एक MAPK संकेतन मार्ग के स्थानिक पुनर्गठन तंबाकू क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग इमेजिंग

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Biology

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Zhang, Y., Dong, J. Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System. J. Vis. Exp. (109), e53790, doi:10.3791/53790 (2016).

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Abstract

जीवित कोशिकाओं में गतिशील संकेत घटनाओं के दृश्य के लिए एक चुनौती रहा है। हम संयंत्र कोशिकाओं में संकेत पारगमन के स्थानिक वितरण की निगरानी के लिए एक स्थापित क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली, biomolecular फ्लोरोसेंट पूरक (BiFC) तंबाकू एपिडर्मल कोशिकाओं में परख, परीक्षण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत से विस्तार किया। इस प्रोटोकॉल में, हम को दिखाने के लिए है कि बातचीत और Arabidopsis MAPKKK योदा और MAPK6 के बीच संकेतन प्लाज्मा झिल्ली पर होते BiFC परख इस्तेमाल किया। जब पाड़ प्रोटीन BASL सह व्यक्त किया गया था, योदा-MAPK बातचीत पुनः वितरित और CFP-BASL साथ स्थानिक सह ध्रुवीकरण। इस संशोधित तंबाकू अभिव्यक्ति प्रणाली स्थानीयकरण और गतिशील परिवर्तन (कम से कम 4 दिन) और फ्लोरोसेंट प्रोटीन रंग (कम से कम तीन) के कई समायोजित कर सकते हैं संकेत के त्वरित परीक्षा के लिए अनुमति देता है। हम यह भी प्रोटीन वितरण (विषम स्थानिक स्थानीयकरण, या "ध्रुवीकरण" यों की विस्तृत तरीके प्रस्तुत;) तंबाकू कोशिकाओं में। यह उन्नत तंबाकू अभिव्यक्ति प्रणाली एक संभावित जीवित पौधे की कोशिकाओं में गतिशील संकेत घटनाओं के त्वरित परीक्षण के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाना है।

Introduction

प्रोटीन एक जटिल श्रेणीबद्ध नेटवर्क और फार्म परिसरों कि लगभग सभी जैविक एक अप्रत्याशित सेलुलर वातावरण में होने वाली प्रक्रियाओं में एक निर्णायक भूमिका निभाने के भीतर बातचीत। हालांकि, विकास जवाब करने के लिए संयंत्र के विकास के अलावा, वहाँ सुविधाजनक उपकरण है कि न केवल जल्दी लेकिन यह भी कुशलता से subcellular स्तर पर पहचान करने और इन गतिशील संकेत घटनाओं की निगरानी कर सकते की कमी की गई है।

तम्बाकू पत्ती एपिडर्मिस में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन visualizing के लिए फायदे की अपील की है। इस प्रणाली के सेमीफाइनल में विवो स्थिति है कि बाद translational प्रोटीन संशोधन और प्रोटीन स्थानीयकरण के त्वरित परीक्षा की अनुमति प्रदान करता है। पूरित YFP संकेत जांच करके, bimolecular फ्लोरोसेंट पूरक (BiFC) परख संयंत्र कोशिकाओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की संभावना बताते हैं। अन्य विधियों, जैसे, खमीर-दो संकर (Y2H) और सह की तुलना-immunoprecipitation (सह-आईपी), BiFC भी डिब्बों जहां प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत subcellular स्तर पर हो सकता है visualizing का एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है।

क्योंकि विषम कोशिका विभाजन (एसीडी) का कहना है सेल की आबादी स्टेम जबकि ऊतक / अंग गठन के लिए नए प्रकार की कोशिकाओं को पैदा करने में, यह यूकेरियोटिक बहुकोशिकता को बढ़ावा देने के लिए एक अनिवार्य प्रक्रिया है। Arabidopsis रंध्र संबंधी विकास के पौधों में एसीडी के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है। अग्रदूत सेल, meristemoid मां सेल, asymmetrically दो अलग बेटी कोशिकाओं, एक meristemoid का उत्पादन करने में बिताते हैं और एक रंध्र वंश जमीन सेल (SLGC) (विभाजन और में अंतर हो सकता है (गार्ड कोशिकाओं की एक जोड़ी में समाप्त होने से पहले सेल की तरह डिवीजनों स्टेम से होकर गुजरती है) एक फुटपाथ सेल), क्रमशः (चित्रा 1)। रंध्र एसीडी में, रंध्रीय वंश में विषमता के उपन्यास प्रोटीन तोड़कर (BASL) विभाजन विषमताओं ड्राइव करने के लिए premitotically polarized है, जो incLude शारीरिक विषमता और सेल भाग्य विषमता 1। एक MAPK MAPKKK योदा और MAPKs, MPK3 और 6 से बना झरना रंध्र विभाजन patterning और भाग्य गोद लेने 2,3, 4,5 के लिए केंद्रीय है।

हाल ही में, झांग एट अल। Arabidopsis में YDA-MAPK संकेतन मार्ग रंध्र एसीडी से 6 polarity प्रोटीन BASL जुड़ा हुआ है। विहित योदा-MAPK मार्ग, MPK3 / 6 के माध्यम से, BASL phosphorylates और उसके ध्रुवीकरण को सक्रिय करता है। एक पाड़ के रूप में फॉस्फोरिलेटेड BASL कार्यों और योदा (YDA) और MPK3 / 6 रंगरूटों एक प्रोटीन जटिल फार्म और सेल कोर्टेक्स 6 पर ध्यान केंद्रित करने का संकेत दे। MAPK घटकों और BASL और YDA-MAPK मार्ग के बीच सकारात्मक प्रतिक्रिया पाश के ध्रुवीकरण संयंत्र कोशिकाओं में प्रोटीन ध्रुवीकरण के लिए एक उपन्यास तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है। स्थानीय रूप से समृद्ध MAPK संकेतन (चित्रा 1) रंध्र एसीडी 6 में सेल भाग्य भेदभाव को बारीकी से जुड़े होने के लिए धारणा है। कश्मीर में से एकey प्रयोगात्मक डेटा है कि इस मॉडल का समर्थन किया तंबाकू assays कि BASL 6 की अभिव्यक्ति से प्रेरित MAPKs के स्थानिक पुनर्वितरण प्रदर्शन से आया है।

सामान्य तौर पर, यह आसान नहीं नजर रखने के लिए जहां MAPK संकेतन अणुओं होती है क्योंकि MAPK अक्सर एक सेल के अंदर हर जगह पाए गए है। इस अध्ययन में, हम जहां सिगनल रिले होता है सुझाव है कि नदी के ऊपर और नीचे की ओर काइनेज लोगों के बीच बातचीत कल्पना करने के लिए विभाजन YFP प्रणाली का उपयोग किया। हम आगे से BiFC प्रणाली के उपयोग को बढ़ाया सह व्यक्त एक तिहाई प्रोटीन (सीएफपी टैग) विभाजन YFP जोड़ी (प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का सूचक) के साथ कल्पना करने के लिए कि क्या और कैसे पूरित YFP स्थानिक सह द्वारा संग्राहक किया जा सकता है सीएफपी प्रोटीन व्यक्त किया। ऐसा करके, हम चाहते हैं कि तंबाकू Epiderm की सेल कोर्टेक्स पर ध्रुवीकरण करने के लिए patterning YDA और MPK6, के बीच बातचीत के स्थानिक पुनर्गठन प्रेरित भी वितरण से CFP-BASL के सह-अभिव्यक्ति का प्रदर्शनअल कोशिकाओं। इस प्रणाली इसलिए संभावित स्थितियों के तहत संयंत्र कोशिकाओं में गतिशील संकेत घटनाओं की निगरानी जब कोशिकाओं आंतरिक या बाहरी उत्तेजनाओं ने चुनौती दी है के लिए विकसित किया जाना है (जैसे, अन्य प्रोटीन, रासायनिक आवेदन, रोगज़नक़ हमले या पर्यावरण परिवर्तन, आदि के सह-अभिव्यक्ति। )।

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Protocol

1. प्लाज्मिड निर्माण

  1. प्रौद्योगिकी क्लोनिंग के रूप में पहले 1,6 वर्णित द्वारा निर्माणों उत्पन्न करता है।
    1. सबसे पहले BASL की कोडिंग दृश्यों बढ़ाना उचित प्राइमरों के साथ एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करें, YDA और MPK6 और प्रवेश वैक्टर में उन्हें उप क्लोन। 7 में विस्तृत प्रोटोकॉल का पता लगाएं।
    2. MPK6 और YDA (DNmpk6 8 और DNyda 4, क्रमशः) के प्रमुख नकारात्मक संस्करणों उत्पन्न करने के लिए, टेम्पलेट के रूप में MPK6 और YDA के प्रवेश plasmids का उपयोग करें और एक साइट निर्देशित mutagenesis विधि 9 से बिंदु उत्परिवर्तन परिचय।
  2. तंबाकू क्षणिक assays के लिए निर्माणों का निर्माण करने के लिए, मानक एलआर (attL एक्स attr पुनर्संयोजन) प्रतिक्रियाओं (7 में विस्तृत प्रक्रिया) का संचालन pH35CG 10 में BASL एकीकृत करने के लिए, DNyda और pXNGW में DNmpk6 और pXCGW क्रमश वैक्टर 11,।
    1. एंजाइम पाचन और अनुक्रमण द्वारा परिणामी plasmids की पुष्टि करें। एक बार जब एसuccessful, द्विआधारी निर्माणों को बदलने में Agrobacterium तनाव GV3101 12 tumefaciens और 2 के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर चयन प्लेटों पर उन्हें विकसित - 3 दिन।

2. एग्रोबैक्टीरियम घुसपैठ समाधान की तैयारी

  1. Luria-Bertani (पौंड) उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ के माध्यम के 10 मिलीलीटर में कुछ हौसले तब्दील एग्रोबैक्टीरियम कालोनियों टीका लगाना (Gentamycin 25 माइक्रोग्राम / एमएल, Rifamycin 25 माइक्रोग्राम / एमएल, Spectinomycin pH35CG, pXNGW और pXCGW के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल का निर्माण, एक ही सांद्रता Gentamycin और Rifamycin P19 के लिए Kanamycin 50 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ (ट्रांसजेनिक मुंह बंद करने के खिलाफ प्रोटीन व्यक्त) 13 के।
  2. के बारे में 16 घंटे के लिए 200 आरपीएम की गति से एक 28 डिग्री सेल्सियस प्रकार के बरतन में एग्रोबैक्टीरियम संस्कृतियों हो जाना और फिर 600 आयुध डिपो (1.5 तक पहुँचने का अनुमान - 1.8) को मापने (चित्रा 2A बी)। 10 मिनट के लिए 2500 XG पर संस्कृतियों स्पिन। पुनः निलंबित और वा2 MgCl 10 मिमी (घुसपैठ समाधान) के साथ सेल छर्रों एसएच।
  3. फिर संस्कृतियों स्पिन और अंतिम 600 आयुध डिपो = 0.5 (चित्रा -2 सी-डी) तक पहुँचने के लिए घुसपैठ समाधान की उचित राशि के साथ छर्रों फिर से निलंबित। 3 घंटा - पौधों घुसपैठ से पहले, 1 के लिए कमरे के तापमान पर सेल मिश्रण छोड़ दें। यह कदम सेल homeostasis को बनाए रखने में मदद करता है।

3. तंबाकू के पौधे और पत्ता इंजेक्शन

  1. पत्ती इंजेक्शन के लिए (16 घंटा प्रकाश / 8 घंटा अंधेरे के चक्र के साथ 23 डिग्री सेल्सियस) एक मानक संयंत्र विकास कक्ष में 5 सप्ताह पुराने 14 - तंबाकू के पौधों (निकोटियाना benthamiana), 4 बड़े हो गए प्रयोग करें।
    नोट: इस स्तर पर, तंबाकू के पौधों आमतौर पर 6 पत्तियों (2 बड़े, 2 मध्यम, और 2 छोटे) है। दो मध्यम आकार के पत्ते पत्ती इंजेक्शन (जबकि दो छोटे लोगों को अक्सर भी जवान हैं दो बड़े लोगों, बहुत पुराने हैं) के लिए सबसे उपयोगी हैं।
  2. घुसपैठ दिन पहले, tobac पानीसह पौधों को मिट्टी तर करने के लिए।
  3. 3 घंटा - घुसपैठ दिन, 1 के लिए अंधेरे में पौधों पूर्व सेते हैं। यह कदम जो बहुत एग्रोबैक्टीरियम की सुविधा जब पत्ती एपिडर्मल कोशिकाओं में मर्मज्ञ, एपिडर्मिस में रंध्र व्यापक रूप से खोलने के लिए अनुमति देता है।
  4. तारीखों के साथ लेबल रंग टेप के पत्तों का प्रयोग, झंडा घुसपैठ की जा सके। मार्क क्षेत्रों में एक काले रंग की मोटी sharpie के साथ घुसपैठ करने के लिए किया जा (वैकल्पिक घुसपैठ क्षेत्रों संक्रमित होने के बाद दिखाई दे रहे हैं।)।
  5. एग्रोबैक्टीरियम फिर से निलंबन के बराबर मात्रा ले लो और उन्हें कोमल घूमता (चित्रा 2 ई) द्वारा एक 100 x 15 मिमी पेट्री डिश में मिश्रण। नोट: हमारे मामले में, हम P19 के 1 मिलीलीटर CFP-BASL के 1 मिलीलीटर, DNyda-nYFP के 1 मिलीलीटर और DNmpk-cYFP के 1 मिलीलीटर के साथ मिलाया।
  6. घुसपैठ की प्रक्रिया में, घुसपैठ मिश्रण के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज भरने needleless (1 - 2 मिलीलीटर) और तंबाकू की पत्ती (चित्रा 2 एफ) के नीचे की ओर (abaxial) में धक्का। घुसपैठ है, यह उपयोगी हैपुश करने के लिए एक हाथ का उपयोग करने के लिए और दूसरे हाथ धीरे से (धक्का बल के खिलाफ adaxial,) ऊपरी पक्ष का समर्थन करने के लिए।
    नोट: एक बार घुसपैठ मिश्रण सफलतापूर्वक इंजेक्ट किया जाता है, संक्रमित क्षेत्रों एपिडर्मिस में आसानी से पहचानने योग्य हो जाएगा। हालांकि, घुसपैठ कठोर इंजेक्शन (ऊतकों को नुकसान) या अपर्याप्त धक्का (कोई तरल प्रवेश) के कारण विफल हो सकता है। प्रत्येक परीक्षा के लिए, हम दो स्वतंत्र पत्तियों में कम से कम दो इंजेक्शन (अलग पौधों से) सुझाव देते हैं।
  7. संक्रमित पौधों के विकास के चेंबर में वापस जगह है। आम तौर पर, प्रोटीन भाव के बाद 48 घंटा के बाद घुसपैठ का पता लगता है।

4. Confocal इमेजिंग

  1. (- 4 डिस्क / क्षेत्र का उत्पादन किया जा सकता है आम तौर पर 3) (चित्रा 2 जी) 48 घंटा के बाद घुसपैठ में इंजेक्शन क्षेत्र से एक पत्ता डिस्क उत्पाद शुल्क के लिए एक छेद छेदने का उपयोग करें। चिमटी का प्रयोग धीरे पानी की बूंदों के साथ एक स्लाइड (abaxial पक्ष ऊपर की ओर) के लिए पत्ती डिस्क हस्तांतरण और उन्हें माउंट करने के लिए। भी har दबाने से बचेंकवर पर्ची पर डी निचोड़ा / क्षतिग्रस्त कोशिकाओं confocal खुर्दबीन (चित्रा 2H) के तहत अच्छी तरह नहीं दिखाया जाएगा क्योंकि।
  2. confocal इमेजिंग से पहले, अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करने के लिए एक महामारी फ्लोरोसेंट यौगिक सूक्ष्मदर्शी पर घुड़सवार नमूने स्कैन। नोट: हमारे अनुभव के आधार पर, कोशिकाओं को पता चलता है कि मध्यवर्ती अभिव्यक्ति के स्तर सबसे अच्छा confocal खुर्दबीन के तहत प्रतिनिधित्व कर रहे हैं।
  3. 40X (एनए 1.3) एक confocal खुर्दबीन पर लेंस के साथ शुरू करो। इच्छित स्थान के लिए स्लाइड समायोजित करें ताकि कोशिकाओं फ्लोरोसेंट प्रोटीन का मध्यम स्तर व्यक्त केंद्र में रहते हैं। सीएफपी और YFP के लिए / उत्तेजना उत्सर्जन स्पेक्ट्रम 458 एनएम / हैं 480 - 500 एनएम और 514 एनएम / 520 - 540 एनएम, क्रमशः।
  4. पूर्वावलोकन करने के लिए छवियों तो सबसे संतुलित प्रतिदीप्ति तीव्रता / शोर अनुपात के लिए लेजर तीव्रता और स्मार्ट लाभ को समायोजित "लाइव" बटन को सक्रिय करें। इमेजिंग गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, स्कैनिंग पिक्सल और / या फ्रेम / लाइन औसत वृद्धि हुई है। अंत में, इसकी वजह करने के लिए ध्यान केंद्रित घुंडी समायोजितचर्चा मंझला फोकल हवाई जहाज़ और "कब्जा" पर क्लिक करें छवि ले।
    नोट: सीएफपी और YFP छवियों पर या "अनुक्रमिक" स्कैनिंग मोड, क्रमशः के विकल्प को बंद की जाँच करके क्रमिक रूप से या एक साथ कब्जा कर लिया जा सकता है।
  5. जेड-प्रक्षेपण कोशिकाओं का गहराई से देखने के लिए वांछित है जब, "xyz" इमेजिंग मोड का चयन, स्कैनिंग रेंज की गहराई को परिभाषित (10 - 15 माइक्रोन) और लक्ष्य सेल के ऊपर से नीचे तक छवियों को इकट्ठा । चयन झगड़ा फ़ाइलों के रूप में "नाम बदलें" और निर्यात छवियों लीका सॉफ्टवेयर छवि फ़ाइल पर राइट क्लिक करके साथ प्राप्त छवियों संकलित करें।
  6. छवि 30 - 40 मात्रा का ठहराव विश्लेषण के लिए कोशिकाओं।

5. इमेज प्रोसेसिंग और मात्रा का ठहराव विश्लेषण

  1. छवियों की प्रक्रिया और मात्रा का ठहराव का संचालन करने फिजी सॉफ्टवेयर (http://fiji.sc/Fiji) का प्रयोग करें।
    1. प्रतिदीप्ति तीव्रता रेखांकन प्लॉट।
      1. बेहतर कल्पना करने के लिए CFP / YFP अभिव्यक्ति है कि क्यासमान रूप से वितरित, सेल परिधि के साथ सीएफपी और YFP के संकेत ताकत का प्रदर्शन करने के लिए फिजी का उपयोग करें। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, पहले प्रक्षेपण फिजी तो "फाइल" और "ओपन" का चयन छवि शुरू करने के लिए। उपकरण मेनू पर "लाइन" क्लिक करें और "खंडों लाइन" का चयन राइट क्लिक करके। ब्याज के क्षेत्र तय है और सीएफपी या YFP संकेत (चित्रा 3 ए सी) का पता लगाने के लिए सेल परिधि के साथ एक रेखा खींचना।
        नोट: फिजी खंडों तर्ज पर पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्य के उपाय।
      2. स्थिति और तीव्रता मूल्यों है कि खंडों रेखा के साथ सीएफपी / YFP के स्तर पर प्रतिनिधित्व के साथ एक ग्राफ उत्पन्न करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू "विश्लेषण" और "प्लॉट प्रोफाइल" का चयन करें। अगर वांछित, तीव्रता मूल्यों नकल एक्सेल या अन्य ग्राफिक सॉफ्टवेयर में तुलनीय तीव्रता रेखांकन उत्पन्न करने के लिए (मेनू "कॉपी" का चयन करके)।
    2. polarity डिग्री यों।
      1. लगभग 20 प्रतिनिधि लीजिए3 दोहराने के प्रयोगों से गुणात्मक कोशिकाओं तंबाकू कोशिकाओं में सीएफपी और YFP के polarity डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए। polarity कम प्रतिदीप्ति तीव्रता (एल के रूप में परिभाषित) से अधिक उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता (एच के रूप में परिभाषित) के अनुपात के आधार पर डिग्री की गणना। नोट: मात्रा का ठहराव विधि चित्रा 3 में समझाया गया है।
        1. एच एल और मूल्यों को मापने के लिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से "विश्लेषण", और फिर चुनें "उपाय" पर क्लिक करें, सेल परिधि (ऊपर वर्णित) में रुचि रखते क्षेत्र के साथ एक खंडों रेखा खींचना। एक "परिणाम" खिड़की को चबूतरे, का उपयोग करें "मीन" मूल्यों मात्रा का ठहराव करने के लिए।
        2. कोशिकाओं सीएफपी और YFP, जैसे की अपेक्षाकृत वर्दी अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करने से, CFP-BASL (चित्रा 3 ए) या ​​YFP DNyda-nYFP और DNmpk6-cYFP (चित्रा 3 बी) के सह-अभिव्यक्ति से पूरित, को मापने के द्वारा एच एल और मूल्यों को प्राप्त दो बेतरतीब ढंग से बराबर लंबाई के साथ परिधीय खंडों का चयन किया।
        3. <li> कोशिकाओं फ्लोरोसेंट प्रोटीन का स्पष्ट ध्रुवीय संचय का प्रदर्शन, इस मामले में से, CFP-BASL, DNyda-nYFP और DNmpk6-cYFP (चित्रा 3 सी) के सह-अभिव्यक्ति परिधीय क्षेत्रों से एच मूल्यों समृद्ध प्रतिदीप्ति संकेतों के साथ इकट्ठा और कम / कोई प्रतिदीप्ति संचय के साथ क्षेत्रों से रास।
        4. एक साथ 20 कोशिकाओं और सामान्य वितरण के लिए परीक्षण से एच / एल के एवज में अनुपात के पूल। पी (सामान्य वितरण के लिए) छात्र टी परीक्षण द्वारा मूल्यों या Kolmogorov-Smirnov (एस) परीक्षण (गैर सामान्य वितरण के लिए) की गणना।

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Representative Results

कोशिका मृत्यु अति सक्रिय MAPK सिगनल से प्रेरित रोकने के लिए, YDA (DNyda) और MPK6 (DNmpk6) के काइनेज निष्क्रिय संस्करणों तंबाकू कोशिकाओं में सह अभिव्यक्ति परख में इस्तेमाल किया गया। न तो है और न ही BiFC CFP-BASL में ही उत्पन्न असमान वितरण पैटर्न (चित्रा 3 ए-बी) द्वारा पता चला DNyda और DNmpk6 के बीच बातचीत। हालांकि, जब CFP-BASL DNyda-DNmpk6 बातचीत जोड़ी में पेश किया गया था, दोनों सीएफपी और YFP संकेतों एक अत्यधिक ध्रुवीकृत ढंग (चित्रा 3 सी) को पुनः वितरित किया गया। इस पुनर्वितरण पता चलता है कि BASL YDA और MPK6 के साथ सूचना का आदान प्रदान स्थानिक संयंत्र कोशिकाओं में MAPK संकेतन मार्ग को फिर से व्यवस्थित करने के लिए। BASL के फोस्फोराइलेशन स्थिति MAPK सिगनल के polarity डिग्री पर अंतर प्रभाव डालता है: बहुत मजबूत polarity उत्पन्न BASL की एक phospho नकल उतार संस्करण, जबकि एक phospho की कमी संस्करण कमजोर गतिविधि 6 दिखाया। इन आंकड़ों से समर्थित एक के हमारे काम कर मॉडल BASL और सेल polarity 6 पैदा करने में YDA-MAPK मार्ग के बीच सकारात्मक प्रतिक्रिया विनियमन।

आकृति 1
चित्रा 1. रंध्रीय असममित कोशिका विभाजन Arabidopsis में (एसीडी) के दौरान BASL-YDA-MPK6 Polarity परिसर का आरेख। पत्ती एपिडर्मिस में, रंध्र वंशावली protodermal कोशिकाओं, एसीडी अग्रदूत कोशिकाओं, Meristemoid माँ कोशिकाओं बनने के लिए विस्तार से शुरू की (MMCs)। एक एमएमसी एक Meristemoid और एक SLGC (रंध्र वंश जमीन सेल) है, जो विभाजित कर सकते हैं और अंत में क्रमश: रंध्र गार्ड कोशिकाओं और फुटपाथ कोशिकाओं में अंतर पैदा करने के लिए एक एसीडी आए। एसीडी अग्रदूत साबित कोशिकाओं (MMCs) के सेल कोर्टेक्स में BASL एक MAPK मार्ग के दोनों घटकों के रंगरूटों, MAPKKK YDA और MAPK MPK6, एक polarity जटिल फार्म और विनियमित रंध्र एसीडी करने के लिए।ओम / फ़ाइलें / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. तम्बाकू पत्ती एपिडर्मिस में इंजेक्शन प्रक्रिया का आरेख। (ए) plasmids शरण CFP-BASL बदलना, DNyda-nYFP, DNmpk6-cYFP और P19 एग्रोबैक्टीरियम में GV3101 tumefaciens और (नीचे करने के लिए संबंधित चयन प्लेटों पर उन्हें विकसित ऊपर से में ए)। (बी) रातोंरात वृद्धि के लिए तरल संस्कृति टीका लगाना (ए) से कालोनियों उठाओ। कताई और सतह पर तैरनेवाला छानना द्वारा (सी) हार्वेस्ट कोशिकाओं। संक्षेप में pipetting और छर्रों धोने के बाद, फिर से कोशिकाओं नीचे स्पिन। (डी) पुनः निलंबित (प्रोटोकॉल देखें) और घुसपैठ समाधान के साथ सेल छर्रों पतला अंतिम ओवर ड्राफ्ट प्राप्त करने के लिए 600 = 0.5। (ई) धीरे मिश्रण वेंएक पेट्री डिश में ई फिर से निलंबित कोशिकाओं। (एफ) तंबाकू के पत्तों की abaxial पक्ष में घुसपैठ मिश्रण पुश करने के लिए एक needleless सिरिंज का प्रयोग करें। (G) घुसपैठ के बाद लगभग 48 घंटा, पत्ते confocal इमेजिंग के लिए तैयार हैं। आबकारी पत्ती डिस्क घुसपैठ क्षेत्र के चारों ओर एक छेद छेदने का शस्र से संक्रमित कोशिकाओं से युक्त। धराशायी हलकों छुट्टी डिस्क excised संकेत मिलता है। (एच) confocal इमेजिंग के लिए एक मानक स्लाइड पर पत्ती डिस्क माउंट करने के लिए पानी का प्रयोग करें। छायांकित क्षेत्र में बॉक्स आरेख प्रोटीन तंबाकू में इंजेक्शन ध्रुवीकरण परख के लिए छोड़ देता है का वर्णन है। प्रोटीन आकार पैमाने में नहीं हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रदर्शन और Polarity गठन की मात्रा। (एसी) Confocal छवियों तंबाकू एपिडर्मल कोशिकाओं में सीएफपी और YFP पुष्पन दिखाने के लिए। सियान सीएफपी की अभिव्यक्ति को इंगित करता है। पीला YFP की अभिव्यक्ति को इंगित करता है। (ए) CFP-BASL अकेले की overexpression। (बी) DNyda-nYFP और DNmpk6-cYFP के सह-अभिव्यक्ति। YFP अभिव्यक्ति पूरित है जब दो प्रोटीन बातचीत। (सी) CFP-BASL, DNyda-nYFP और DNmpk6-cYFP के सह-अभिव्यक्ति। असमान वितरण (polarity) दोनों सीएफपी और YFP के लिए स्पष्ट है। स्केल पट्टी (एसी) में = 50 माइक्रोन। (डीएफ) रेखांकन में धराशायी लाइनों (मैजंटा) (एसी) के साथ CFP / YFP प्रतिदीप्ति तीव्रता साजिश रचने। मैजेंटा त्रिकोण तीव्रता की साजिश रचने के लिए इस्तेमाल किया क्षेत्रों के शुरू और अंत बिंदु चिह्नित। तंबाकू की कोशिकाओं में polarity डिग्री के quantifications नीचे प्रस्तुत कर रहे हैं। पुष्पन तीव्रता के मूल्यों (उच्च और निम्न के लिए एल के लिए एच) क्षेत्रों लाल दा के साथ पता लगाया से मापा और फिजी से एकत्र कर रहे हैं(एसी) में लाइनों बहाया। प्रत्येक नमूना के लिए, 20 कोशिकाओं से मूल्यों को महत्व परीक्षण के लिए औसत रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सामान्य उपयोग और संकेत पारगमन के लिए तंबाकू क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली की संभावित संशोधनों: फ्लोरोसेंट प्रोटीन की overexpression (एफपी) तंबाकू एपिडर्मिस में प्रोटीन सफलतापूर्वक संयंत्र कोशिकाओं में प्रोटीन subcellular स्थानीयकरण के तेजी से परीक्षा के लिए इस्तेमाल किया गया है -tagged। हालांकि, संयंत्र में प्रोटीन परिसर के गतिशील संकेतन वितरण का अध्ययन जटिल subcellular संदर्भों, क्षणिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और संकेत पारगमन घटनाओं के कारण एक चुनौतीपूर्ण विषय है। इस चुनौती से निपटने के लिए, हम MAPK संकेत घटनाओं की जांच के लिए BiFC प्रणाली का फायदा उठाया। सह व्यक्त YDA-nYFP और MPK6-cYFP, द्वारा बरामद YFP संकेत संकेत दिया कि MAPK सिगनल रिले की सक्रियता के प्लाज्मा झिल्ली में उत्पन्न हो सकती है।

यह करने के लिए आदर्श होगा सह-एक्सप्रेस fluorescently YDA और MPK6 टैग की Arabidopsis और इन विवो में गतिशील MAPK सिगनल जांच करने के लिए। हालांकि, जीईट्रांसजेनिक पौधों nerating समय लेने वाली है, खासकर जब एक से अधिक निर्माणों वांछित है। तंबाकू कोशिकाओं में प्रोटीन क्षणिक अभिव्यक्ति Arabidopsis या अन्य पौधों में इन विवो अभिव्यक्ति के लिए एक त्वरित प्रारंभिक परीक्षा हो सकती है। अन्य लाभ यह है कि तंबाकू क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली प्रदान करता है, लेकिन आसानी से ट्रांसजेनिक पौधों को उत्पन्न करके हासिल नहीं किया जा सकता है, कि अप करने के लिए 4 या 5 संलयन प्रोटीन कर सकते हैं एक साथ सह व्यक्त और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच जब संयोजन से प्राप्त किया है किया जा रहा है।

तंबाकू एपिडर्मल कोशिकाओं का उपयोग संयंत्र कोशिकाओं में MAPK सिगनल जांच करने के लिए आगे अन्य संकेत दे रास्ते के लिए और विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, YDA-MAPK की बातचीत इसकी तीव्रता या स्थान को बदलने के लिए जब व्यक्त सेल स्थानीय एच 22 आवेदन (एक MAPK संकेत प्रोत्साहन) के साथ व्यवहार किया जाता है होगा? ऐसे assays जल्दी से तैयार किया जा सकता है और कल्पना को संबोधित करने के लिए प्रदर्शन कियाific प्रश्न। कई सदस्यों MAPK कैसेट के प्रत्येक स्तर में मौजूद हैं (3 - सामान्य में 4 स्तरों), लेकिन कैसे संकेत विशिष्टता पौधों या अन्य प्रणालियों में हासिल की है काफी हद तक अनजान रहते हैं। MAPKs साथ MAPKKs, या MAPKKs साथ MAPKKKs के विभिन्न संयोजनों बनाने के द्वारा, तंबाकू क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली न केवल प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का एक अपेक्षाकृत बड़े पैमाने पर विश्लेषण, लेकिन यह भी संयंत्र कोशिकाओं में संकेतन प्रवाह के स्थानिक संगठन की अनुमति देता है।

स्वनिर्धारित सह अभिव्यक्ति और BiFC परख प्रोटीन ध्रुवीकरण की जांच के लिए: एक कोशिका जीव विज्ञान में लंबे समय से मूलभूत सवाल यह है कि सार्वभौमिक संकेत दे रास्ते, जैसे, MAPKs, उनकी विशिष्टता निश्चित विकास के चरण में या विशेष रूप से पर्यावरण की स्थिति के तहत प्राप्त है। सह व्यक्त तंबाकू कोशिकाओं में YDA और MPK6 की BiFC घटकों के साथ polarity प्रोटीन BASL हमें दिखाना है कि YDA-MAPK संपर्क और संकेतन स्थानिक फिर से डी अनुमति दी गई हैBASL की उपस्थिति, रंध्र एसीडी के दौरान एक विशिष्ट polarity प्रोटीन द्वारा istributed। इसलिए, YDA-MAPK संकेत विशिष्टता BASL के साथ बातचीत के द्वारा प्राप्त किया जा सकता सेल polarity और विषम विभाजन को बढ़ावा देने के लिए।

हालांकि यह एक सार्वभौमिक घटना नहीं है, काफी कुछ प्रोटीन असमान संयंत्र कोशिकाओं में वितरित किया जाना पाया गया है जैसे, छोटे GTPase ROPs 15, auxin effluxer पिन प्रोटीन 16 और उनके नियामकों 17, बोरान ट्रांसपोर्टरों 18 और कुछ अज्ञात प्रोटीन (ऑक्टोपस 19 , ध्रुवीय 20, और BRX 21)। इस प्रोटोकॉल एक विशेष प्रोटीन ध्रुवीकरण मार्ग में आनुवंशिक या शारीरिक भागीदारों के खोज करने के लिए नहीं करना था, लेकिन संभावना का परीक्षण ROPs, पिन या अन्य लोगों के साथ बातचीत प्रोटीन संयंत्र कोशिकाओं में एक polarity जटिल रूप में हो सकता है कि क्या के लिए उपयोगी हो जाएगा। हालांकि, जब तंबाकू कोशिकाओं का उपयोग कर एक ध्रुवीकरण घटना अनुकरण करने की कोशिश कर, एक मन है कि जटिलताओं में रखना चाहिएassays में हो सकता है। उदाहरण के लिए, Arabidopsis ध्रुवीकरण घटना, तंबाकू कोशिकाओं में recapitulated नहीं किया जा सकता है विशेष रूप से जब अधिक घटकों क्या परख में शामिल किया जा सकता है की तुलना में आवश्यक हैं। कुछ अज्ञात अणुओं तंबाकू पृष्ठभूमि, जरूरी नहीं कि परीक्षा के तहत प्रोटीन से व्युत्पन्न, एक ध्रुवीकरण घटना उत्प्रेरण में शामिल किया जा सकता है। इसलिए, यह तंबाकू में सख्त नियंत्रण प्रयोगों स्थापित करने के लिए और Arabidopsis या अन्य संयंत्रों में डेटा को मान्य करने के लिए आवश्यक है।

सबसे पहले, हरे और स्वस्थ तंबाकू के पौधों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए: प्रमुख तत्वों प्रयोगों में सफल। चूंकि मात्रा का ठहराव विश्लेषण विभिन्न कोशिकाओं से डेटा पूल की जरूरत है, यह लगातार स्वस्थ कोशिकाओं के साथ तंबाकू के पौधे फल-फूल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरे, कोशिकाओं मध्यम प्रोटीन का स्तर व्यक्त confocal इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। कम अभिव्यक्ति के स्तर परख के लिए पर्याप्त प्रोटीन और संतृप्त अभिव्यक्ति एल प्रदान नहीं कर सकतेevels ध्रुवीकरण / translocation प्रभाव मुखौटा होगा।

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion DNA polymerase New England Biolabs M0530S
pENTR/D/TOPO Life Technologies K2400-20
QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit Agilent Technology 200521
LB broth AMRESCO J106-2KG
Bacto Agar AMRESCO J673-1KG
Gentamycin Sigma-Aldrich G3632-1G
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501-1G
Kanamycin Sigma-Aldrich K4000-25G
Spectinomycin Sigma-Aldrich S4014-5G
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
25 x 75 mm Slide VWR 16004-382
24 x 50 mm Cover glass VWR 48393-241
Laser scanning confocal microscope Leica  TCS SP5 II LAS AF Lite software
40X objective lens Leica HCX Plan APO  HCX Plan APO, NA 1.30
Centrifuge Thermo Scientific SORVALL 6+
Hole puncher Staples
50 ml falcon tubes Genesee Scientific 21-108
No. 5 Forceps Canemco & Marivac 205EQA-Spec

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References

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