La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

Chemistry

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Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).

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Abstract

Este protocolo describe las técnicas específicas utilizadas para la caracterización de la reducción final (RE) y la secuencia de glicosilo región interna (s) de heteroxilanos. Paredes celulares del endospermo de trigo De almidonadas-se aislaron como un residuo de alcohol insoluble (AIR) 1 y secuencialmente se extrajo con agua (W-sol Fr) y 1 M KOH conteniendo 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) como se describe por Ratnayake et al. (2014) 2. Se adoptaron dos enfoques diferentes (véase el resumen en la Figura 1). En el primero, intactos AXs W-sol se tratan con 2AB para etiquetar el RE columna vertebral residuo original de azúcar de cadena y luego tratados con una endoxilanasa para generar una mezcla de RE 2AB marcado y la región interna reducir oligosacáridos, respectivamente. En un segundo enfoque, el Fr KOH-sol se hidroliza con endoxilanasa para generar primero una mezcla de oligosacáridos que posteriormente se etiquetan con 2AB. Los liberados enzimáticamente (ONU) (etiquetados) oligosacáridos de ambosW- y los PP KOH-sol son entonces metilado y el análisis estructural detallado tanto de los oligosacáridos nativos y metilados se realiza utilizando una combinación de MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS y ESI-MS n. Endoxilanasa digerido KOH-sol AXs también se caracterizan por resonancia magnética nuclear (RMN), que también proporciona información sobre la configuración anomérica. Estas técnicas se pueden aplicar a otras clases de polisacáridos utilizando las endo-hidrolasas adecuadas.

Introduction

Heteroxilanos son una familia de polisacáridos que son los polisacáridos no celulósicos predominantes de las paredes primarias de gramíneas y las paredes secundarias de todas las angiospermas 3-6. Las cadenas principales de xilano difieren en sus tipos y patrones de sustitución con glicosil (ácido glucurónico (GlcA), arabinosa (Araf)) y los residuos en función del tipo de tejido, el grado de desarrollo y las especies no-glicosil 7 (O-acetilo, ácido ferúlico).

Paredes de trigo (Triticum aestivum L.) endospermo se componen principalmente de arabinoxilanos (AXs) (70%) y (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanos (20%) con cantidades menores de celulosa y heteromannans (2% cada uno) 8. La cadena principal de xilano puede ser diversamente un-sustituido y predominantemente mono-sustituido (principalmente O-2 posición y en menor medida O-3 posición) y (O-2 y O-3 posiciones) con α-L-Ara di-sustituido residuos de F 9. El extremo reductor (RE) de heteroxilanos de dicotiledóneas (por ejemplo, de Arabidopsis thaliana) 10 y gimnospermas (por ejemplo, el abeto (Picea abies)) 11 contiene una secuencia característica tetrasacárido glicosilo; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl p. Para entender la biosíntesis y la función (biológica y industrial) heteroxilano, es importante para secuenciar completamente la columna vertebral de xilano entender los tipos y los patrones de sustituciones, así como la secuencia del extremo reductor (RE).

Las técnicas específicas utilizadas para la caracterización estructural de la reducción final (RE) y la secuencia de glicosilo región interna (s) de heteroxilanos se describen en este manuscrito. Las técnicas se basan en el etiquetado de fluoróforo (con 2 aminobenzamida (2AB)) el extremo reductor (RE) de la cadena heteroxilano antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa). Este enfoque, en particular para la secuenciación RE, eraprimero reportada por el laboratorio York 10,12-13 pero ahora se extiende para incluir la secuenciación región interna y es una combinación de las técnicas establecidas que es igualmente adaptable a todos los heteroxilanos independientemente de su fuente de aislamiento. Este enfoque también se puede aplicar a otras clases de polisacáridos usando (si está disponible) las endo-hidrolasas adecuadas.

En el presente estudio, las paredes de-almidonado celulares del endospermo de trigo se aislaron como un residuo de alcohol insoluble (AIR) y secuencialmente se extrajo con agua (W-sol Fr) y 1 M KOH conteniendo 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) como se describe en Ratnayake et al. (2014) 2. Los oligosacáridos liberados tanto de Frs KOH-sol W- y son entonces metilado y el análisis estructural detallado tanto de los oligosacáridos nativos y metilados se realiza utilizando una combinación de MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-acoplado con HPLC con el separación cromatográfica en línea usando una columna RP C-18y ESI-MS n. Endoxilanasa digerido KOH-sol AXs también se caracterizó por resonancia magnética nuclear (NMR).

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Protocol

1. El etiquetado del extremo reductor (RE) Azúcar Residuo de la W-sol AXs con 2-aminobenzamida (2AB)

  1. Incubar W-sol AXs con 2AB (0,2 M) en presencia de 1 M NaBH 3 CN (cianoborohidruro de sodio) (pH 5,5) durante 2 horas a 65 ° C para convertir los extremos reductores de las cadenas de polisacárido de cadena principal a sus derivados fluorescentes.
    PRECAUCIÓN: El siguiente paso se debe realizar en la campana de humos como NaBH 3 CN libera gas cianuro venenoso cuando está en contacto con el agua.
    1. Pesar NaBH 3 CN (62,8 mg) y disolver en agua (1 ml) en un tubo de microcentrífuga (1,5 ml) para preparar una solución 1 M NaBH 3 CN. Disolver reactivo 2AB (27,2 mg) en una solución 1 M NaBH 3 CN (1 ml) por calentamiento a 65   ° C y ajustar el pH de la mezcla de reacción (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) a pH 5,5 con ácido acético al 10%.
    2. Añadir 200 l de mezcla de reacción (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) para W-sol AXs (1 mg) en un tubo de vidrio con una tapa y se mezclan usando un mezclador de vórtice. Incubar durante 2 horas a 65   ° C en una campana de humos. Se enfría la suspensión a temperatura ambiente y añadir 4 vols. de etanol absoluto.
    3. Coloque la suspensión en un almacenamiento en frío (4 ° C) O / N para precipitar polisacáridos.
    4. Se centrifuga (1.500 xg, 10 min, RT) para eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento extensamente con etanol absoluto (4x), acetona (1 x) y metanol (1 x), centrifugando entre cada lavado. seca al vacío a 40 ° CO / N.
      Nota: Lavado extenso también elimina 2AB residual.

2. Generación de xilo-oligosacáridos de 2 AB Etiqueta W-sol AXs

  1. Disolver 2AB etiquetado W-sol AXs (1 mg) en 500 l de tampón de acetato de sodio (100 mM, pH 5) en un tubo de microcentrífuga (1,5 ml). Añadir 4 unidades de endoxilanasa (GH 11, [M1]) y se incuba a 37   ° C durante 16 horas.
  2. Destruir la actividad de la enzima por calentamiento de las mixto de reacciónUre durante 10 minutos en un baño de agua hirviendo. Se enfría la suspensión a temperatura ambiente y transferir al tubo de vidrio con una tapa. Añadir 4 vols. de etanol absoluto y colocar la suspensión en un almacenamiento en frío (4 ° C) O / N para precipitar cualquier polisacáridos no digeridos.
  3. Se centrifuga (1.500 xg, 10 min, RT) para separar los polisacáridos no digeridos (pellet) y endoxilanasa generado xilo-oligosacáridos (sobrenadante). Decantar el sobrenadante en un tubo de vidrio limpio y colocarlo en un baño de agua caliente (40 ° C).
  4. Se evapora el etanol bajo una corriente de gas nitrógeno a un volumen punto final (~ 500 l). Congelar el sobrenadante a -80 ° C durante 4 horas y se seca el sobrenadante congelado en un liofilizador para recuperar xilo-oligosacáridos.

3. Generación de xilo-oligosacáridos de KOH-sol AXs y Etiquetado 2AB

  1. El tratamiento de KOH-sol AXs con endoxilanasa (GH 11, [M1]) para generar xilo-oligosacáridos como se describió anteriormente (secciones 2.1-2.4).
  2. Tratar a Endoxylanase genera xilo-oligosacáridos de KOH-sol AXs con la mezcla de reacción 2AB (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) como se describió anteriormente (secciones 1.1.1-1.1.2).
  3. Decantar el sobrenadante en un tubo de vidrio limpio y colocarlo en un baño de agua caliente (40 ° C). Se evapora el etanol bajo una corriente de gas nitrógeno a un volumen punto final (~ 500 l). Congelar el sobrenadante a -80 ° C durante 4 horas y se seca el sobrenadante congelado en un liofilizador para recuperar xilo-oligosacáridos.

4. MALDI-TOF-MS

  1. Preparación de la solución matriz de MALDI-
    1. Añadir una pequeña bola de 2, ácido 5-dihydroxbenzoic (DHB) a 50% de acetonitrilo (500 ml) que contenía ácido fórmico al 0,1% en un tubo (solución MALDI-matriz). Mezclar utilizando un vórtice, si se disuelve rápidamente, añadir otra cucharada pequeña de DHB. Nota: concentración ideal de la solución de MALDI-matriz es 10 g / l -1.
  2. Preparación de la placa de MALDI-objetivo
    1. Depositar el aqueonos oligosacáridos muestras (nativas) (5-10 mg) (W-sol y / o KOH-sol) sobre una placa MALDI-objetivo. Añadir la solución matriz de MALDI-0,3 l usando una punta separada y mezclar pipeteando arriba y abajo. Dejar que la mezcla se seque a temperatura ambiente.
      Nota: Las muestras secadas correctamente deben consistir en cristales largos en forma de aguja apuntando hacia el centro de la mancha. Si el depósito es pegajoso y / o smeary la muestra puede ser o bien demasiado concentrada o consiste de sales, tales depósitos son poco probables para producir buena espectros y la muestra debe ser purificados adicionalmente.
    2. Introducir la placa del objetivo en la fuente MS y operar en el modo de ion positivo (+ iva). Ajustar la tensión de acelerador a 19,0 kV en la fuente de iones de 1 y 16,3 kV en la fuente de iones 2. ajustar la potencia de láser para mayor que 70%. Seleccione el punto de la muestra en la placa de MALDI-objetivo y haga clic en inicio para comenzar disparos de láser.
      Nota: Todas las zonas del objetivo no producirán señales. Un punto particular sólo dará una señal por unos disparos de láser, ya sea debido aagotamiento de la mezcla de muestra / matriz o las características del cristal.
      1. Mueva el láser a diferentes áreas del objetivo durante la adquisición y el promedio de aproximadamente 200 espectros aleatorio para obtener señal-ruido satisfactoria.

5. ESI-QTOF-MS

  1. Analizar oligosacáridos generados endoxilanasa-(nativo) usando nano-HPLC junto con una ionización por electrospray (ESI) Tiempo de cuadrupolo de vuelo por instrumentos (QTOF) MS con separación cromatográfica en línea utilizando un RP columna C-18 (75 micras x 150 mm; 3,5 micras del grano tamaño).
    1. Transfiera la mezcla de oligosacáridos acuosas generadas endoxilanasa-en un vial y el lugar en el muestreador automático de HPLC. Programar el gradiente de elución de 5 a 80% con las fases móviles 0,1% (v / v) de ácido fórmico en agua y 0,1% (v / v) de ácido fórmico en acetonitrilo, respectivamente, durante 60 min.
    2. Ajustar la velocidad de flujo de 0,2 l / min. Ajustar el modo de iones positivos en el rango de exploraciónde 300-1,600 m / z y a-velocidad de barrido de 0,5 exploraciones / segundo utilizando las condiciones de la fuente de ESI como sigue: gas cortina 10, GS1 4, temperatura de la fuente 100 ° C, la tensión de pulverización iónica 2.300 V, y de-la agrupación de potencial 50 V. Ejecutar el programa LC cromatográfico y oligosacáridos eluir. El cromatograma de iones totales resultante (TIC) se guarda automáticamente por el software.
    3. Abra el TIC guardado y seleccione cromatograma del extracto. Escriba las masas esperadas (por ejemplo, 271, 403, 535, 667, 799 y 931 m / z) en la línea de comandos. cromatograma de análisis haciendo clic Intro. Procesar las exploraciones de iones seleccionadas de los datos del cromatograma ESI-QTOF MS utilizando el software de acuerdo con las instrucciones del fabricante 14.

6. ESI-MS n

  1. Introduzca 1 a 2 l de oligosacárido per-O-metilado (metilado como se describe por Pettolino et al. 1) de muestra en 50% de acetonitrilo en una punta de nanopulverización usando una jeringa. Recortarla punta nano-pulverización utilizando un cortador de vidrio para encajar en el soporte de nano-aerosol discreto unido a la MS.
  2. Establecer la masa de acuerdo con el rango esperado de masas (200-1,500 m / z) y el gas de cortina a 10, tensión ionspray a 1.900 V y la polaridad de positivo.
  3. Pulse el botón ADQUISICIÓN para abrir la ventana correspondiente, introduzca el nombre del archivo de datos para obtener un escaneo total de iones (ESI-MS 1). A continuación, pulse el botón STOP.
  4. Cambiar el tipo de escaneo de iones producto a fragmentar un pico de interés. Ingrese la masa de interés (por ejemplo, 885 m / z) para fragmentar y ajustar el rango de masa (200-900 m / z). Pulse el botón adquirir y ajustar la energía de colisión (hacia arriba y / o hacia abajo en la pestaña compuesto) para conseguir toda la fragmentación del ion primario (885 m / z) y adquirir una exploración fragmento de iones (ESI-MS 2).
  5. Ingrese la masa del ión fragmento de interés (por ejemplo, 711 m / z) y ajustar el rango de masa (200-720 m / z). Presione el botón de adquirir unad ajustar la energía de colisión para lograr toda la fragmentación del ion precursor (711 m / z) y adquirir una exploración de iones fragmento (ESI-MS 3).

7. H 1 NMR Spectroscopy

  1. Disolver endoxilanasa generada mezcla de oligosacáridos (KOH-sol, forma nativa) (~ 500 g) en D2O (1,0 ml, 99,9%) en un tubo de ensayo de plástico (15 ml). Congelación de la suspensión a -80 ° C durante 4 horas y se seca la suspensión congelada en un liofilizador para recuperar xilo-oligosacáridos.
  2. Repetir dos veces 7.1 con el fin de intercambiar plenamente el H2O con D2O
  3. Disolver oligosacáridos secos en D2O (0,6 ml, 99,9%) y añadir 0,5 l de acetona (5% en D2O) como estándar interno. La transferencia de los oligosacáridos deuterados en el tubo de la muestra de RMN.
  4. Mantenga el tubo que contiene la muestra de RMN por la parte superior e insertar el tubo de muestra en una centrifugadora de plástico. Coloque el control de giro en el medidor de profundidad de la muestra. Push o tire del tubo de muestra para ajustar la profundidad de la muestra para asegurar que la línea central de la parte superior de la muestra y calibres de profundidad inferior son iguales.
  5. Retire el medidor de profundidad e inserte la muestra en el muestreador automático conectado a un espectrómetro de RMN de 600 MHz equipado con un crio-sonda.
  6. Inicio de sesión y el software de control espectrómetro abierta. Introduzca el nombre de archivo de ejemplo. Abrir una base de datos existente y luego utilizar el comando "EDC" para guardarlo con un nuevo nombre. Escriba el número de la posición de la muestra en el muestreador automático y pulse "ENTER".
    Nota: Al pulsar el botón "ENTER" se reducirá el tubo de muestra suavemente a la cavidad del imán donde será colocado en la parte superior de la sonda.
  7. Ajuste la temperatura de la muestra deseada escribiendo "edte" en la línea de comandos. Esperar a que la temperatura de la muestra para llegar al valor deseado antes de proceder al siguiente paso. Enter "bloqueo" en la línea de comandos y seleccione disolvente apropiado (D2O). Esperen al " bloquear mensaje de finalización "para aparecer en la parte inferior de la ventana.
  8. Tipo "ATMM" en la línea de comandos y haga clic en "optimizar" en la parte superior de la barra de menús ATMM. Elija Inicio de ajuste y adaptación de la sonda para el canal seleccionado (1 H en este caso).
  9. Tipo "topshim" en la línea de comandos para el proceso de calce en el que se hacen pequeños ajustes en el campo magnético hasta que el campo magnético uniforme se logra alrededor del sample.Acquire la señal escribiendo "ZG" en la línea de comandos y escriba.
  10. Analizar espectros utilizando el software 15 de acuerdo con las instrucciones del fabricante con 1 desplazamiento químico H hace referencia a un estándar interno de acetona a 2,225 ppm.

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Representative Results

Digestión endoxilanasa de 2AB-etiquetado W-sol AXs genera una mezcla de oligosacáridos RE 2AB marcado y una serie de oligosacáridos un-marcado (sin la etiqueta de 2AB) derivados de las regiones internas de la cadena de xilano (Figura 1; de Ratnayake et al. 2). se emplea luego una serie de enfoques cromatográficas para fraccionar el complejo de mezcla de isómeros. Por último, se utilizan técnicas MS para identificar las estructuras isoméricas que luego se secuenciaron por MS n técnicas. Aquí presentamos un representante, en lugar de integral, ejemplo del enfoque.

Las señales en el espectro de MALDI-TOF-MS de oligosacáridos derivados de 2AB marcada nativa W-sol AXs (Figura 2A) incluyen una serie muy abundante pseudo-molecular de iones a m / z 701, 833, y 965 representa una serie de no marcado neutral internaoligosacáridos región con 5-7 residuos de pentosilo (P 5-7), respectivamente. Una serie de señales a m / z 745, 877, y 1009, designar que una serie oligosacárido ácido no marcado, con P 4-6 + 1 HexA (ácido hexurónico), también está presente en esta fracción (Figura 2A). Los pseudo-iones molecular am / z 821 y 953 indican la presencia de la 2AB-oligosacáridos original etiquetado RE P + 2AB 5-6, respectivamente.

Se lleva a cabo entonces el análisis ESI-QTOF-MS para los oligosacáridos nativos con un fraccionamiento cromatográfico en línea de oligosacáridos por RP C-18 de HPLC. La Figura 2B y 2C, se muestran las exploraciones de iones seleccionados, extraídos de ion total de ESI-QTOF-MS cromatograma (TIC), de oligosacáridos liberados por endoxilanasa de W-sol Fr AXs. Las señales incluyen una serie de iones de pseudo-molecular asignado como [M + NH4] + am/ z 696, 828, 960, 1092, 1224, y 1356 que representa una serie de oligosacáridos neutros región interna con 5-10 residuos de pentosilo (P 5-10), respectivamente (Figura 2B). Varias estructuras isoméricas son posibles para un oligosacárido de una masa definida (véase más adelante ESI-MS n análisis). De ahí los múltiples picos para cada una de las exploraciones de iones moleculares son posibles como se observa en la Figura 2B. Iones Pseudo-molecular asignados como [M + H] + a m / z 271, 403, 535, 667, 799, y 931 indican la presencia de una etiqueta 2AB serie oligosacárido RE P 1-6 + 2AB, respectivamente (Figura 2C) . Las señales detectadas como [M + H] + iones a m / z 613, 745, 877, 1009, 1141, y 1273 indican la presencia de un oligosacáridos ácidos con P 3-8 + HexA 1, respectivamente (Figura 2C). En las monocotiledóneas commelenid, la columna vertebral de xilano también puede estar sustituido con los ácidos fenólicos,principalmente el ácido ferúlico (y también ácido p -coumaric), que tiene la misma masa molecular como el ácido glucurónico y se puede detectar en W-sol AXs de las paredes celulares del endospermo de trigo. Sin embargo, un análisis más detallado de W- y KOH-sol AXs usando ESI-MS n (y de composición analiza por GC-MS de derivados TMS siguiente metanolisis; no se muestra aquí) confirman los oligosacáridos ácidos con P 3-8 + HexA 1 en el endospermo de trigo AXs.

Las señales asignadas como [M + H] + iones de ESI-Q-TOF espectro de barrido completo de la región entre 3,10 a 3,48 min (Figura 2D) incluye la serie de 2AB etiquetado oligosacáridos RE: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063, y 1195 (P 1-8 + 2AB, respectivamente). Una serie de iones seudo-molecular de la ESI-Q-TOF espectro de exploración completa de la región comprendida entre 3,59 a 4,05 min (Figura 2E) representan los oligosacáridos ácidos región interna observand ya que tanto [M + Na] + iones: m / z 613, 745, 877, 1009, y 1141 (P + 3-7 HexA 1, respectivamente) y [M + NH 4] + iones: m / z 740, 872, 1004, 1136, y 1268 (P + 4-8 HexA 1, respectivamente).

Con el fin de secuenciar los oligosacáridos individuales, se realizó ESI-MS n sobre el per-O-metilado oligosacáridos en lo posible los oligosacáridos nativos obtenidos a partir de W-sol y KOH-sol AXs ya que es un reto para asignar de manera inequívoca las estructuras mediante la secuenciación de oligosacáridos nativos . Además, también se requiere una mayor cantidad de material. La metilación de los oligosacáridos se llevó a cabo como se describe por Pettolino et al. 1. El ESI-MS n investigaciones realizadas sobre la re neutro alditoles de oligosacárido derivados de KOH-sol AXs, y 2AB etiquetados de oligosacáridos neutros derivados de RE AXs W-sol se describen Below como un ejemplo para ayudar en la interpretación de los espectros y las estructuras deducidas. El mismo enfoque se puede aplicar a todos los oligosacáridos generados a partir de la hidrólisis enzimática. Los iones de fragmento en la ESI-MS n espectros fueron identificados como los iones Y y B de acuerdo con Domon y Costello. 16 grupo hidroxilo-metilado Un (s) generada durante la fragmentación en fase gaseosa de per-O-metilado oligosacáridos en la EM n proporciona una 14Da diferencia de masa "cicatriz" que se puede utilizar para identificar el patrón de ramificación y las secuencias de glicosilo. 12-13 Cada cicatriz generada por el evento de fragmentación se marca como una línea sólida (Figuras 3 y 4). Como son posibles varias estructuras isoméricas de una masa definida, a continuación, en estas estructuras isoméricas, los iones Y y B son etiquetados en rojo y negro, respectivamente.

El ESI-MS 2, ESI-MS 3 y ESI-MS 4 SPECTra de per-O-metilado RE neutral alditol oligo-glicosil generada a partir de la fragmentación de la pseudo-molecular de iones de m / z 885 (P 4 + ol Xyl) se muestra en la Figura 3. El 2 espectro ESI-MS incluye la abundante Y iones a m / z 711, 551, y 391 generado por la pérdida de uno, dos y tres residuos de pentosilo, respectivamente, desde el ion primario. El abundante m / z 711 ion se puede generar ya sea por la pérdida de un residuo de Xyl extremo terminal no reductor o por la pérdida de un residuo de Ara cadena lateral terminal. El z 391 ion de diagnóstico Y m / en el espectro resultante puede ser generado a partir de la pérdida de tres no reductor residuos Xyl fin desde el oligosacárido RE que tiene un residuo Ara cadena lateral en el residuo ol RE Xyl o el oligosacárido RE que tiene una Ara cadena lateral de residuos en el residuo de Xil del residuo ol RE Xil. Aunque hay una posibilidad formal que otras estructuras, tales comoXil 4 ol -Xyl, y ol (Ara) Xil-Xil-Xil-Xil daría lugar a esta fragmento de ion estas estructuras están excluidos de la consideración como la especificidad de la endo-xilanasa utilizada para escindir el polisacárido que sea degradar o no escindir en el enlace glicosídico adyacente a un punto de ramificación, respectivamente. En correspondencia, la Y de diagnóstico m / z 551 ion se pueden generar a partir de la pérdida de dos no reductor residuos Xyl fin desde el oligosacárido RE que tiene el residuo Ara cadena lateral ya sea en el residuo ol RE Xyl o el oligosacárido RE que tiene el lado Ara cadena de residuos en el residuo Xil penúltima. De este modo, se pueden proponer cuatro posibles estructuras isoméricas (Figura 3: I, II, III y IV). La abundante Y de iones m / z 377 (ver Figura 3: Ia y IIa) y el ion B m / z 503 (véase la Figura 3: Ia, Ib, IVa y IVb) generado a partir de una mayor fragmentación del precursor de m isomérica/ z 711 ion se observan también en este espectro. El ESI-MS 3 espectro (Figura 3) registrada por la fragmentación de la isomérica precursor m / z 711 iones incluye un pico principal en m / z 537 (Y ion de P 2 + Xyl ol con dos cicatrices; generado a partir del precursor de iones Ia , Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb, IVa y IVb) y m / z 391 (y ion de P 1 + Xyl ol con una cicatriz; generado a partir del precursor de iones IIb, IIIa, IIIb, IVa y IVb). Estos dos picos principales (m / z 537 y m / z 391) pueden ser generados por la pérdida de uno y dos no reductor residuos Xyl terminales, respectivamente, a partir del precursor isomérica m / z 711 iones generados a partir de la fragmentación de la seudo ion primario -molecular m / z 885 (P + 4 ol Xil) durante ESI-MS 2. Relativamente más bajos picos de abundancia en m / z 377 (Y ion de P 1 + Xyl ol con dos cicatrices; generado a partir del precursor ion Ia y IIa) y 551 (Y ion de P 2 ol + Xyl con una cicatriz; generado a partir del precursor de iones Ib y IIb) también se observaron en este espectro.

El ESI-MS 4 de la fragmentación de la isomérica precursor m / z 551 iones incluye un pico principal en m / z 377 (Y ion de P 1 + ol Xyl con dos cicatrices) y m / z 391 (Y ion de P 1 + ol Xyl con una cicatriz) generado a partir del ion precursor de las estructuras I y II. Por lo tanto la evidencia colectiva sugirió que la secuencia de RE glicosilo consta de la cadena lateral Ara unido al residuo ol RE Xyl (diagnóstico vía de fragmentación m / z 885 → 711 → 551 → 391; Figura 3II), cadena lateral Ara unido a ambos RE Xyl ol y el penúltimo (1 st residuo de Xil Xil RE ol) residuo Xil (vía la fragmentación de diagnóstico m / z 885 → 711 → 537 → 391; Figura 3III), la cadena lateral Ara unido a la penúltima (1 st Xil del RE Xil ol) residuo Xil (vía la fragmentación de diagnóstico m / z 885 → 711 → 537 → 377; Figura 3I) y la Ara cadena lateral unida en el residuo de Xil del ol RE Xil (Figura 3iV).

La presencia de estos iones confirma las estructuras isoméricas propuestas I, II, III y IV y de la estructura de oligosacárido RE neutral de: - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p.

El espectro ESI-MS 2 de 2AB metilado-per-O marcada RE oligosacárido generado a partir del Fragmentación de la cuasi-molecular [M + Na] + de iones a m / z 871 (P + 4 2AB) se muestra en la figura 4. Este espectro incluye el más abundante de iones Y en m / z 697 (P + 3 2AB con uno cicatriz), m / z 537 (P 2 + 2AB con una cicatriz) y m / z 377 (P 1 + 2AB con una cicatriz), generado por la pérdida de uno, dos o tres no reductoras residuos pentosilo, respectivamente. El ión m / z 697 se puede generar ya sea por la pérdida de un residuo terminal final Xyl no reductor o por la pérdida de un residuo terminal de Ara mientras que el m / z 537 ion sólo puede ser generado por la pérdida de dos residuos de Xyl terminales . La vía de la fragmentación de diagnóstico (m / z 871 → 697 → 537 → 377) sugirieron que la existencia de oligosacáridos lineales no-ramificado columna vertebral xilano (s) en el RE correspondiente a la cuasi-ion molecular m / z 871 (P 4 + 2AB ). Sin embargo, la columna vertebral lineal xilosiltransferasa no-ramificado (P 4 + 2AB) es susceptible al sitio endoxilanasa específico para la digestión adicional. Por lo tanto, pueden existir dos isomérica m / z 697 iones. De acuerdo con ello se proponen dos posibles estructuras isoméricas (Figura 4: I y II). En estas estructuras isoméricas iones Y y B son etiquetados en rojo y negro, respectivamente. El ESI-MS 3 espectro registrado de la fragmentación de precursor isomérica m / z 697 ion genera m / z 523 ion (Y ion de P 2 + 2AB con dos cicatrices; la Figura 4, las estructuras de Ia, Ib, IIa y IIb), m / z 363 ion (y ion de P 1 + 2AB con dos cicatrices; la Figura 4, la estructura IIa) y de iones y en m / z 377 (P + 1 2AB con una cicatriz; la Figura 4, las estructuras Ia y Ib). El fragmento de iones am / z 377 sólo puede surgir de la estructura propuesta I y el fragmento de iones am / z 363 sólo puede surgir de la estructura propuesta II. La presencia simultánea de estos dos iones confirma las estructuras propuestas I y II. Por lo tanto la secuencia de RE glicosilo de la cadena de xilano de AXs endospermo de trigo consiste en una rama de Ara unido al residuo RE Xyl (fragmentación vía de m / z 871 → 697 → 523 → 363) y / o residuo de Xyl penúltima (fragmentación vía m / z 871 → 697 → 523 → 377).

El análisis de RMN de la AXs

Los análisis basados ​​en MS no proporcionan información sobre la configuración, ya sea anomérico (α / β) o la configuración D / L de los azúcares que deben ser obtenidos por otros enfoques, incluyendo enzimática y física (por ejemplo, RMN). Para heteroxilanos con la característica RE reducida tetrasacárido (Xil-Rha-gala-Xil ol), el espectro de RMN contiene señales anoméricos que conducen a la identificación y secuenciación de este oligosacárido RE. Se describe el uso de la espectroscopia de 600 MHz 1D 1H-RMN como método único de paso para detERMINE la secuencia de glicosilo completa del endospermo de trigo oligosacárido AX RE en el KOH-sol Fr, incluyendo la configuración anomérica (α / β) y la configuración D / L de los azúcares. Resonancias se asignaron sobre la base de asignaciones publicadas de oligosacáridos AX trigo 17-18 (Figura 5, Tabla 1). El espectro de 1H-NMR de la AX extraído de endospermo de trigo está dominado por los desplazamientos químicos anomérico en 5,39, 5,27 y 5,22 ppm que son asignados al protón de un residuo de α-L-Ara f terminal, unido a O-3 posición (T-α-L-Ara f → 3 S) de los (1,4) -β-Xyl residuos p backbone individualmente ramificados y ambos O-3 y O-2 posiciones (T-α-L-Ara f → 3 D y T-α-L-Ara f → 2 D) de (1,4) -β-Xyl residuos p backbone doblemente ramificado, respectivamente (Figura 5 y Tabla 1).

f → 3 S + D) de la señal H1 de α-L-Ara f cadena lateral unido a la posición O-3 del residuo p β-D-Xyl individualmente ramificado con contiguo doblemente ramificado β-D-Xyl p. La señal en 5,29 se asigna a la (T-α-L-Ara f → 3 D + D) de la señal H1 de cadena lateral f α-L-Ara unido a la posición O-3 de la doblemente ramificado β-D-Xyl residuo p con contiguo doblemente ramificado β-D-Xyl p. la señal en 5,24 se asigna a la (T-α-L-Ara f → 2 D + D) de la señal H1 de cadena lateral f α-L-Ara unido a la O-2 posición del residuo p β-D-Xyl doblemente ramificado con contiguo doblemente ramificado β-D-Xyl p.

Figura 1

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figura 1. Resumen de enfoque experimental Un resumen de la estrategia empleada en la generación, purificación y secuenciación del extremo reductor (ER) y oligosacáridos región interna. de trigo se muestra arabinoxilanos endospermo (AXs). Esta cifra se ha reproducido con permiso de Ratnayake et al. (2014) 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. MALDI-TOF MS (A) y ESI-QTOF MS (B - E) análisis de los oligosacáridos liberados por nativos endoxilanasa de 2AB marcado W-sol AXs como se indica en la Figura 1. MALDI-TOF MS espectro de: (A) ( Las señales de una re identificado como [M + Na] + iones de aducto); Exploraciones de iones seleccionados de la ESI-MS QTOF cromatogramas: B = P 5-10 derivado de oligosacáridos región interna (Las señales se identifican como [M + NH4] + iones aductos); C = P + 2AB 1-6 derivados del RE oligosacáridos (Las señales se identifican como [M + H] + iones de aducto) & P 3-8 G derivado de oligosacáridos ácidos (Las señales se identifican como [M + Na] + iones de aducto); D = ESI-Q-TOF completa espectro de análisis: región comprendida entre 3,10 a 3,48 min, e = ESI-Q-TOF espectro completo de exploración: región comprendida entre 3,59 a 4,05 min (Las señales se identifican como tanto [M + Na] + y [M + NH4] + iones aductos ); P = unidad de pentosilo (ya sea Ara o Xil); G = residuo uronosyl (GlcA); RE = reductores oligosacáridos finales; 2AB = 2 aminobenzamida; EIC: cromatograma de iones extraídos. ad / 53748 / 53748fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. El ESI-MS 2, 3 ESI-MS y ESI-MS espectros de 4 por O-metilado-RE neutra alditol glicosilo (P + 4 Xil ol) - m / z 885. Las señales se asignan como el [M + Na] + aductos de iones seudo-molecular. Como son posibles varias estructuras isoméricas de una masa definida a continuación en las estructuras isoméricas iones Y y B son etiquetados en rojo y negro, respectivamente. Cada "cicatriz" generado por el evento de fragmentación se marca como una línea sólida. residuo X = xilosilo; Un residuo = arabinosil. El 3 espectros ESI-MS se ha reproducido con permiso de Ratnayake et al. (2014) 2.748fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. El ESI-MS 2 y ESI-MS 3 espectros de 2AB metilado-per-O marcada oligosacárido neutral RE (P 4 + 2AB) - m / z 871. Las señales se asignan como el [M + Na] + de pseudo aductos de iones -molecular. Como son posibles varias estructuras isoméricas de una masa definida en las estructuras isoméricas, los iones Y y B son etiquetados en rojo y negro respectivamente. Cada "cicatriz" generado por el evento de fragmentación se marca como una línea sólida. residuo X = xilosilo; Un residuo = arabinosil. Esta cifra se ha reproducido con permiso de Ratnayake et al. (2014) 2. Haga clic aquí para conocer el vers más grandesión de esta figura.

Figura 5
Figura 5. región anomérica del espectro de 600 MHz 1D 1 H-NMR de los oligosacáridos AX generado por el tratamiento de la endoxilanasa KOH- Sol P. 1 desplazamiento químico H hace referencia a un patrón interno de acetona a 2.225 ppm. T-α-L-ara f → 3 S: H1 señal de cadena lateral f α-L-Ara unido a la posición O-3 del residuo p β-D-Xil solos ramificado; T-α-L-Ara f → 2 D: señal H1 de cadena lateral f α-L-Ara unido a la posición O-2 del residuo p β-D-Xyl doblemente ramificado; T-α-L-Ara f → 3 D: señal H1 de cadena lateral f α-L-Ara unido a la posición O-3 del residuo p β-D-Xyl doblemente ramificado; T-α-L-Ara f → 3 S + D: señal H1 de cadena lateral f α-L-Ara unido a la posición O-3 del residuo p β-D-Xyl individualmente ramificado con cuarto doblemente ramificado β-D- Xyl p; T-α-L-Ara f → 2 D + D: señal H1 de la cadena lateral f α-L-Ara unido a la posición O-2 del residuo p β-D-Xil doblemente ramificado con cuarto doblemente ramificado β-D p -Xyl; T-α-L-Ara f → 3 D + D: señal H1 de la cadena lateral f α-L-Ara unido a la posición O-3 del residuo p β-D-Xil doblemente ramificado con cuarto doblemente ramificado β-D p -Xyl; 2-α-L-Ara f → 3 S: señal H1 del residuo de cadena lateral f2-α-L-Ara unido a la posición O-3 del residuo p β-D-Xil solos ramificado; Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura.

residuos de azúcar H-1 / C-1 H-2 / C-2 H-3 / C-3 H-4 / C-4 H-5 eq / C-5 H-5 ax / C-5
T-α-L-Araf → 3 S 5.396 / 107.6 4.16 3.95 4.3 3.82 3.72
T-α-L-Araf 5.415 / 4.18 3.95
→ 3 S + D
T-α-L-Araf → 2 D 5.223 / 4.16 3.97 3.82 3.74
T-α-L-Araf → 2 D + D 5.243 / 4.16 3.98
T-α-L-Araf → 3 D 5.272 / 108.9 4.18 3.96 4.26 3.79 3.74
T-α-L-Araf → 3 D + D 5.298 / 4.18 3.96
2-α-L-Araf → 3 S 5.548 / 106.4 4.27 4.06 4.3 3.82
a-Xylp (Reducción) 5.185 / 91,9 3.55 3.72
ß-Xylp (Reducción) 4.580 / 96,6 3.29 3.48 3.64 4.06 3.38
β-4-Xylp 4.470 / 3.32 3.58
ß--4 Xylp + S 4.461 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-4-Xylp + D 4.448 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
ß-3,4-Xylp 4.518 / 3.44 3.85
S + 3,4-β-Xylp 4.514 / 3.47 3.75 3.86 4.14 3.43
D + β-3,4-Xylp 4.505
ß-3,4-Xylp + S 4.492 3.45 3.74
β-3,4-D + Xylp 4.482 3.45 3.74
ß-2,3,4-Xylp 4.638
S + β-2,3,4-Xylp 4.627 3.59 3.87 3.88
D + β-2,3,4-Xylp 4.616
ß-2,3,4-Xylp + S 4.593
β-2,3,4-Xylp + D 4.593
desplazamientos químicos se presentan con relación a acetona interna, delta 2,225.
S = Individualmente ramificado β-Xylp
S + D = Individualmente ramificada β-Xylp + doblemente ramificado β-Xylp
D = doblemente ramificado β-Xylp
D + D = doblemente ramificado β-Xylp + doblemente ramificado β-Xylp

Tabla 1. señales de 1 H-RMN de los xilo-oligosacáridos generados por tratamiento endoxilanasa del endospermo de trigo KOH-sol Fr.

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Discussion

La mayoría de los polisacáridos de la pared celular de la fase de matriz han backbones aparentemente sustituido al azar (con tanto glicosilo y residuos no glicosilo) que son muy variable dependiendo de las especies de plantas, el grado de desarrollo y tipo de tejido 3. Desde polisacáridos son productos de los genes secundarios su secuencia no es plantilla derivada y por lo tanto no hay un enfoque analítico único, como el que existe para los ácidos nucleicos y proteínas, para su secuenciación. La disponibilidad de enzimas hidrolíticas-vinculación específica purificadas ha proporcionado una herramienta potente para degradar polisacáridos a oligosacáridos que luego pueden ser cromatográficamente fraccionado, y cuando se utiliza en combinación con las técnicas químicas y físicas completamente secuenciado. El reto es entonces volver a montar estas mezclas complejas en un solo original, el polisacárido de secuencia que aún ha de ser abordado con éxito.

Aquí se describe un enfoque (cuyo orden de aplicación can ser variada) que se basa en la integración de las enzimática establecido, químicas y técnicas físicas para la caracterización estructural de tanto el extremo reductor (RE) y la secuencia de glicosilo región interna (s) de heteroxilanos. Una técnica complementaria adicional que no se describe aquí, que ha demostrado ser muy útil para la caracterización de oligosacáridos es PACE (análisis de polisacáridos mediante electroforesis en gel de carbohidratos) desarrollado por el grupo de Dupree 19 y que puede ser fácilmente integrado en este protocolo si el equipo está disponible. Además, las variaciones en la cromatografía LC también pueden ser útiles, tales como la cromatografía en tándem en línea interacción hidrófila (HILIC), seguido de cromatografía RP ofrece la posibilidad de separar tanto no etiquetado / etiquetado oligosacáridos en un solo paso. Las técnicas se basan en el etiquetado (con 2 aminobenzamida (2AB)) el extremo reductor (RE) de la cadena heteroxilano antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa). Dos enfoques diferentes (ver resumen enFigura 1) se adoptó. En el primero, intactos AXs W-sol se tratan con 2AB para etiquetar el RE columna vertebral residuo original de azúcar de cadena y luego tratados con una endoxilanasa para generar una mezcla de RE 2AB marcado y la región interna reducir oligosacáridos, respectivamente. En un segundo enfoque, el KOH-sol Fr se hidroliza con endoxilanasa para generar primero una mezcla de oligosacáridos que posteriormente se etiquetan con 2AB. En este último escenario, el RE original del AX KOH-sol no sería etiquetado con 2AB, ya que se había reducido a la glicosil-alditol durante la extracción alcalina que contenía el agente reductor, borohidruro de sodio (NaBH 4). Por lo tanto, los oligosacáridos marcados con 2AB generan la digestión post-xilanasa, se originará a partir de oligosacáridos "internos" y el oligosacárido RE original, contendrá un alditol RE sin una etiqueta de 2AB (ver Figura 1). Este enfoque también se puede aplicar a otras clases de polisacáridos ucantar (donde esté disponible) los endo-hidrolasas adecuadas.

El enfoque basado en MS se mejora significativamente por la metilación de los oligosacáridos generados después del tratamiento endoxilanasa ya que el grupo hidroxilo un-metilado (s) generada durante la fragmentación en fase gaseosa de por-O-metilado oligosacáridos en la EM n proporciona un 14Da diferencia de masa "cicatriz "que se puede utilizar para ayudar en la identificación del patrón de ramificación y la secuencia de glicosilo. 5-6 la identidad de los restos pentosilo (y cualquier residuo de azúcar) no se puede hacer a partir de los datos de MS solos pero viene de tener un conocimiento de la composición de la molécula; cuando esto no está disponible, los análisis de monosacáridos y vinculación pertinentes deben llevarse a cabo antes de realizar estas tareas en la EM n. Además, las señales correspondientes a la alditol RE ácido oligosacárido, generada a partir de KOH-sol Fr (Xyl 3 -MeGlcA-Xylitol: m / z 761) y el chsecuencia de glicosilo RE xilano dicotiledóneas aracteristic (Xil 2 -RHA-gala-xilitol: m / z 761), si está presente, no son capaces de distinguirse ya que ambos tienen la misma masa molecular en forma nativa, pero puede distinguirse de su fragmentación MS ( MS n) los espectros que se realiza mejor en los oligosacáridos metilados. Por último, las técnicas basadas en MS son incapaces de proporcionar información ya sea en la configuración anomérica (α / β) del enlace glicosídico o la configuración D / L de la sugars- esto debe ser determinado por métodos alternativos, incluyendo enzimática y física (por ejemplo, NMR).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 aminobenzamide (2AB) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A89804
sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 247677 Hazardous, handle with care
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 156159 Hazardous, handle with care
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) Megazyme (www.megazyme.com) E-XYTR1
Deuterium Oxide (D2O) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 151882
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  Agilent  (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Model - MicroFlex LR) (Bruker Daltonics, Germany)
(ESI) -(QTOF) MS   (Model # 6520) (Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - ion-trap  (Model # 1100 HCT) (Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR Bruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- software  Bruker 
GC-MS (Model # 7890B) Agilent 

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References

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