persona 2: Una vez que se ha inyectado el volumen total de cuentas, retirar lentamente la microaguja del ojo. Persona 1: Para evitar el reflujo de las microperlas, siguen atrayendo a las perlas magnéticas hacia la cámara anterior manteniendo el imán al lado del ojo de un adicional de 30 a 60 seg.
  16. Persona 1: Usando el imán, atrae a las cuentas del ángulo iridocorneal. Asegúrese de que los granos forman un anillo uniformemente distribuidaalrededor de la circunferencia de la cámara anterior. Durante este paso, evitar atraer perlas a la córnea, ya que tienen una tendencia a pegarse a la superficie interior de la córnea tras el contacto.
  17. Se trata el ojo operado con un colirio antibiótico para minimizar el riesgo de infección.
  18. Deje que el ratón para recuperarse de una almohadilla de calor hasta que esté completamente despierto (~ 3 a 4 horas). Coloque el ratón de modo que el ojo operado esté orientado hacia arriba. Este posicionamiento evitará la acumulación de las perlas inyectados a la superficie interior de la córnea por fuerza de gravedad. Además, esta posición disminuirá el potencial de infección como el ojo operado no estará en contacto con la ropa de cama y / o de otros materiales que pueden estar presentes en la jaula. En el caso de que un animal muestra ningún signo de sufrimiento, administrar dosis adicionales de buprenorfina, según sea necesario.
  19. Permitir a los ratones para recuperarse del procedimiento durante al menos 2 días antes de tomar mediciones de la PIO. Medir la PIO como se describe en 3.2. monitor IOP al menos una vez a la semana o con mayor frecuencia, según sea necesario, y, al mismo momento del día para minimizar las fluctuaciones relacionadas con circadianos.
  20. Para mediciones de la PIO, utilizar el ojo contralateral desde el ratón operado como un control interno. Como alternativa, se emplean mediciones de controles intactos, que no son operados o ratones con operación simulada como ingenuos.

4. Evaluación de la célula retiniana de Soma y Axon Supervivencia

  1. Perfundir ratones sometidos a la hipertensión ocular por inyección intracardiaca de la solución de 0,1 M de tampón de fosfato (PBS), seguido inmediatamente por el frío de hielo 4% de paraformaldehído (PFA).
  2. Perfundir ratones intactos, no operados como se describe en 4.1 y utilizarlos como controles no lesionados. No se recomienda el uso de los ojos contralaterales de ratones operados para evaluar la supervivencia de CGR, porque los cambios en los ojos contralaterales después de la lesión se ha informado de 15,16 y pueden confundir la interpretación de los datos. Por otra parte, el uso de los ojos con operación simulada inyectados con 1.5 L de BSS como controles.
  3. El uso de micro tijeras, corte con cuidado el tejido conectivo alrededor del ojo para aislarlo de la cuenca del ojo. Separar el nervio óptico del ojo mediante la reducción en el nivel de la cabeza del nervio óptico.
  4. Usando una aguja G 30, hacer un agujero en la córnea para permitir la penetración de la solución de fijación en el ojo. Coloque el ojo en 4% PFA y se incuba durante 1 hora a 4 ° C para la fijación adicional.
  5. Coloque el nervio óptico en una solución que contiene 2% PFA y 2,5% de glutaraldehído en cacodilato de sodio 0,1 M (MW: 214 g / mol) y se incuba O / N a 4 ° C para la fijación adicional.

5. Las retinas La cuantificación de las CGR Soma densidad sobre el Flat-montados

Nota: El siguiente procedimiento es una adaptación de un protocolo por el Nadal-Nicolas et al 17 y describe la cuantificación de la CGR utilizando un anticuerpo contra el homeobox / POU dominio de la proteína 3A-específica del cerebro (Brn3a) en montajes planos de la retina.. met alternativaSAO para CGR etiquetado también se puede utilizar incluyendo inmunohistoquímica con un anticuerpo contra la proteína de unión al ARN con empalme múltiple (RBPMS) o el etiquetado retrógrada con Fluorogold o DiI.

  1. Bajo un microscopio de disección, retirar la parte anterior del ojo mediante una incisión a lo largo de todo el limbo hasta la córnea se separa fácilmente. Retire la córnea y el cristalino. separar cuidadosamente la retina del ojo, mediante cortes a lo largo de la ora serrata y el nervio óptico.
  2. Preparar un montaje plana de la retina al hacer cuatro pequeñas incisiones equidistantes de la periferia de la retina hacia el nervio óptico para delimitar claramente los cuatro cuadrantes de la retina. El uso de un cepillo pequeño, retire con cuidado vítreo restante de la retina. La extirpación de tanto humor vítreo como sea posible es crucial para obtener una señal de inmunohistoquímica limpia y fuerte.
  3. transferir cuidadosamente la retina a una placa de cultivo de fondo de 48 pocillos plana que contiene 0,5% de Triton X-100 en PBS de manera que la retina esde libre flotación. Asegúrese de que la capa de células ganglionares está orientado hacia arriba.
  4. Coloque la placa de cultivo a -70 ° C durante 15 min. Después de descongelar las retinas, más permeabilizar por lavado dos veces en fresco 2% de Triton X-100 en PBS.
  5. Diluir el anticuerpo Brn3a a 0,3 a 0,5 g / ml con PBS que contenía 2% de Triton X-100 y 2% de suero normal de burro. Incubar la retina en la solución de anticuerpo primario Brn3a agitando suavemente O / N a 4 ° C. Las retinas deben estar completamente inmersos en 150 a 200 l de solución en todo momento.
  6. Diluir el anti-anticuerpo secundario de cabra IgG de burro a 2 mg / ml con PBS que contenía 2% de Triton X-100 y se incuba la retina en esta solución durante 2 horas a RT con agitación suave. La retina debe estar completamente sumergido en la solución de anticuerpo en todo momento. Cubrir la placa de cultivo con papel de aluminio para el resto de pasos para evitar photobleaching.
  7. Usando un cepillo, transferir cuidadosamente la retina a un portaobjetos de modo que el tejido se encuentra tan plano como possible. Deje secar al aire durante 10 minutos. Montar utilizando medio de montaje anti-fade.
  8. Examinar los montajes planos de la retina bajo un microscopio de fluorescencia. Cuantificar el número de CGR Brn3a positivos en tres áreas que no se solapan por cuadrante retiniano como se describe. 18

6. Cuantificación de las CGR axones en el nervio óptico Secciones representativas

  1. Recoger el nervio óptico desde el paso 4.5 y se incuban en un 2% tetróxido de osmio (OsO4, MW 254.23 g / mol) durante 2 horas.
    Precaución: Debido a su alta toxicidad, tetróxido de osmio debe ser manejado en una campana extractora con traje de laboratorio adecuada.
  2. Deshidratar el nervio óptico sumergiéndolo en concentraciones de etanol creciente (50%, 70%, 90%, 95% y 100%) durante 15 minutos cada uno.
  3. Mezclar la resina epoxi usando la siguiente receta: 15.72 ml Insertar-812, 6,45 ml dodecenilo anhídrido succínico, 7,83 ml de anhídrido nádico de metilo, 0,45 ml DMP-30.
  4. Secuencialmente incubar el nervio óptico en soluciones compuestasde las siguientes proporciones de resina epoxi a óxido de propileno (MW 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25, y 1: 0. Se incuba el nervio óptico en cada solución a TA durante una O / N período.
  5. Incubar nervios ópticos embebidos en resina 100% epoxi (último paso de 6,4) a 60 ° C durante una 48 h adicionales.
  6. Generar secciones transversales del nervio óptico semi-delgadas (0,75 m) utilizando un microtomo.
  7. Teñir secciones transversales del nervio óptico con 1% de azul de toluidina.
  8. Cuantificar los axones de CGR en cinco áreas no superpuestas de cada sección del nervio óptico como se ha descrito 19.

Representative Results

La inyección de microperlas magnéticas en la cámara anterior de ratones adultos descritos en este protocolo dio como resultado una elevación robusto y reproducible de la PIO. Una semana después del procedimiento, la PIO aumentó de 10 ± 0,6 mmHg (media ± SEM), la PIO promedio de referencia en los ojos contralaterales, a 19 ± 0,5 mmHg en los ojos hipertensos (prueba t de Student; *** p <0,001, n = 12, Tabla 1, Figura 2). IOP estabilizado a partir de entonces y se mantuvo elevado en un promedio de 20 mm Hg durante al menos 6 semanas, el más largo de tiempo de punto examinado en este estudio. La PIO media de pico en los ojos de microesferas con inyección a los 2, 3, y 6 semanas después de la cirugía fue de 25 mm Hg. La gran mayoría de los ratones tratados desarrollaron una PIO elevada sostenida, por lo tanto, este protocolo no requiere una segunda inyección de microperlas.

Para evaluar el curso de tiempo de la pérdida de RGC en este modelo, RGC soma eranprimera cuantificado por inmunotinción con Brn3a, un marcador de RGC-17 específica. El número de células positivas Brn3a se cuantificó en las retinas montadas en plano a 1, 2, 3 y 6 semanas después de la inducción de la hipertensión ocular. Aunque se detectó una elevación significativa de la PIO tan temprano como 1 semana después de la inyección de microperlas, no se observó pérdida significativa de RGC soma dentro de las primeras 2 semanas del procedimiento (Figura 3). La muerte de CGR sustancial (22%), sin embargo, fue evidente a las 3 semanas (2.430 ± 67 CGR / mm 2, media ± SEM, n = 12) y 6 semanas (2.350 ± 74 CGR / mm 2, n = 10) post- la inducción de la hipertensión ocular, en comparación con el control de los ojos intactos procedentes de ratones no operado (3.141 ± 49 CGR / mm 2, n = 23) (ANOVA, p <0,001).

Disfunción y degeneración de los axones de CGR es una característica cardinal del glaucoma. Por lo tanto, la pérdida axonal se examinó a los 3 y 6 semanas después de la inyección de microperlas porla cuantificación de los axones de CGR en nervio óptico secciones transversales teñidas con azul de toluidina (Figura 4). Se observó una pérdida sustancial de los axones de CGR (25%) a las 3 semanas (28,401 ± 702 axones / nervio, media ± SEM, n = 5) y 6 semanas (29,426 ± 948 axones / nervio, n = 6) después de la inyección de microperlas en comparación con los nervios ópticos de los ojos intactos no operado (39,467 ± 137 / axones del nervio, n = 4) (ANOVA, p <0,001). En conjunto, estos datos demuestran que la inyección de microperlas magnéticas en la cámara anterior del ratón conduce a reproducible y elevación de la PIO que resulta en RGC soma y la degeneración axonal sostenida.

Tiempo después de la cirugía OHT norte La media de la PIO (mmHg) ± SEM Pico de la PIO (mmHg)
contralateral Glaucoma diferenc contralateral Glaucoma
1 semana 12 10 ± 0,4 19 ± 0,5 9 ± 0,6 12 ± 0,4 22 ± 0,6
2 semanas 13 11 ± 0,5 20 ± 0,8 9 ± 0,5 12 ± 0,9 25 ± 0,7
3 semanas 10 11 ± 0,8 20 ± 0,7 10 ± 0,9 13 ± 0,2 25 ± 0,9
6 semanas 12 12 ± 0,5 20 ± 0,6 9 ± 0,7 13 ± 0,5 24 ± 0,6

Tabla 1. La elevación de la presión intraocular en el murino magnética Microbead Occlusien el modelo. En mujeres despierto / 6 ratones C57 BL, la PIO se midió utilizando un tonómetro de rebote calibrado. ojos operados muestran un aumento de la PIO se detecta en una semana después de la cirugía que se mantuvo elevado durante al menos seis semanas después del procedimiento.

Figura 1
Figura 1. Flujo de trabajo de los pasos involucrados en el murino magnética Microbead Oclusión modelo de glaucoma. Esquema paso a paso de todos los procedimientos llevados a cabo antes, durante y después de la cirugía. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Aumento de la presión intraocular en el modelo murino magnética Microbead oclusión. En despiertohembra C57 BL / 6 ratones, la PIO se midió usando un tonómetro de rebote calibrado. Las OIA de ojos inyectados microesferas fueron significativamente elevados en una semana después de la cirugía (ANOVA, p <0,001). Las OIA se mantuvieron significativamente elevados en relación con el ojo contralateral de los ratones inyectados durante al menos 6 semanas (ANOVA, p <0,001). (Intacto: n = 12; 1 semana: n = 12, 2 semanas: n = 13, 3 semanas: n = 10, 6 semanas: n = 12). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. retiniana de la muerte celular en los murinos magnéticos Microbead oclusión del modelo. CGR se visualizaron mediante inmunotinción de retinas montadas planas usando Brn3a en las retinas intactas de control (A) y las retinas glaucomatosos a los 3 y 6 semanas después de la inyección para inducir microbeadhipertensión ocular (OHT) (B, C). Barras de escala: 20 m. (D) Análisis cuantitativo confirmó que la inyección de microperlas como resultado la pérdida significativa soma RGC a los 3 y 6 semanas después del procedimiento en comparación con el control de los ojos. La densidad de CGR, en el soma C57 no glaucomatosa ratones intactos, / BL6 se muestra como referencia (barras blancas, 100% de supervivencia). Los valores se expresan como la media ± SEM (Intacto: n = 23; 1 semana: n = 6, 2 semanas: n = 6, 3 semanas: n = 12, 6 semanas: n = 10, ANOVA, *** p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. axonal degeneración en los murinos axones Magnetic Microbead Oclusión Model. RGC se visualizaron por tinción de nervio óptico secciones transversales con azul de toluidina ende control intacto (A) y retinas glaucomatosos a los 3 y 6 semanas después de la inyección de microperlas para inducir la hipertensión ocular (OHT) (B, C). Barras de escala: 10 m. (D) Análisis cuantitativo confirmó que la inyección de microperlas resultó en una pérdida significativa de axones RGC a los 3 y 6 semanas después del procedimiento en comparación con el control de los ojos. La densidad de los axones de CGR en C57 no glaucomatosa ratones intactos, / BL6 se muestra como referencia (barras blancas, 100% de supervivencia). Los valores se expresan como la media ± SEM (Intacto: n = 4; 3 semanas: n = 5, 6 semanas: n = 6, ANOVA, *** p <0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .

Discussion

La técnica de video presentado aquí proporciona instrucciones detalladas paso a paso sobre cómo realizar la inyección intracameral de microperlas magnéticas para inducir de manera eficaz y reproducible aumento de la PIO en ratones. Este procedimiento resulta en aumento de la PIO sostenida que no requiere inyecciones adicionales y promueve detectable soma RGC y la pérdida de axones dentro de las primeras 3 semanas de la hipertensión ocular induction.Elevated PIO es un factor de riesgo para desarrollar glaucoma en los seres humanos. Por lo tanto, este es un valioso modelo de glaucoma hipertensión dependiente ocular murino que tiene el potencial para una amplia gama de aplicaciones.

Un inconveniente común asociado con la inyección de microperlas en la cámara anterior se refiere a talón de reflujo a través del sitio de la inyección cuando se retira la aguja, que a menudo resulta en solamente una obstrucción parcial del flujo de salida acuoso y aumento de la variabilidad. Para abordar esta cuestión, se llevaron a cabo varias modificaciones importantes. abetos t, la cuidadosa preparación de una, de microagujas de vidrio limpio y afilado con un bisel facetado es esencial para la inyección con éxito de las microperlas. Una microaguja adecuadamente preparado permite la penetración controlada y suave de la córnea con una mínima aplicación de presión a la superficie ocular delicada. La pequeña punción corneal evita el reflujo de microperlas. Además, la multa de microagujas reduce el riesgo de las estructuras cercanas perjudiciales tales como el iris y el cristalino, lo que podría dar lugar a la inflamación no relacionados con la enfermedad. En segundo lugar, la aplicación de un imán de mano a las zonas oculares estratégicos durante y después de la inyección es otro aspecto crítico de esta técnica. Durante la inyección, el imán se utiliza para dibujar las microperlas magnéticas para la cámara de prevención de reflujo anterior de las microperlas cuando se retira la microaguja. Después de la inyección, el imán se utiliza para dirigir las microperlas al ángulo iridocorneal de bloquear la salida del humor acuoso.

tienda "> Otro problema frecuente en los modelos de oclusión de microesferas es que las inyecciones repetidas de talón a menudo son necesarias para lograr un desarrollo sostenido elevación de la PIO 10,11. Esto podría ser el resultado de microperlas desalojando a partir del ángulo iridocorneal con el tiempo. La combinación de un imán de mano, como se describió anteriormente, y el posicionamiento del ratón después de la operación mejora en gran medida el resultado. el uso de los anestésicos inyectables, que permiten flexibilidad para mover la cabeza durante el procedimiento y requiere un periodo de recuperación más largo después de la operación, se ve favorecida. la colocación de la ratón con el ojo operado hacia arriba durante un par de horas después de la cirugía contribuye a la solución de microperlas en el ángulo iridocorneal y disminuye el riesgo de desalojar de nuevo en la cámara anterior.

Asegurarse de que el número de cuentas inyectadas es relativamente consistente es un paso fundamental para minimizar las variaciones entre animales. Dado que las microperlas se depositan en el bottom del tubo, es necesario para homogeneizar completamente la solución de microperlas y retirar el volumen apropiado en la microaguja en una manera oportuna. La inyección de un menor número de granos en la cámara anterior podría resultar en la obstrucción incompleta de las estructuras de drenaje acuosas humor, que es probable que resulte en pobres o variable elevación de la PIO. Es de destacar que, aunque el fin último de la inyección microbead es elevar la PIO, se debe tener cuidado cuando las mediciones de la PIO de los ratones despiertos son más altos que los valores máximos reportados en este estudio (~ 25 mm Hg). Extremadamente altas IOP aumentan el riesgo de daño isquémico y también pueden causar dolor al animal. La elevación de la PIO debe ser considerada como uno de los muchos factores para evaluar el éxito de la cirugía. Como tal, el resultado del procedimiento debe ser calibrada en función de varios parámetros, incluyendo la elevación de la PIO, RGC muerte soma, y ​​la pérdida de axón.

Aunque el protocolo descrito aquí resulta en la mayoría de las microperlas de éxitoLy sedimentación en el ángulo, una limitación potencial de este modelo es que los granos que permanecen flotando en la cámara anterior podrían interferir con la imagen de la retina en vivo a través de la córnea, así como ensayos electrofisiológicos y de comportamiento que requieren el paso eficaz de la luz. Otro aspecto importante a considerar cuando se utiliza este modelo de oclusión microbead es que el grado de elevación de la PIO y la posterior degeneración de RGC varía con la edad y los antecedentes genéticos del ratón operado [4]. Por lo tanto, tendrá que ser determinado para cada línea específica de ratón transgénico y / o rango de edad el grado de elevación de la PIO y la línea de tiempo de la degeneración de las CGR.

Una característica de este modelo es que los resultados de la PIO elevada en la pérdida gradual de la muerte de CGR durante las primeras tres semanas después de la inyección microbead y significativa la muerte de CGR se detecta a las 3 semanas después del procedimiento. Por lo tanto, este modelo permite el examen de los cambios tempranos y / o sutiles que se producen en este dNFERMEDAD, antes de la RGC abierta soma y la pérdida axonal. Un aumento significativo en la muerte de CGR no se observó entre 3 y 6 semanas después de la inducción de la hipertensión ocular. De hecho, RGC soma y axón pérdida se mantuvo estable en ~ 22 - 25% entre 3 y 6 semanas a pesar del éxito y sostenido aumento de la PIO en estos puntos de tiempo. Una mayor duración de la PIO sostenida puede ser necesario para la pérdida adicional RGC a ocurrir en ratones C57BL / 6, que parecen ser más resistentes a los daños RGC en comparación con otras cepas de ratón. 5 modificaciones adicionales al protocolo que se presenta aquí, incluyendo el ajuste de tamaño de las perlas y las inyecciones adicionales, podrían ser necesarias para estudiar la pérdida de RGC en puntos de tiempo posteriores. Por lo tanto, nuestro protocolo es ideal para estudios se centraron en los cambios fisiopatológicos primeros que se correlacionan con la neurodegeneración modesta RGC que son relevantes para inicio y la progresión temprana en el glaucoma humano.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Puller Narishige PC-10
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW150F-4 Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm
Stereo Microscope Zeiss MZ9.5 Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.
Footswitch Linemaster T-91-SE
Stainless Steel Blade Feather No. 11
Microelectrode Beveler Science Products BV-10
Aerosol Duster Fisher 23-022-523
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
Vortex Fisher Scientific 12-812
Dynabeads M-450 Epoxy Life Technologies 14011 Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C.
Mini-Tube Rotators Fisher Scientific 05-450-127
3 Handheld Magnets Geomag 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.
25 ml serological pipet Costar 4489
Pipet Drummond 4-000-101
Biological Containment Hood Biostad 377355
Balanced salt solution (BSS) Alcon 0065-0800-25
P1,000 Micropipet Gilson F123602
Microtube 1.5 ml Sarstedt 72.690
P200 Micropipet Gilson F123601
0.2 ml PCR tube Sarstedt 72737.002
Ketamine Controlled substance
Xylazine Bayer Healthcare
Acepromazine Vetoquinol
U-100 Insulin Syringe Becton Dickinson and Company 329461
Balance Ohaus CS 200
Buprenorphine Controlled substance
Tropicamide ophthalmic solution Alcon 0998-0355-15 1% Mydriacyl
Manual Microsyringe Pump with Digital Display World Precision Instruments DMP
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Platform Fisher Scientific 14-673-52 8 x 8 inch
Absorbent swabs Kettenbach 30601
P20 Micropipet Gilson F123600
Plastic forcep Euroband 1001 Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye
Fluoroquinolone ophthalmic solution Alcon Vigamox
Heating pad Sunbeam E12107-834
Tonometer iCare TV02 TONOLAB rebound tonometer 
Paraformaldehyde, Para Fisher Scientific T353-500
Dissection tools
Small brush
Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich G7651
Sodium Cacodylate, tryhydrate Canemco and Marivec 124-65-2
Brn-3a antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-31984
Tissue Culture Plate, 48 well Falcon 353078
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Life Technologies A-11058
Aluminum foil
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Slow fade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5E
Osmium tetroxide 2% aqueous solution Electron Microscopy Sciences 3294949
Embed-812 Electron Microscopy Sciences 14900
Dodecenyl succinic anhydride Electron Microscopy Sciences 13710
Nadic methyl anhydride Electron Microscopy Sciences 19000
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205-1L
Embedding mold-Dykstra Electron Microscopy Sciences 70907
Porter-Blum ultra-microtome Sorvall MT-2
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) Fisher-Scientific T161-25

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References

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