Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning

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Developmental Biology

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Schott, J. T., Kirby, L. A., Calabresi, P. A., Baxi, E. G. Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning. J. Vis. Exp. (108), e53764, doi:10.3791/53764 (2016).

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Abstract

Introduction

Efficient Nervenleitung in der Säugetiere Zentralnervensystem (ZNS) erfordert Myelinisierung von Axonen durch Oligodendrozyten. Während der Entwicklung entstehen Oligodendrozyten aus einem Pool von Oligodendrozyten-Progenitorzellen (OPC), die gedacht werden, von den ventrikulären Zonen der Entwicklung des Vorderhirns und Neuralrohr 1 zu migrieren. Nach der Migration OPCs zu reifen unterscheiden, myelinisierenden Oligodendrozyten, die nicht nur effizient Impulsausbreitung zu erleichtern, sondern auch Axone mit trophischen Unterstützung 2 liefern. Die adulten ZNS unterhält eine reichliche Population von OPCs, die während der grauen und weißen Substanz dispergiert sind, die ungefähr 5-8% aller Zellen 3. Nach einer demyelinisierenden Beleidigung, wandern OPCs zu der Stelle der Verletzung, vermehren und differenzieren verlorenen oder beschädigten Myelinscheiden an exponierten Axone zu ersetzen. Doch in einigen Krankheit / Verletzung Einstellungen wird dieses Verfahren ineffizient zu sein oder ganz ausfallen 4 gefunden. Währendchronische Demyelinisierung wird gedacht, um die Krankheitslast, effiziente oligodendrogenesis und Remyelinisierung kostenlos in fünf Symptome zu lindern. Es ist daher von Interesse gewesen OPCs in vitro zu studieren die Wirkung der experimentellen Faktoren auf oligodendrogenesis zu bestimmen.

Einblick in die verschiedenen Phasen der Oligodendrozyten-Differenzierung wurde durch die Identifizierung von Stufe spezifische Zellmarker ermöglicht worden. Selbst erneuernden frühen Vorläuferzellen durch ihre Expression von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor alpha (PDGFRα), neuronalen / Glia-Antigen 2 (NG2) und A2B5 6 definiert sind - 8. Als OPC ihre Differenzierungsprogramm und ziehen sich aus dem Zellzyklus einleiten, herunterregulieren sie Expression dieser Marker und beginnen Proteine ​​zu exprimieren bezeichnend für Oligodendrozyten mit zyklisch-Nukleotid-3'-Phosphodiesterase (CNPase) und O4 premyelinating. Schließlich deren Differenzierung in reiferen oligodendrocytes wird durch die Expression von Myelin-assoziierten Proteine, einschließlich Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG), Proteolipidprotein (PLP) und basisches Myelinprotein (MBP) aus. MBP ist ein intrazelluläres peripheren Membranprotein und ein Hauptbestandteil der Myelinscheide. Mäuse entwickeln fehlt MBP einen schweren Phänotyp, in dem CNS Myelinisierung deutlich zu Zittern verringert führt, ist, Krämpfe und frühen Tod 9,10. Diese wichtige Rolle der MBP in Myelinisierung hat zu seiner Verwendung als ein Marker für Oligodendrozyten Differenzierung führte sowohl in vitro als auch in vivo 11.

Quantifizierung von MBP kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden. RT-PCR und Western Blot-Analyse ermöglichen eine Quantifizierung der MBP-Niveaus unter verschiedenen Behandlungsschemata. Immunzytochemie ist eine gemeinsame qualitative Ansatz, der auch quantitativ sein können, wenn die Kamera-basierte Mikroskopie Ansätze verwendet werden. Obwohl diese Systeme sind zuverlässig und grundlegenddas Studium der Oligodendrozyten-Differenzierung, sie haben jeweils ihre eigenen Nachteile, die ihre Verwendung in Arzneimittel-Screening begrenzen. Erstens, die Menge der primären OPCs, die für RT-PCR und Western Blot-Analyse erforderlich sind, reduziert die Anzahl der Variablen, die gleichzeitig untersucht werden können. Während die Zelle Voraussetzung für Immunzytochemie viel niedriger ist, müssen erhebliche Zeit zu jedem Experiment gewidmet werden, wenn die Quantifizierung ist das Ziel. Zahlreiche Bilder müssen experimentelle Analyse zu erleichtern eingefangen und dann quantifiziert werden. Diese Einschränkungen werden wichtige Hindernisse für Studien zu berücksichtigen, die einen hohen Durchsatz Beurteilung erfordern. Hier beschreiben wir eine Methode, die grundlegenden Aspekte von nutzt sowohl der Immunzytochemie und Western Blot Methoden zur Quantifizierung Myelin, während erheblich sowohl die Anzahl von Zellen erforderlich ist und die Zeit zu reduzieren quantitative Analyse durchzuführen.

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Protocol

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) und Johns Hopkins School of Medicine zugelassen.

1. Herstellung von Assay-Platten, Stammlösungen und OPC-Basismedien

Hinweis: Die Ratte OPC Basis (Sato) hier beschriebenen Medien wurde von bisher veröffentlichten Studien 12,13 abgeleitet. Alternative Medien Formulierungen können auch mit diesem Verfahren kompatibel sein.

  1. Resuspendieren Poly-L-Lysin (PLL) auf eine Konzentration von 10 ug / ml in sterilem deionisiertem Wasser. Pipette 400 ul der verdünnten PLL in jede Vertiefung einer schwarzen Wänden, klarer Boden 24-Well-Gewebekulturqualität Gericht.
  2. Coat-Gewebekulturschalen für 2 Stunden in einem 37 ° C Brutschrank oder über Nacht in einen 4ºC Kühlschrank.
  3. Saugen PLL aus beschichtetem Geschirr mindestens 20 Minuten vor der Beschichtung. Lassen Sie die restlichen PLL aus dem Bohrloch zu trocknen, indem Platten mit 24 Vertiefungen mit dem Deckel teilweise offen in einer GewebekulturHaube. Stellen Sie sicher, dass die Brunnen vor dem Beschichten isoliert OPC vollständig trocken sind. Die Zellen werden nicht an Kunststoff haften, die Flüssigkeit PLL Gegenwart hat.
  4. Bereiten N-Acetyl-L-Cystein (NAC) Stammlösung (1,000x): Man löst 100 mg N-Acetyl-L-Cystein (NAC) in 20 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Aliquotieren und bei -20 ° C.
  5. Bereiten Sie Hydrocortison-Stammlösung (1,000x): 1 ml Ethanol zu 1 mg Hydrocortison und Wirbel zu lösen. In 19 ml DMEM, mischen Sie die Lösung, aliquoten und bei -20 ° C. Der Zusatz von Hydrocortison zum Basismedium wurde 14 das Überleben von Gliazellen zu verbessern gezeigt.
  6. Bereiten d-Biotin-Stammlösung (5.000-facher): Man löst 2,5 mg d-Biotin in 50 ml PBS. Hinzufügen 1-2 x 5 ul Tropfen 0,1 N NaOH in Lösung zu unterstützen. Aliquotieren und bei -20 ° C.
  7. Bereiten Insulin-Stammlösung (100x): Man löst 25 mg Insulin in 50 ml Gewebekulturqualität Wasser. In 250 ul of 1 N HCl und mischen, bis die Lösung klar ist. Sterilisieren mit einem 0,22-um-Filter und lagern bei 4 ° C für bis zu 6 Wochen.
  8. Bereiten Sato Stammlösung (100x):
    1. Bereiten Progesteron-Stammlösung (25 ug / ul): Man löst 2,5 mg Progesteron in 100 ul Ethanol.
    2. Bereiten Natriumselenit-Stammlösung (400 ng / & mgr; l): Man löst 4 mg Natriumselenit in 100 ul 0,1 N NaOH. 10 ml DMEM und mischen.
    3. Zu 100 ml DMEM, fügen 1 g Human apo-Transferrin, 1 g Rinderserumalbumin und 160 mg Putrescin und mischen vollständig aufzulösen. In 25 ul Progesteron-Stammlösung, 1000 ul von Natriumselenit Stammlösung und mischen. Aliquotieren und bei -20 ° C.
  9. Bereiten OPC Basis Medium: pro 100 ml DMEM (mit 4,5 g / L D-Glukose, L-Glutamin und 110 mg / L Natriumpyruvat), 100 ul NAC, 100 & mgr; l Hydrocortison, 20 & mgr; l d-Biotin, 1 ml Insulin, 1 ml Sato Lager, 100 ul Spurenelemente B,2 ml B-27 Supplement (50x), und 1 ml Penicillin / Streptomycin (100x). Sterilisieren mit einem 0,22-um-Filter und lagern bei 4 ° C.
  10. Bereiten PDGF-AA-Stammlösung (1,000x): Man löst 250 & mgr; g in 12,5 ml PBS mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), um eine 20 ug / ml Lösung herzustellen. Aliquotieren und bei -80 ° C.
  11. Bereiten OPC Proliferation Medien: OPC-Basismedium, ergänzt mit 20 ng / ml PDGF-AA.
  12. Bereiten OPC Differenzierung Medien: OPC-Basismedium mit 45 nM Trijodthyronin ergänzt.
  13. Bereiten Säulenpuffer: Zu 500 ml PBS, fügen Sie 2,5 g BSA und 2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und der pH-Wert auf 7,2. Sterilisieren mit einem 0,22-um-Filter und lagern bei 4 ° C.

2. Rattenhirn Dissection

Hinweis: P5-P7 Rattenjungen in diesem Protokoll verwendet werden. Jede Ratte Welpen Kortex ergibt etwa 1,5 bis 2,0 x 10 6 A2B5-positiven Zellen.

  1. Sterilisieren Sie alle Dissektion die Einrichtung 250 mit6; C erhitzt Perle Sterilisator.
  2. Hinzufügen 15-20 ml PBS (ohne Ca 2+ und Mg 2+) zu 50 ml konischen Röhrchen. Ein 50 ml konischen Röhrchen reicht für 3-4 Rattenjungen Rinden. Zeigen 50 ml konischen Röhrchen auf Eis. Verwenden Sie 50 ml konische Röhrchen beim Präparieren gewürfelt Kortex Gewebe zu halten.
  3. In kaltem PBS zu einer 10 cm Petrischale. Dieses Gericht wird für die Präparation unter dem Lichtmikroskop verwendet werden.
  4. Opfern Rattenjungen durch Enthauptung mit großen chirurgischen Schere. Sprühkopf mit 70% Ethanol.
  5. Entpacken Sie die Whole-Brain
    1. Mit einer kleinen Schere schneiden Sie die Haut nach unten der Mittellinie und hinter den Ohren und Haut Klappen zurück. Schneiden Sie die Schädel der Mittellinie vom Hirnstamm ausgehend nach unten und an den Augen endet. Achten Sie darauf, nicht zu tief zu schneiden, um die Struktur des zugrunde liegenden Kortex zu bewahren.
    2. Machen Sie zwei seitliche Schnitte zum Kleinhirn unterlegen durch kleine chirurgische Schere in das Foramen magnum eingefügt wird. Machen Sie einen zusätzlichen Schnitt zwischen den Augen, Ameiseerior zu den Riechkolben.
    3. Sie vorsichtig jede Hälfte des Schädels zurück. Entfernen Sie das gesamte Gehirn und in den 10 cm Petrischale mit kaltem PBS gefüllt.
  6. Unter dem Lichtmikroskop Dissektion, entfernen Sie die Riechkolben und Kleinhirn mit feinen chirurgischen Pinzette.
  7. Flip das Gehirn, so dass die Bauchseite unter dem Lichtmikroskop sichtbar ist.
  8. Mit feinen gerade Zange führen eine stumpf durch geschlossene Zangenspitzen zwischen dem Kortex und Hypothalamus etwa 2/3 des Gehirns zu einer Tiefe platzieren. Sobald Zange vorhanden sind, lassen sich die Enden zu öffnen. Wiederholen Sie für die andere Halbkugel.
  9. Necken die Rinde aus dem Hypothalamus und Mittelhirn Regionen.
  10. Entfernen Sie den Hypothalamus, Thalamus und Mittelhirn durch das Mittelhirn an seiner hinteren Fläche halten und es in Richtung des vorderen Endes des Gehirns Peeling. Sever die vorderen Verbindungen.
  11. Entfernen Sie den Hippocampus von ihr nach außen läuten und dann Abtrennen seiner Verbindung mit derRinde mit feinen gebogen Dissektion Zange.
  12. Reste des Striatum, indem sie es von der darunter liegenden Kortex nach außen Diagonale Bewegung mit feinen gebogen Dissektion Zange Verschrottung.
  13. Löschen Sie alle Blutgefäße und Hirnhaut von der ventralen Oberfläche des Kortex.
  14. Flip das Gehirn, so dass die Rückenfläche sichtbar ist. Hirnhäute und Blutgefäße sollte offensichtlich sein. Peel Hirnhaut von der darunter liegenden Kortex mit feinen Sezierung Zange. Starten Sie von der Riechkolben Befestigungsstelle Peeling.
  15. Führen Sie die Schritte 2,4-2,14 für insgesamt 3-4 Rattenjungen.
  16. Zeigen 3-4 seziert Rattenjungen Kortex in einem trockenen Petrischale und hacken mit einem sterilisierten Rasierklinge bis 1 mm x 1 mm Brocken erreicht werden. Sammeln Gewebe nach Spezialitäten mit PBS aus einem 50 ml konischen Röhrchen (Schritt 2) legen Sie dann wieder auf Eis zu spülen.

3. Die enzymatische und mechanische Gewebedissoziation

Hinweis: Bei diesem Schritt wird ein Papain basierten neuronalen Dissoziation Kit empfohlen. Mit Neural Dissoziation Kit (P), spezielle Schritte, die für OPC Isolierung optimal sind beschrieben.

  1. Bereiten Sie die erste Dissoziation Enzym durch Enzym P mit dem geeigneten Puffer verdünnt. Der Inhalt jeder 50 ml konischen (1 Probe) wird mit insgesamt 1950 ul Enzymmischung suspendiert werden. Platz in der Enzymmischung in einem 37 ° C Bad für 10 min.
    Ein Beispiel: 1900 ul Puffer + 50 ul Enzym Papain
  2. Spin alle 50 ml konische Röhrchen 3-4 gewürfelte Rattenjungen Kortex bei 300 g für 3 min enthält.
  3. Saugen Sie den Überstand und fügen 1950 ul Enzymlösung in jedes Röhrchen Probe und brechen das Pellet auseinander, indem das Röhrchen invertiert und leichtes Schütteln.
  4. Inkubieren in einem 37 ° C Brutschrank für 15 min unter kontinuierlichem Rohrdrehung.
  5. Während der letzten 5 Minuten der Inkubation bereiten das zweite Enzym-Mix A. das Enzym in seiner geeigneten Puffer verdünnen. Insgesamt 30 & mgr; l hinzugefügt werdenzu je 50 ml konischen Probenröhrchen.
    1 Probe: 20 ul Puffer + 10 & mgr; l der Enzym
  6. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist 30 ul des zweiten Enzyms Mischung hinzufügen zu jedem Röhrchen und umkehren zu mischen.
  7. Mit einem Glas Pasteur Pipette auf eine Pipette Controller angeschlossen, distanzieren mechanisch das Gewebe durch Pipettieren von 10 bis 15 Mal oder bis die Gewebestücke in der Größe reduziert, und die Lösung ist trüb. Bringen Sie die Probe auf die 37 ° C Gewebekultur-Inkubator für 15 min mit kontinuierlicher Rotation.
  8. Pipette jedem Gewebehomogenat Probe 10-15 mal eine 1 ml Pipette.
  9. Pipette jedem Gewebehomogenat Probe 15-20 mal mit einem 200 ul Pipette
  10. Gibt alle Proben an das 37 ° C Gewebekultur-Inkubator für 10 min mit kontinuierlicher Rotation.
  11. 10 ml PBS (mit Ca 2+ und Mg 2+) zu jeder Probe und Filtern des Homogenats durch ein 40 & mgr; m Porenfilter gelegt über einen 50 ml Rohr. Spülen Sie den Filter mit zusätzlichen 1-2 ml PBS.
  12. Pool alle der Homogenat Proben in einem 50 ml konischen Röhrchen und erwerben eine Gesamtzellzahl.
  13. die Zellzahl nach der Durchführung, spaltete gleichmäßig des Homogenats in 15 ml konische Röhrchen (1 Röhrchen für jede Probe). Zentrifuge für 10 bis 12 Minuten bei 300 x g.

4. Anti-A2B5 Raupenauftrag, Säule Reinigung und Beschichtung

  1. Durchführen von Berechnungen für Säulenpuffer und anti A2B5 Mikrokügelchen. ADD 7 ​​ul Säulenpuffer pro 1 x 10 6 Zellen. Hinzufügen 2 & mgr; l Anti-A2B5 Mikroperlen pro 1 x 10 6 Zellen.
  2. Kombinieren all der Proben durch Resuspendieren der Zellen in einem Gesamtvolumen von 10 ml Säulenpuffer und Zentrifugieren bei 300 × g für 10-12 min.
  3. Resuspendieren des Zellpellets in der entsprechenden Menge an Säulenpuffer als 4.1 in Schritt berechnet. Wenn das Pellet groß und locker ist, fügen Sie nur etwa die Hälfte des Volumens der Säulenpuffer des Anti zu haltenKörper in der geeigneten Konzentration in der Zelle Resuspension.
  4. Inkubieren der Zellsuspension für 10 min bei 4 ° C.
  5. Hinzufügen anti-A2B5 Microbeads (berechnet in Schritt 4.1), mehrfach invertiert und für 30-60 min bei 4 ° C inkubieren. Vorsichtig wird das Röhrchen alle 10 Minuten mehrmals. Längere Inkubationszeiten können Zellausbeuten erhöhen, sondern kann eine unspezifische Bindung zu erhöhen.
  6. Hinzufügen 5 Volumina Säulenpuffer. Wenn die Zellen in einem Volumen von 1 ml resuspendiert, 5 ml Säulenpuffer, während, wenn die Zellen in 2 ml resuspendiert, mit 10 ml Säulenpuffer hinzuzufügen.
  7. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g.
  8. Ermitteln Sie, wie viele LS Spalten werden für die Reinigung erforderlich sein. Ein LS-Säule reicht für 15-20 x 10 6 Zellen insgesamt.
  9. das Zellpellet in 1000 ul Säulenpuffer pro LS Säule resuspendieren verwendet wird.
  10. Prime jeweils LS Säule durch Zugabe von 5 ml des Säulenpuffers. Sammeln des Durchflusses durch in einem 50 ml konischen Röhrchen. Nachdem die Säule buffer vollständig durch die obere Kammer geleitet, zu jeder Spalte 1000 ul der Zellsuspension auf und lassen die Zellen durch die Schwerkraft zu durchlaufen.
    Hinweis: Wenn die Dichte der Zellen zu hoch ist, kann die Säule langsam laufen.
  11. Unmittelbar nach der Zellsuspension durch die Säule passiert hat, langsam mit 3 ml Säulenpuffer zu jeder Spalte die ungebundenen Zellen zu waschen. Wenn die Wasch leicht durch die Säule (1 Tropfen für alle 30-45 sec) laufen, wäscht noch zweimal mit 3 ml Säulenpuffer.
  12. Entfernen Sie jede Spalte und legen Sie es auf einem 15 ml konischen Röhrchen. 5 ml Säulenpuffer eintauchen und den Puffer durch die Säule bei einer hohen Geschwindigkeit das Kunststoff Kolben verwenden, die mit der Säule gepackt ist. Eintauchen werden die gebundenen Zellen verdrängen sie aus der Säule freigibt.
  13. Erhöhen Reinheit durch die Probe durch eine zweite Runde der LS Spalten läuft. Verwenden ein Drittel der Anzahl der Spalten während des ersten Durchgangs verwendet. Prime die Säulen mit 5 ml des Säulenpuffers.Lassen Sie den Säulenpuffer durch die obere Kammer zu übergeben.
  14. Da das Volumen der Zellsuspension viel größer sein wird, gleichmäßig auftragen 1.000 ul zu jeder Spalte Zellsuspension und ermöglichen die Suspension durch die obere Kammer der Säule zu passieren, bevor mit weiteren 1000 ul aufzufüllen.
  15. Nachdem die Zellsuspension in die zweite Runde der Spalten vollständig angewendet wurde, waschen 2-3 mal mit 3 ml Säulenpuffer.
  16. Entfernen Sie jede Spalte und legen Sie es über einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen. 5 ml Säulenpuffer und tauchen den Puffer, der die Kunststoff Kolben verwenden, die mit der Säule gepackt ist. Eintauchen werden die gebundenen Zellen verdrängen sie aus der Säule freigibt.
  17. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 g für 12 bis 15 min. Das Pellet sollte kompakt erscheinen.
  18. Zellpellet in 5-10 ml vorgewärmtes OPC Proliferationsmedien (OPC Basis ergänzten Medium mit PDGF-AA 20 ng / ml).
  19. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Platte der Zellen. Verdünne die Zellen zu 60.000 Zellen / ml mit OPC Proliferationsmedien. In jedes schwarz, klarer Boden mit 24 Vertiefungen, Pipette 500 ul Zellen entlang der Seite der gut 30.000 Zellen pro Vertiefung zu erhalten. Mischen Sie die Zellen durch Schütteln der Platte horizontal mit einer Acht Bewegung. Wenn dem Test in 48, 96, oder 384-Well-Platten, fügen 15.000, 7.500 oder 1.500 Zellen pro Vertiefung auf. Diese Zahlen können je nach individuellen Plattenspezifikationen angepasst werden.
  20. Bereiten Sie eine separate Platte für den Tag 0 Baseline-Kontrollkulturen. Diese Steuerplatte sollte wie in Abschnitt 5.7 beschrieben, mit 4% Paraformaldehyd fixiert werden, wenn die Differenzierung am Tag 0 begonnen wird.
  21. Kultur die Zellen in OPC-Proliferation Medien bei 37 ° C für 3 Tage ohne Medienwechsel.

5. Induktion von OPC-Differenzierung und Fixierung mit 4% Paraformaldehyd

Hinweis: Wenn die Wirkung von kleinen Molekülen auf oligodendrogenesis Testen, wir routinemäßig dissolve Medikamente in Dimethylsulfoxid (DMSO) 1,000x Bestände herzustellen, die dann bei -80 ° C gelagert werden kann und direkt in SATO Medien verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,1% DMSO zu erhalten. Wir haben beobachtet, keine Veränderungen in entweder OPC Proliferation oder Differenzierung mit dieser DMSO-Konzentration (Daten nicht gezeigt).

  1. Pre-warmen OPC Basis Medien bis 37 ° C und medikamentöse Behandlung Bestände auf Raumtemperatur auftauen. Bei Behandlungen in doppelter Ausführung durchführt, bereiten ungefähr 1,25 ml Medium pro Behandlungsgruppe in einem 1,5-ml-Tube. Für Dreifachproben, verwenden 2 ml Fassungsvermögen Zentrifugenröhrchen für schlaff zu berücksichtigen.
  2. Bereiten Sie die Behandlung Master Mixes für replizieren Brunnen durch Behandlung Verdünnen Aktien direkt in OPC-Basismedien. Kurz Wirbel oder sanft jeden Mastermix mischen homogene Verteilung der Behandlung zu gewährleisten.
  3. Vorbereitung 45 nM Triiodthyronin (T 3) als positive Kontrolle und die betreffende Fahrzeug als negative Kontrolle. Verdünnen 10 mm T 3 Lager1: 1000 in 1 ml OPC Basis Medien und dann weiter verdünnen bei der Behandlung Mastermix die endgültige Konzentration von DMSO gegebenenfalls zu reduzieren.
  4. Saugen das Medium aus dem Kulturvertiefungen einer Behandlungsgruppe zu einer Zeit, so dass das Trocknen der Zellen zu vermeiden. Verwenden Sie ein 200 ul Pipettenspitze am Ende des Glaspasteurpipette zu vermeiden schwarz Material von den Seiten des Bohrlochs Abkratzen und in der Kultur.
  5. Langsam 500 ul Behandlung Mastermix an der Seite des Brunnens einer 1 ml Pipette.
  6. Inkubation der Kulturen für den gewünschten Zeitrahmen, einen vollständigen Medienaustausch mit frischem Behandlungsmedien alle 2-3 Tage durchführen. Wir routinemäßig eine 30-40% MBP + Kultur nach 4 Tagen in Differenzierung Medien beobachten.
  7. Am Ende des Behandlungszeitraums gewünscht, bereiten frisch 4% Paraformaldehyd (PFA) oder eine gefrorene Lager auf Raumtemperatur auftauen. ACHTUNG: PFA ist extrem giftig und muss in einem Abzug hergestellt werden.
  8. Saugen Sie die Medien und langsam mit 4001; l von PFA auf der Seite der gut um die Zellen zu fixieren. Inkubiere die Platte für 20 min bei Raumtemperatur.
  9. Absaugen PFA und füge langsam 500 ul sterilem D-PBS (mit Ca 2+ und Mg 2+) zur Seite der Vertiefung, die Zellen zu waschen. Wiederholen Sie den Wasch insgesamt zwei weitere Male. Sie nicht die letzte Waschanzusaugen.
  10. Wickeln Sie die Platte in Parafilm und lagern bei 4 ° C für die spätere Verarbeitung oder gehen Sie direkt zum nächsten Schritt. Platten können für mehrere Wochen gelagert werden.

6. Immuncytochemie und Quantifizierung von Myelin Basic Protein

Hinweis: Wenn Sie in den 24-Well-Platten Liquid-Handling-Verfahren durchgeführt wird, ist es empfehlenswert, schnell zu arbeiten, um zu vermeiden, dass die Zellen zu trocknen. Hierbei ist die Verwendung einer Mehrkanal-Vakuumstrahlpumpe und Mehrkanal-Pipette werden empfohlen.

  1. Bringen Sie die Platte auf Raumtemperatur, saugen Sie den Brunnen, und fügen 250 ul D-PBS (mit Ca 2+ und Mg 2+), die 0,1% Triton X-100 und 5%normalem Ziegenserum (NGS). Die Platte bei Raumtemperatur für 1 Stunde unter leichtem Schütteln Orbital.
  2. Bereiten Sie die Primär Inkubationslösung durch Verdünnen von monoklonalen Maus-anti-MBP-Antikörper 1: 1000 und polyklonalen Kaninchen-anti-Actin-Antikörper 1: 200 in D-PBS (mit Ca 2+ und Mg 2+), das 5% NGS. Alternativ polyklonalen Kaninchen-Anti-Olig2 bei 1: 1000 kann für Oligodendrozyten spezifisch Normalisierung in gemischten Glia-Kulturen verwendet werden. Bereiten Sie genügend primäre Lösung 250 ul pro Vertiefung unterzubringen.
  3. Inkubieren primären Antikörpern bei 4 ° C über Nacht für 16-18 Stunden unter leichtem Schütteln Orbital.
  4. Saugen Sie das primäre Inkubation Lösung und waschen Sie die Zellen 3 x 10 min mit 500 ul D-PBS (mit Ca 2+ und Mg 2+) bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln Orbital.
  5. Während dem Waschen der Platte, bereiten die sekundäre Inkubation Lösung durch Verdünnung anti-Maus 680 und Anti-Kaninchen-800 Antikörper 1: 500 in D-PBS (mit Ca 2+ Mg 2+), das 5% NGS. Minimieren Umgebungslicht, wenn diese Lösung vor.
  6. Saugen Sie das letzte Wäsche und fügen 250 ul sekundären Inkubation Lösung. Schützen Sie die Platte aus Licht und Inkubation für 1 Stunde unter leichtem Schütteln Orbital bei Raumtemperatur.
  7. Saugen Sie das sekundäre Inkubation Lösung und waschen Sie die Wells 3 x 10 min mit 500 ul D-PBS (mit Ca 2+ und Mg 2+) bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln Orbital.
  8. Scannen der Platte ein Abbildungssystem zum Aufspüren von 700 nm und 800 nm Fluoreszenzemissionen. Als Ausgangspunkt, setzen Sie den Schwerpunkt auf 1,5 bis 3 und Empfindlichkeiten Offset für MBP, 5,0 für Actin, und 3,5 für Olig2. Passen Sie die Empfindlichkeitswerte bei Bedarf Signalüberbelichtung zu vermeiden.
  9. Quantifizieren das Ausmaß der oligodendrogenesis mit semi-automatische Software-basierten Methoden.
    1. Mit der Software, stellen Sie die Platte Analyse-Modus auf "24 Well" und richten Kreise um ter äußeren Umfang der gescannten Brunnen. Stellen Sie die Normalisierung Kanal auf "800" und exportieren Sie die Gesamtzahl und Fluoreszenzintensitäten für die 700 nm (MBP) und 800 nm (Olig2 / Actin) Kanäle.
    2. Teilen die Intensität bei 700 nm durch die Intensität bei 800 nm die normalisierte MBP-Expression in relativen Fluoreszenzeinheiten zu geben. Berechnen Sie den Durchschnitt von Wiederholungsmessungen und skaliert den Ausdruck auf den Tag 0 + PDGF Kontrollen wie für die Analyse benötigt wird.

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Representative Results

A2B5-positiven OPCs werden durch positiven Zellselektion isoliert eine magnetische Trennsäule System. Vor dem Isolierungsverfahren wird das gesamte Gehirn von Rattenjungen entfernt, die zwischen P5 und P7 sind. Sobald das gesamte Gehirn erfolgreich vom Schädel gelöst wird, werden die Riechkolben und Kleinhirn unter Verwendung von feinen chirurgischen Pinzette (1A) entfernt. Um sich durch sorgfältige Dissektion (1B) ausgeschnitten Gehirnrindengewebe der Hypothalamus, Thalamus und Mittelhirn zu isolieren. Als nächstes werden die Hippocampus und Striatum unter Verwendung gebogene chirurgische Zange (- D 1C) entfernt. Die Isolierung Prozess eliminiert effizient Hirnhaut und Fibroblasten-Zellen, aber enzymatische Verdauung verbessert wird, wenn Hirnhaut und Gefäßsystem entfernt werden (1E). Schließlich Gewebeblöcke von 1 mm x 1 mm für die nachfolgenden Gewebedissoziation Schritten hergestellt (Figure 1F).

Eine gute OPC Isolation sollte in einem kompakten Zellpellet nach der letzten Spin Stufe (2A) zur Folge haben. Sobald plattiert werden diese Kulturen von Zelltrümmern relativ frei sein, wenn sie unter einem Mikroskop (2B) angesehen. Eine suboptimale Isolierung kann durch die Gegenwart von großen Mengen von Zelltrümmern in einem großen und flauschige Pellet ergeben. Diese Ablagerungen haften stark an die PLL-beschichteten Gefäß und kann mit der Kultur (2C) stören. Wenn eine große und flauschige Pellet materialisiert, kann es helfen, die Zellen in 10 ml PBS und wiederholen Sie die letzte Spin für 10 Minuten bei <300 x g erneut zu suspendieren. Sobald die Trennung abgeschlossen ist, kann die Reinheit der Kulturen durch Durchflusszytometrie beurteilt werden, um den Prozentsatz der A2B5-positive Zellen zu identifizieren. Eine erfolgreiche Isolation in einem Pool von Zellen führen soll, die> 95% positiv für A2B5 (2D - F). Im Vergleich zu Zellen, gefärbt mit einem Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertes anti-Antikörper A2B5 sollten ungefärbte Zellen als negative Population angezeigt und kann als Referenzbasis für Gating verwendet werden. Darüber hinaus haben wir vorher, dass die Auswahl von OPC gezeigt, um die A2B5 Antigen Ausbeuten Kulturen, die durch Immunzytochemie 11 für PDGFRα positiv färben.

Es wurde der immunzytochemische gezeigt, OPCs zu Beginn der Behandlung (Tag 0) sind Olig2 + / MBP - während Zellen Olig2 + / MBP + von Tag 4 (Abbildung 3) sind. Die optimale Zusammenfließen von OPC und Oligodendrozyten an Tag 0 und Tag 4 werden in repräsentativen Hellfeld-Bilder (4A) gezeigt. Das Fehlen von MBP-Expression am Tag 0 dient als Grundlage für die Quantifizierung oligodendrogenesis. Spontane Differenzierung als Folge der PDGF-AA Abzug dient als Negativkontrolle, während 45 nM Schilddrüsenhormon (triiodothyronine; T3) als eine positive Kontrolle 11,15 verwendet werden. Quetiapin, auch Seroquel bekannt und Clemastin, auch als Tavist bekannt sind FDA-zugelassene Medikamente, die in vitro oligodendrogenesis zu beschleunigen gezeigt wurde, und können 16,17 als zusätzliche positive Kontrollen verwendet werden. 4B zeigt eine repräsentative zweikanaligen Infrarot Fluoreszenzscan die erwarteten Ergebnisse für jede dieser Bedingungen in dreifacher Ausfertigung zu demonstrieren. Actin und MBP-Signale wurden grün und rot pseudocolored jeweils so, dass sehr differenzierte Kulturen in fusionierten Bilder gelb erscheinen. Die Ergebnisse zeigen, dass MBP-Expression an Tag 4 im Zustand PDGF Rückzug betrug 4,5 ± 1,4-fach höher im Vergleich zu Tag 0, während die Falte Änderungen in MBP infolge der Behandlung mit Schilddrüsenhormon, Quetiapin, und Clemastin waren 33,9 ± 4,1, 33,4 ± 1,0 und 32,8 ± 0,5 bzw. (4C). Die Robustheit und Genauigkeit des Assays werden durch die sm zeigtenAlle Standardabweichungen unter den dreifachen Proben und das große Fenster Behandlung Aktivierung, die etwa 20 Standardabweichungen über dem PDGF Rückzug Kontrolle ist.

Während Actin als zuverlässige Bezugs Gen für die Normalisierung in Oligodendrozyten Kulturen dient, kann alternative Referenzgene ebenfalls verwendet werden. Olig2 ist ein Kerntranskriptionsfaktor, der konstitutiv in Zellen des Oligodendrozyten-Linie exprimiert wird. Seine spezifische und konstitutive Expressionsmuster so bieten kann eine gute Strategie Normalisierung in heterogenen Kultur Situationen. Abbildung 5 zeigt, dass die berechnete fache Veränderung der MBP-Expression im Vergleich zu PDGF Rückzug in OPC Kulturen differenziert mit 10 nM Schilddrüsenhormon, das gleiche ist, wenn entweder mit Olig2 oder Actin zur Normalisierung. Vermutlich weil die OPC Kulturen in diesem Experiment waren sehr rein, können beide Proteine ​​zuverlässig zur Normierung verwendet werden. Aber wir often beobachten eine kleine Population von Olig2-negativen Zellen von Tag 4, aber das Verhältnis der Bevölkerung zum Olig2-positiven Bevölkerung scheint nicht signifikant zwischen den PDGF Rückzug und T3 behandelten Gruppe zu unterscheiden. Somit sind die Wand Änderungen nicht betroffen. Bei einem Szenario, in dem eine Behandlung könnte die Proliferation von Olig2-negativen Zelltypen, die Wahl der Normalisierung Antikörper führen müssen sorgfältig abgewogen werden.

Abbildung 1
Abb. 1:. Rattenhirn-Dissektion Verfahren Schrittweise Beschreibung der Dissektion Verfahren Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Durchflusszytometrie Analyse isolierterOPCs. (A) Nach der magnetischen Säulenreinigung wird das gebundene Zellpopulation aus der Säule und zentrifugiert tauchte ein kompaktes Pellet zu bilden. Die Menge der Ablagerungen wird durch die Größe des Pellets angegeben. (B) Wenn das Pellet kompakt ist, wird Schmutz in die Kultur minimal sein. (C) Eine große und flauschige Pellet führt typischerweise zu einer Kultur mit schweren Rückständen. Die Reinheit der Kultur wird durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Ratten-anti-Maus-A2B5-Antikörper bestimmt, die auf APC konjugiert ist. (D) Tote Zellen und Trümmer werden aus der Analyse ausgeschlossen, da in Vorwärtsstreuung und Seitenstreudiagramme gezeigt. (E) Die A2B5 positiven Population kann durch Verwendung eines ungefärbten als Referenzbasis für Gating abgetastet bestimmt werden. (F) erfolgreich isoliert OPC sollte> 95% positiv für A2B5. Bitte klicken Sie hier um zu wetteifernwa größere Version dieser Figur.

Abbildung 3
Abb. 3: OPC Kultur und Differenzierung Verfahren Die Dual-Infrarot-Fluoreszenz-Scan (DIFS) Assay beginnt mit frisch isolatedA2B5-positive Ratte OPCs plattiert auf PLL-beschichteten Kulturgefäße (Tag 3). Diese Kulturen werden 3 Tage in Gegenwart von 20 ng / ml PDGF-AA vermehrt und dann mit experimentellen Faktoren in frischem PDGF-freien Medien an Tag 0. Die Behandlung Medium wird am Tag 2 vollständig aufgefüllt behandelt, und die Zellen werden fixiert mit 4% Paraformaldehyd an Tag 4. Immunzytochemie für Olig2 (grün) und MBP (rot) wurde an repräsentativen Kulturen an Tag 0 und Tag 4 durchgeführt Dapi (blau) als Kerngegenfärbung verwendet. Diese Kulturen zeigen konstitutive Färbung für die Pfanne Oligodendrozyten Abstammung Zellmarker Olig2 an den Tagen 0 und 4, während der Färbung für die reife Oligodendrozyten-Marker MBP ist nur evident von Tag 4. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: MBP Quantifizierung der Dual-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning (DIFS) -Assay (A) Die Dichte der OPC Kulturen am Tag 0 und Tag 4, die für eine optimale Testleistung mit.. (B) Repräsentative Dual-Infrarot-Fluoreszenz-Scans. OPCs wurden in Gegenwart von 45 nM T3, 1 uM Quetiapin, 1 uM Clemastin oder 0,1% DMSO in dreifacher Ausfertigung für 4 Tage in 24-Well-Platten unterschieden. Eine separate Platte OPCs enthält, die am Tag 0 (+ PDGF) wurde parallel fixiert wurden verarbeitet. Actin (pseudocolored grün) und MBP (pseudocolored rot) wurden unter Verwendung eines Licor Odyssey Scanner setzen gleichzeitig quantifiziert zu erkennen 700 nm und 800 nm-Emissionen. ( Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Olig2 ist ein zuverlässiges Referenzprotein zum Normalisieren MBP-Expression in Oligodendrozyten OPCs dreifach differenziert wurden in Gegenwart von 10 nM T3 oder 0,1% DMSO Fahrzeugsteuerung in 24-Well-Platten für 4 Tage.. Verwendung von Anti-Olig2 oder anti-Actin primären Antikörpern zur Normalisierung der Dual-Infrarot-Fluoreszenz-Scan-Test durchgeführt wurde. Olig2 / Actin und MBP wurden unter Verwendung eines Licor Odyssey Scanner setzen gleichzeitig quantifiziert zu erkennen 700 nm und 800 nm-Emissionen. MBP-Expression war nichtrmalized entweder Olig2 oder Actin-Expression, und die Ergebnisse wurden in die 0,1% DMSO Kontrolle skaliert. Die mittlere relative Fluoreszenzeinheiten ± SD wurden, aufgetragen mit GraphPad Prism 6. Die Ergebnisse zeigen, dass die berechnete fold change die gleiche ist, wenn an eine der zwei Referenz Proteine ​​normalisieren.

Abbildung 6
Fig. 6: Auswirkung von Triton X-100 auf MBP Färbung OPCs wurden für 4 Tage in Gegenwart von 45 nM T3 oder 0,1% DMSO in 24-Well-Platten unterschieden. Die Kulturen wurden dann mit 4% PFA fixiert und gefärbt für Olig2 und MBP zwei verschiedene Immunzytochemie Protokolle. Für die hohe Triton X-100 Probe wurden die Zellen für 1 Stunde mit 0,4% Triton X -100 und alle Antikörper Inkubationsschritte wurden in Gegenwart von 0,1% Triton X-100 permeabilisiert durchgeführt. Für den niedrigen Triton X-100 Probe wurden die Zellen für 1 Stunde mit 0,1% Triton X-100, während Antibo permeabilisiertdy Inkubationen wurden ohne Triton X-100 durchgeführt. Olig2 und MBP wurden mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundär und Bilder sichtbar gemacht wurden erworben Fluoreszenzmikroskop mit einem basierten Kamera. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das Protokoll hier vorgestellte beschreibt ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Isolierung von Ratten-OPCs und in vitro oligodendrogenesis in Reaktion auf experimentelle Faktoren zu quantifizieren. Mit positiven Selektion, hohe Ausbeuten an lebensfähig und rein OPCs werden direkt zu Versuchszwecken verwendet. Dieses Verfahren vereinfacht die Isolierung, Kultivierung und Differenzierung Schritte in 1-wöchige Zeitrahmen und fixierten Zellen können bequem bei 4 ° C über mehrere Wochen ohne Verlust an Assayempfindlichkeit gespeichert werden.

Ein wesentlicher Vorteil mit Scanner-basierte Fluoreszenz-Assays ist, dass die Datenerfassung und Analyse stark im Vergleich zu herkömmlichen kamerabasierten Mikroskopietechniken beschleunigt wird. Obwohl Mikroskopie erfolgreich in Hochdurchsatz-Bildschirme verwendet wurde Induktoren der OPC-Differenzierung zu identifizieren, ist die Datenerfassung von Natur aus langsamer, weil es die Programmierung von Bildaufnahmesequenzen erfordert, mehrere Stunden der Datenerhebung, Analyse von Hunderten zu thousands von Bilddateien, und benutzerdefinierte Algorithmen zur Normalisierung oder Analyse 18,19 Einzelzellkörpern zu unterscheiden. Weiterhin mit kamerabasierten Mikroskopiesysteme ist es nicht möglich, Daten von der gesamten Oberfläche des Kulturgefäßes zu erwerben. Stattdessen repräsentative Bilder müssen aus verschiedenen Bereichen innerhalb eines einzigen gut eingefangen werden, was zu Positions Bias und falsch-positive Treffer führen kann. Im Vergleich dazu erkennt dieser Test MBP Ausdruck von allen Zellen innerhalb eines genau angegebenen und mehrere Platten gleichzeitig gescannt werden. Während dieses Verfahren für die Verwendung in 96-Well oder 384-Well-Format angepasst werden, das 24-Well-Platte kann bevorzugt sein, wenn weniger Behandlungen getestet. Wir haben beobachtet, dass Zellverlust in der Platte mit 24 Vertiefungen durch Liquid-Handling minimiert wird, was eine Komplikation ist, die berücksichtigt werden sollten, wenn eine höhere Durchsatz Experimente entwerfen.

Ein kritischer Parameter des Assays ist die Dichte der Zellen, wenn Differentiation wird erscheinen mit zu wenigen Zellen am Tag 0 Kulturen initiiert langsamer und absterben zu differenzieren, während High-Density-Kulturen spontane Differenzierung aufweisen. Beide Situationen können den dynamischen Bereich und die Zuverlässigkeit des Assays verringern. eine optimale Balance zwischen Zellgesundheit und Zelldichte, wir Kultur die OPCs für 3 Tage ohne Medien Austausch oder Ergänzung von frischem PDGF-AA zu erreichen. Wir vermuten, dass, da die Konzentration von PDGF-AA in die Medien abnimmt bis zum Tag 3 in vitro (Tag 0) als Ergebnis des zellulären Katabolismus, die proliferative Rate der Zellen, so dass die Proliferation verlangsamen wird durch den ersten Tag des PDGF reduziert wird AA-Entzug. Diese Technik funktioniert am besten, wenn die Zellen während der Beschichtung gleichmäßig verteilt sind. Pipettieren der Zellen an der Seite des Brunnens und Mischen sie eine Acht enden Bewegungen sollte eine gleichmäßige Verteilung zu fördern. Pipettieren in der Mitte der auch dazu neigt Cluster von Zellen an den Rändern des Bohrlochs mit wenigen zu erzeugener Zellen zum Zentrum haften. Dieses Phänomen kann durch Unterbrechung der frisch getrocknet PLL Schicht von Flüssigkeit Pipettierkräfte. Die Ansammlung von Zellen um den Umfang kann die Assay-Empfindlichkeit reduzieren wegen der dichteabhängige Differenzierung. Es ist wichtig zu beachten, daß erhebliche Unterschiede in der Intensität der Actin / Olig2 Signal zwischen arzneimittelbehandelten und Steuerung, PDGF Entzugs Kulturen auftreten können. Deutlich verringerte Signal Actin / Olig2 Medikamententoxizität zeigen kann, während deutlich erhöht Actin / Olig2 Signal Arzneimittel-induzierte Proliferation hinweisen. Wir beobachten, normalerweise eine etwas höhere Actin / Olig2 Signal von behandelten Zellen mit pro-Differenzierung Drogen im Vergleich zu den PDGF Rückzug Kontrollen. Wir führen diesen Unterschied auf eine höhere Rate der spontanen Apoptose in der PDGF Rückzug Gruppe über die 4 Tage Differenzierung Verfahren. Wenn oligodendrogenesis Beurteilung Normalisierung der MBP zu Actin / Olig2 sollte für Zellzahl Unterschiede korrigieren. Um zu beurteilen, ToxiStadt und die Proliferation dieser Assay unter Verwendung der anti-MBP-Antikörper kann gegen den entsprechenden Marker gerichtet für primäre Antikörper ausgetauscht werden.

Wenn Experimente sowohl quantitative als auch qualitative Beurteilung erfordern, ist es wichtig, die Exposition der Fest Ratte Oligodendrozyten Kulturen Triton X-100 bei Verwendung von 4% PFA zu begrenzen, die Zellen zu fixieren. Andere Protokolle für Immunzytochemie Oligodendrozyten-Kulturen, die in der Regel umfassen Triton X-100 während sowohl der Antikörper Inkubationsschritte Antikörperepitop Zugänglichkeit zu verbessern, verwendet auf experimentellen Anforderungen erfolgreich je werden. Auf der anderen Seite, obwohl MBP ein intrazelluläres Protein ist, kann es möglich sein, Triton X-100 vollständig, wenn alternative Befestigungsmethoden eingesetzt werden, um auszuschließen, dass die Zellen ausreichend permeabilisieren. Mit den hier beschriebenen Bedingungen haben wir beobachtet, dass Triton X-100 die beobachtete Morphologie der Oligodendrozyten sowie die Lokalisierung von MBP-Färbung beeinflusstwenn sie bei hohen Konzentrationen verwendet. Wir haben keinen signifikanten Rückgang der Antikörperfärbung zu sehen, wenn Triton X-100 aus den Antikörper-Inkubation Schritte verzichtet. Wie in 6 gezeigt, einschließlich 0,4% Triton X-100 in der Permeabilisierung und Blockierungsschritt und 0,1% Triton X-100 während der Antikörper-Inkubation reduziert die Detektion von Myelin Prozesse und führt zu diskontinuierlichen MBP Färbung. Daher ist für quantitative und qualitative Bewertung kann es ausreichen, eine geringere Konzentration an Triton X-100 zu verwenden, wie hier beschrieben.

Während die Verwendung von A2B5-ausgewählten OPCs von Ratten vorteilhaft sein können, haben wir vergleichbare Ergebnisse in den Dual-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning (DIFS) Assay unter Verwendung von A2B5-ausgewählten OPCs von C57BL / 6-Mäusen beobachtet, obwohl pro Maus Zellausbeute typischerweise viel ist geringer (Daten nicht gezeigt). Andere Protokolle für OPC-Reinigung kann auch mit diesem Assay kompatibel sein. Zum Beispiel Oligodendrozyten-Marker O4 kann als Antigen verwendet werden int zu reinigenermediate Bühne Oligodendrozyten-Vorläufer mit magnetischen Kügelchen 20. Als Alternative zu Methoden Magnetbasis können OPCs von 9 Tage alten gemischten Glia-Kulturen angereichert werden 21 Astrozyten und Mikroglia durch hallo-Speed-Orbital Schütteln und unterschiedlicher Haftung Methoden enthält. Darüber hinaus Immuno-Panning Verfahren, die sowohl negative als auch positive Zellselektion übernehmen kann verwendet werden, wenn die Reinheit der Kultur über hohe Zellerträge 22 bevorzugt wird. Zusätzlich zu untersuchen, wie Therapeutika direkt der Differenzierung von OPCs in Reinkulturen erhöhen können, ist es manchmal notwendig, die indirekten Wirkungen von Arzneimitteln durch andere Zelltypen in einem Co-Kultursystem zu berücksichtigen. In MS wird die Infiltration von autoreaktiven T-Effektor-Zellen in das ZNS gedacht 23 eine Rolle bei der Progression der Krankheit zu spielen. Effektor-T-Zellen können sezernieren proinflammatorische Faktoren, die die Differenzierung von OPCs an den Standorten der Demyelinisierung hemmen kann. Es ist daher von Interesse Thera zu identifizierenpeutika, die die OPC und blockieren diese proinflammatorische Faktoren ab verschärft Verletzung kann schützen. Die DIFS Test kann für die Modellierung dieser Aktivität ideal sein, wie T-Zellen in Suspension wachsen und sich zu MBP Quantifizierung vor der Oligodendrozyten Kultur gewaschen werden. Für Co-Kultur-Studien mit anhaftenden Zellen wie Neuronen, Astrozyten und Mikroglia kann Olig2 Normalisierung eingesetzt werden, um Daten von den Oligodendrozyten spezifisch zu sammeln. So kann die Flexibilität des DIFS-Assay eine Vielzahl von experimentellen Designs erleichtern.

Abschließend dieses Protokoll eine schnelle und zuverlässige Methode bietet die oligodendrogenesis von A2B5-positiven Ratte OPCs in vitro. Diese Isolation Methode liefert durchweg hohen Ausbeuten an lebensfähigen OPC zu quantifizieren, die auf etablierten Differenzierung Signale ansprechen. Sensitive Analyse können in Multi-Well-Format Gefäße unter Verwendung einer Vielzahl von experimentellen Paradigmen durchgeführt werden, was die Nützlichkeit dieses Systems zu ma erstrecktny verschiedene Anwendungen. Darüber hinaus kann die DIFS Assay für Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening angepasst werden, oder kann verwendet werden, um Ergebnisse von Low-Throughput-Assays, wie quantitative PCR und Western-Blot zu überprüfen. Wichtig ist, kann dieses System eine einfache, aber wirksame Mittel für die Identifizierung von OPC zielgerichtete Therapien bieten bei Erkrankungen wie Multipler Sklerose demyelinisierende.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Gewähren Sponsor: National Institutes of Health; Förderkennzeichen: R37 NS041435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+ Mediatech 21-040-CV 1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes Fisherbrand 0857512
Light Dissection Microscope Motic SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628 Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1x
40 μm Cell Strainer Corning 352340
A2B5 Column Purification 
Anti-A2B5 Microbeads Miltenyi Biotec 130-097-864 Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Magnetic Selection Columns
EDTA Corning 46-034-Cl 2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1x
Bovine Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9647 0.50%
Culture Materials
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine  Sigma-Aldrich T6397 45 nM
Clemastine fumarate salt Sigma-Aldrich SML0445-100MG 1 μM
Quetiapine hemifumarate salt Sigma-Aldrich Q3638-10MG 1 μM
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165 5 μg/ml
Progesterone Sigma-Aldrich P8783 60 ng/ml
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524 10 μg/ml
Putrecine Sigma-Aldrich P7505 16 μg/ml
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261 40 ng/ml
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135 50 ng/ml
d-Biotin Sigma-Aldrich B4639 10 ng/ml
Insulin Sigma-Aldrich I6634 5 μg/ml
Apo-Transferrin Sigma-Aldrich T1147 100 μg/ml
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4161 100 μg/ml
Trace Elements B Corning 25-022-Cl 1x 
B-27 Supplement Life Technologies 17504044 1x 
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140122 1x 
DMEM Life Technologies 11995-065 1x 
24-well Black Visiplate with lid Perkin Elmer 1450-605 Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA Sigma-Aldrich 100-13A 4%
Triton X-100 Sigma-Aldrich 78787 0.10%
Normal Goat Serum Jackson Immuno Research 005-000-121 5%
mouse monoclonal anti-MBP Biolegend SMI-99P 1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin Santa Cruz Biotecnology SC-7210 1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2 Millipore AB9610 1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD Licor 926-68070 1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW Licor 926-32211 1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse Life Technologies A11032 1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit Life Technologies A11008 1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI Life Technologies P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System Licor

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References

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