विखंडन खमीर यौन जीवन चक्र के माइक्रोस्कोपी

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Vjestica, A., Merlini, L., Dudin, O., Bendezu, F. O., Martin, S. G. Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle. J. Vis. Exp. (109), e53801, doi:10.3791/53801 (2016).

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Abstract

Introduction

हालांकि दो कोशिकाओं के बीच आनुवंशिक विनिमय यौन प्रजनन में केंद्रीय घटना है, यह घटना है कि सेल भेदभाव को बढ़ावा देने के पार्टनर की पसंद के लिए अनुमति देते हैं, सेल सेल संलयन बाहर ले जाने और जीनोमिक स्थिरता बनाए रखने की एक श्रृंखला पर निर्भर करता है। इस प्रकार के यौन जीवन चक्र एक मॉडल प्रणाली के रूप में खुद को प्रस्तुत विकासात्मक स्विच के बारे में जैविक सवालों की एक संख्या का अध्ययन करने के लिए, बाह्य उत्तेजनाओं, प्लाज्मा झिल्ली संलयन, गुणसूत्र अलगाव, आदि विखंडन खमीर इन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए यौन चक्र की खोज के लिए प्रतिक्रिया का लाभ लाता है मॉडल प्रणाली के शक्तिशाली आनुवंशिकी, उच्च throughput दृष्टिकोण और परिष्कृत माइक्रोस्कोपी अच्छी तरह से स्थापित। विखंडन खमीर में सेक्स एक पी-सेल और विशिष्ट संभोग प्रकार के एक एम सेल के बीच एक heterotypic घटना है। दो प्रकार की कोशिकाओं के विभिन्न जीनों 1,2 स्रावित पी के उत्पादन और एम फेरोमोन, फेरोमोन रिसेप्टर्स Map3 और Mam2 के साथ ही फेरोमोन-Protea के लिए उन सहित के एक नंबर का इजहारसत्र Sxa1 और Sxa2। इस तरह के अधिक इस्तेमाल किया H90 तनाव के रूप में Homothallic में तनाव, एक एकल जीनोम में दोनों संभोग प्रकार के लिए आनुवंशिक जानकारी ले और कोशिकाओं mitotic जीवन चक्र (Ref। 3 में समीक्षा) के दौरान संभोग प्रकार स्विचिंग की एक जटिल पैटर्न से गुजरना। Heterothallic विखंडन खमीर के एकाधिक वियोजन कि शायद ही कभी या कभी स्विच संभोग प्रकार भी आमतौर पर 4 इस्तेमाल कर रहे हैं, सबसे प्रमुखता से एच + N (पी प्रकार) और एच एस (एम-प्रकार) उपभेदों।

विखंडन खमीर में, यौन जीवन चक्र में प्रवेश के सख्त पोषण विनियमन के अधीन है। केवल नाइट्रोजन की कमी से जूझ विखंडन खमीर कोशिकाओं mitotic प्रजनन की गिरफ्तारी और एक संभोग साथी की उपस्थिति का संकेत और यौन चक्र (Ref। 5 में समीक्षा) के आगे कदम को बढ़ावा देने के प्रसारण फेरोमोन उत्पादन। नाइट्रोजन के अभाव de-represses संभोग Ste11 के प्रमुख transcriptional नियामक कि एक विकासात्मक स्विच के रूप में कार्य करता है और ई को बढ़ावा देता हैफेरोमोन रिसेप्टर जीन और फेरोमोन उत्पादन 6.7 सहित विशिष्ट जीन संभोग की है xpression। फेरोमोन रिसेप्टर सगाई रिसेप्टर प्रोटीन-युग्मित जी अल्फा और नीचे की ओर MAPK संकेत दे जो आगे Ste11 ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि 8-10 को बढ़ाता है, इस प्रकार संभोग के भागीदारों के बीच एक सकारात्मक प्रतिक्रिया में फेरोमोन उत्पादन बढ़ाने को सक्रिय करता है। फेरोमोन स्तरों सेल polarity, रो-परिवार GTPase Cdc42 11 के मास्टर आयोजक विनियमन द्वारा अलग सेल ध्रुवीकरण राज्यों प्रेरित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। कम फेरोमोन सांद्रता के लिए जोखिम पर, सक्रिय Cdc42 सेल परिधि की खोज गतिशील पैच में कल्पना की है, और कोई सेल के विकास के इस स्तर पर मनाया जाता है। फेरोमोन में वृद्धि का स्तर एक ही क्षेत्र और एक ध्रुवीकृत प्रक्षेपण के विकास के लिए Cdc42 गतिविधि के स्थिरीकरण को बढ़ावा देने, Shmoo, जो संपर्क में भागीदार कोशिकाओं लाता करार दिया। इसके बाद दो अगुणित संभोग भागीदारों एक द्विगुणित युग्मनज के लिए फार्म का फ्यूज। हाल ही में काम वीं का पता चलता हैएक उपन्यास actin संरचना संलयन के लिए जरूरी है कि संभोग प्रेरित formin Fus1 12 से इकट्ठा किया जाता है की ई अस्तित्व। इस संलयन फोकस प्रकार वी मायोसिन निर्भर प्रक्रियाओं ध्यान केंद्रित है और कोशिका दीवार गिरावट मशीनरी पदों, इस प्रकार सेल 12 बिना प्लाज्मा झिल्ली संपर्क की अनुमति के लिए सेल की दीवार के पुनर्गठन की इजाजत दी। सेल सेल संलयन पर, नाभिक संपर्क में आते हैं और karyogamy गुज़रना पड़ता है। एक प्रमुख dynein निर्भर युग्मनज (घोड़े की पूंछ आंदोलन) के अंदर नाभिक के पीछे और आगे आंदोलन तो गुणसूत्र homologs 13,14, जो अर्धसूत्रीविभाजन द्वारा पीछा किया जाता है की जोड़ी को बढ़ावा देता है। अंत में, चार उत्पादों अर्धसूत्रीविभाजन के sporulation दौरान अलग-अलग बीजाणुओं में पैक कर रहे हैं।

इसकी जटिलता और कई शामिल कदम की वजह से, संभोग की विस्तृत निगरानी चुनौती रहा है। दो उल्लेखनीय कठिनाइयों है कि पूरी प्रक्रिया को अच्छी तरह से पंद्रह घंटे से अधिक लेता है और कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि कर रहे हैं। ये घifficulties एकल कोशिका माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण से धोखा कर रहे हैं। यहाँ एक सामान्य प्रोटोकॉल की जांच करने के विखंडन खमीर में यौन जीवन चक्र प्रस्तुत किया है। मामूली समायोजन के साथ, इस प्रोटोकॉल की प्रक्रिया के सभी विभिन्न चरणों, अर्थात् संभोग जीन उत्पाद, सेल ध्रुवीकरण और गैर-बहन के भागीदारों संभोग प्रकार बदलने के बाद भी बहन-कोशिकाओं के बीच और के बीच बाँधना, सेल सेल संलयन की प्रेरण के अध्ययन के लिए परमिट, और बाद संलयन घोड़े की पूंछ आंदोलन, अर्धसूत्रीविभाजन और sporulation। इस विधि 1 की अनुमति देता है) आसानी से कल्पना fluorescently समय पूर्व खत्म टैग प्रोटीन, दौरान और बाद संलयन; 2) विपरीत संभोग प्रकार की कोशिकाओं के व्यवहार भेदभाव; और 3) उपाय और इस तरह के shmooing, संभोग, फ्यूजन या sporulation दक्षता के रूप में मानकों यों।

Protocol

विखंडन खमीर यौन प्रजनन के माइक्रोस्कोपी विश्लेषण

1. मीडिया तैयारी

  1. ग्लूकोज: 10 जी / एल, के.एच. 2 पीओ 4: 1 जी / एल, सोडियम क्लोराइड: निम्नलिखित घटकों के मिश्रण से न्यूनतम Sporulation मध्यम (एमएसएल-एन) 15 तैयार 0.1 ग्राम / एल, MgSO 4 · 7H 2 हे: 0.2 ग्राम / एल जोड़े तत्वों का पता लगाने (10,000): 100 μl / एल, विटामिन (1,000x): 1 मिलीग्राम / एल, और 0.1 एम 2 CaCl   मिलीग्राम / एल। कमरे के तापमान (आरटी) में 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर और दुकान का उपयोग कर फ़िल्टर बाँझ।
    1. निम्न विटामिन का उपयोग करें (1,000x) स्टॉक: Pantothenate: 1 जी / एल, निकोटिनिक एसिड: 10 जी / एल, Inositol: 10 जी / एल, बायोटिन: 10 मिलीग्राम / एल। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर और दुकान का उपयोग कर फ़िल्टर बाँझ।
    2. बोरिक एसिड: 5 ग्राम / एल, MnSO 4: 4 जी / एल, ZnSO 4 · 7H 2 हे: 4 जी / एल, FeCl 2 · 6H 2 हे: 2 जी / एल निम्नलिखित तत्वों का पता लगाने (10,000) स्टॉक का प्रयोग करें , Moo 3: 0.4 ग्राम / एल, Ki: 1 जी / एल, CuSO 4· 5H 2 हे: 0.4 ग्राम / एल, साइट्रिक एसिड: 10 जी / एल। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर और दुकान का उपयोग कर फ़िल्टर बाँझ।
  2. agarose की 0.2 ग्राम के साथ एमएसएल-एन के 10 मिलीलीटर के संयोजन से एमएसएल-एन agarose तैयार 2% (agarose पैड कक्षों बनाने के लिए इस्तेमाल किया)। ~ 2 agarose घुल और microcentrifuge ट्यूब में विभाज्य 0.5 मिलीलीटर तक एक माइक्रोवेव ओवन में उच्च शक्ति में मिनट के लिए पिघला। आरटी पर स्टोर।
  3. 1 जी / एल, leucine: 0.225 जी / एल, Adenine: 0.225 जी / एल, Uracil: जोड़ने (एनएच 4) 2 अतः 4 से नाइट्रोजन एमएसएल-एन से (एमएसएल + एन) के साथ न्यूनतम Sporulation मध्यम तैयार 0.225 छ / एल । एक 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर बाँझ। आरटी पर स्टोर।
    नोट: leucine, एडेनाइन और uracil इस माध्यम से जुड़ जाते हैं auxotrophic उपभेदों के विकास की अनुमति है। अगर इस्तेमाल तनाव एक अलग auxotrophy (उदाहरण के लिए his3Δ) किया जाता है अतिरिक्त अमीनो एसिड के पूरक शामिल किया जाना चाहिए। कृपया ध्यान दें यह भी पूरी तरह से prototroph उपभेदों के साथ कि काम के रूप में ही की सिफारिश की हैऐसे उपभेदों उच्च दक्षता संभोग की अनुमति देगा।
  4. चैम्बर सील के लिए 200 मिलीलीटर VALAP तैयार करें। एक बीकर में लानौलिन, वैसलीन (या अन्य पेट्रोलियम जेली), और आयल के बराबर वजन जोड़ें। कम तापमान पर हीट मिश्रण है और कभी कभी हलचल जब तक अच्छी तरह से मिश्रित। कई छोटे पेट्री डिश में मिश्रण विभाज्य। आरटी पर स्टोर।

2. संभोग प्रयोगों के लिए संवर्धन विखंडन खमीर उपभेदों (चित्रा 1)।

  1. 1 दिन, शाम:
    एमएसएल + एन के 3 मिलीग्राम से युक्त संस्कृति ट्यूबों में ठोस मीडिया से हौसले से परेशान उपभेदों टीका लगाना। के बारे में 2.5 सेमी व्यास का फ्लैट नीचे ट्यूब का उपयोग करें। अनुकूलित संस्कृति की मात्रा के साथ अन्य संस्कृति ट्यूब या बोतल का प्रयोग करें। रातोंरात सेते (ओ / एन) 25 डिग्री सेल्सियस, 200 rpm पर झटकों के साथ। heterothallic उपभेदों के साथ काम कर रहे हैं, तो अलग से टीका लगाना।
    1. मीडिया में सेल निलंबन पतला निम्नलिखित सुबह सुनिश्चित करने के लिए संस्कृतियों ऑप्टिकल घनत्व शाम को 0.4-0.8 के 600 एनएम (600 आयुध डिपो) में मापा जाता है।
      ध्यान दें:आयुध डिपो विखंडन खमीर के लिए सेल एकाग्रता की एक प्रॉक्सी के रूप में 600 माप लगभग 0.1-1.0 की रेंज में रैखिक रहे हैं। हमारे स्पेक्ट्रोफोटोमीटर आयुध डिपो के लिए 600 = 0.1 मिलीग्राम प्रति 1.4 x 10 6 कोशिकाओं से मेल खाती है। इस प्रकार, यदि प्रारंभिक आयुध डिपो के 600 पढ़ता इस रेंज के नमूने पतला होना करने के लिए / विश्वसनीय माप के लिए केंद्रित की जरूरत है बाहर हैं।
  2. 2 दिन, शाम:
    100 मिलीलीटर बोतल में 600 = 0.025 ओवर ड्राफ्ट के लिए एमएसएल + N मीडिया के 20 मिलीलीटर में कोशिकाओं पतला। 30 डिग्री सेल्सियस, 200 rpm पर उपभेदों हे / एन सेते हैं।
    नोट: जंगली प्रकार सेल संस्कृतियों आयुध डिपो 600 ~ 0.8 निम्नलिखित सुबह (15 घंटा के बाद) तक पहुंच जाना चाहिए। तो अब पीढ़ी समय के साथ उपभेदों के साथ काम करने के हिसाब से कमजोर पड़ने समायोजित करें।
  3. 3 दिन, सुबह:
    आयुध डिपो के 600 मापने की पुष्टि है कि संस्कृतियों आयुध डिपो 600 ~ 0.8 की सेल घनत्व है। heterothallic उपभेदों के साथ काम कर रहे हैं, तो साथी कोशिकाओं के बराबर संख्या मिश्रण। 1,000 XG और एक 1.5 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण पर गोली कोशिकाओंट्यूब। एमएसएल-एन के माध्यम से 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं तीन बार धोएं। एमएसएल-एन के माध्यम के 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और 600 = 1.5 ओवर ड्राफ्ट के लिए कोशिकाओं को कमजोर।
    1. बहन की कोशिकाओं के बीच संभोग की निगरानी के लिए सीधे इमेजिंग के लिए कोशिकाओं माउंट (प्रोटोकॉल धारा 2.4 देखें)। Homothallic H90 में तनाव, जिसमें संभोग प्रकार स्विचिंग नाइट्रोजन के अभाव के बाद होने वाली mitotic डिवीजनों के दौरान जगह ले जाएगा का प्रयोग करें। agarose पैड पर कोशिकाओं के तत्काल बढ़ते सुनिश्चित करता है कि, कोशिका विभाजन के बाद, बहन-कोशिकाओं को एक दूसरे के बगल में बने हुए हैं।
    2. सेल ध्रुवीकरण (खोजपूर्ण गतिशीलता और shmooing) की निगरानी करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, इमेजिंग के लिए 3-4 घंटा के बढ़ते कोशिकाओं से पहले के लिए 200 rpm पर सेल संस्कृति के 1-3 मिलीलीटर सेते हैं। इन 3-4 घंटा के भीतर, पिछले mitotic विभाजन हुआ होगा। कुछ कोशिकाओं ध्रुवीकरण शुरू कर दी है, लेकिन सबसे सिर्फ अपने खोजपूर्ण ध्रुवीकरण गतिशीलता शुरू हो जाएगा।
    3. निगरानी करने के लिए सेल सेल फ्यूजन 30 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति के 1-3 मिलीलीटर सेते, 4-6 घंटा के प्राथमिक के लिए 200 आरपीएमया इमेजिंग के लिए कोशिकाओं बढ़ते करने के लिए।
    4. नजर रखने के लिए पोस्ट-संलयन घटनाओं 30 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृतियों के 1-3 मिलीलीटर, इमेजिंग के लिए कोशिकाओं बढ़ते से पहले 8 घंटे के लिए 200 आरपीएम सेते हैं।
    5. एक विशिष्ट फेरोमोन एकाग्रता (केवल heterothallic उपभेदों के लिए) के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति के 3 मिलीलीटर सेते, 3-4 घंटे के लिए 200 आरपीएम इमेजिंग के लिए कोशिकाओं बढ़ते से पहले।
      1. 95 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक से एमएसएल-एन-युक्त microcentrifuge ट्यूब निकालें (प्रोटोकॉल खंड 2.4.1 देखें। नीचे)। पिघल एमएसएल-एन agarose में सीधे वांछित एकाग्रता में पी-कारक या एम-कारक जोड़ें। तत्काल पैड तैयारी से पहले vortexing द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
      2. सेल बढ़ते के बाद, इमेजिंग के लिए पहले 25 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए पैड सेते हैं। पी-कारक और एम कारक फेरोमोन मेथनॉल में 1 मिलीग्राम / एमएल के एक शेयर समाधान से इस्तेमाल किया गया।
        नोट: उत्परिवर्ती साथ काम कर रहे हैं तनाव ऊष्मायन बार भिन्न हो सकते हैं। कोशिकाओं के clumping तरल मीटर में लंबे समय तक ऊष्मायन के बाद हो सकता हैedia और कुछ उत्परिवर्ती उपभेदों में विशेष रूप से मजबूत हो सकता है। Clumped कोशिकाओं एक परत में agarose पैड पर देखा नहीं जा सकता है और इस तरह ऑटोफोकस और छवि के लिए मुश्किल हो जाता है। व्यापक सेल clumping के मामले में तुरंत washes के बाद agarose पैड पर कोशिकाओं माउंट और फिर से निलंबन नाइट्रोजन की कमी मीडिया में (प्रोटोकॉल धारा 2.3.1 के रूप में।) और इमेजिंग के लिए पहले 30 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं।
  4. इमेजिंग के लिए कोशिकाओं बढ़ते:
    1. 10-15 मिनट के लिए एक 95 डिग्री सेल्सियस गर्मी-ब्लॉक में एक विभाज्य पिघलने और दो ​​गिलास स्पेसर (चित्रा 1 बी) के द्वारा अलग स्लाइड्स के बीच 200 μl जोड़कर एमएसएल-एन agarose पैड 16 तैयार करें। ~ 0.5 मिमी की मोटाई के साथ स्पेसर का प्रयोग करें। spacers बनाने के लिए, उपयोग स्ट्रिप्स ऐसे प्रतिबंध एंजाइमों के साथ दिया कि के रूप में, गत्ते के बाहर काटा।
    2. 1 मिनट के लिए 1,000 XG पर कोशिकाओं के 100 μl गोली, तैरनेवाला निकालें और अवशिष्ट 2-4 μl माध्यम से कोशिकाओं को फिर से निलंबित। ताजा माध्यम में नहीं करना फिर से निलंबित रूप में यह देरीसंभोग।
    3. 2-3 मिनट बाद सावधानी से spacers और शीर्ष गिलास स्लाइड को हटा दें। कई उपभेदों रखा जा करने के लिए कर रहे हैं, सेल तैयार agarose पैड तैयार करने से पहले केंद्रित है।
    4. पैड के लिए कोशिकाओं की 1 μl जोड़ें और जब तक ड्रॉप (~ 1 मिनट) कवर पर्ची के साथ कवर और VALAP साथ सीलिंग से पहले सूखने शुरू होता है इंतजार।
    5. पैड 25 डिग्री सेल्सियस या आरटी पर इमेजिंग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए बैठते हैं।
    6. संभोग के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं का एक मिश्रण प्राप्त करने के लिए, एम एस एल-एन (खंड 2.3 देखें।) में washes के बाद तुरंत एक पैड बनाने के लिए और 18 डिग्री सीओ / एन (~ 15 घंटा) पर सेते हैं। यह दृष्टिकोण उच्च अस्थायी समाधान या कमजोर संकेत के साथ नमूनों के साथ संभोग अलग चरणों में इमेजिंग कोशिकाओं के लिए उपयोगी है।

संभोग खमीर कोशिकाओं के 3. लाइव सेल इमेजिंग

  1. छवि अधिग्रहण सेटिंग्स समायोजित करें।
    नोट: छवि अधिग्रहण यहाँ प्रस्तुत सेटिंग्स DeltaVision एक स्वनिर्धारित ओलिंप नौवीं -71 से बना मंच के लिए अनुकूलित किया गयायोजना ए पी ओ 60X / 1.42 एनए या यू-योजना ए पी ओ 100X / 1.4 एनए उद्देश्यों, एक CoolSnap HQ2 कैमरा और एक इनसाइट एसएसआई 7 रंग संयुक्त इकाई प्रकाशक के साथ उलटा माइक्रोस्कोप। हार्डवेयर softWoRx v4.1.2 भी है कि डिजिटल autofocusing सक्षम बनाता है के द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
    1. सुनिश्चित करें कि autofocusing के अंतराल के बाद से अब समय के साथ जेड बहाव सॉफ्टवेयर autofocusing प्रणाली की क्षमता को पार कर सकते हैं 15 मिनट से अधिक नहीं है। अगर एक हार्डवेयर आधारित autofocusing प्रणाली का उपयोग कर, बड़े अंतराल का उपयोग करें।
    2. इमेजिंग अंतराल को समायोजित करें। ~ के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में 15 घंटा छवियों हर 10 मिनट ले लो जब एक साथ fluorescently पहली बार के लिए टैग प्रोटीन काम कर रहे। इस अंतराल व्यापक विरंजन के बिना पूरे संभोग की प्रक्रिया का एक अच्छा सिंहावलोकन प्रदान करता है।
      1. 5 मिनट के अंतराल में इस तरह के संलयन के रूप में और अधिक ठीक समय की घटनाओं के लिए या छोटे के साथ छवि। कम अंतराल मजबूत fluorophores कम जोखिम बार और थोड़ा विरंजन को सक्षम करने की आवश्यकता है। 1 मिनट से बचने हे / एन माइक्रोस्कोपी नीचे अंतराल के साथ इमेजिंग के लिएऔर इसके बजाय सभी संभोग चरणों की एक मिश्रण के रूप में प्रोटोकॉल धारा 2.4.6 में विस्तृत तैयार करते हैं।
    3. छवि जोखिम समय समायोजित करें। 50 और 300 मिसे के बीच टेस्ट जोखिम बार। के रूप में एक discernable संकेत (आमतौर पर 100 से अधिक) के साथ समय अंक की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए संकेत करने वाली शोर अनुपात और photobleaching के बीच एक संतुलन कायम करने के लिए निशाना लगाओ।
    4. जेड सेक्शनिंग समायोजित करें। धारा 0.3 माइक्रोन को कवर हर 5 माइक्रोन एक अच्छा इमेजिंग गहराई प्रदान करते हैं। ध्यान दें कि जेड सेक्शनिंग आगे बढ़ जाती है तस्वीर क्षति है, जो OAI (ऑप्टिकल अक्ष एकीकरण - कुल नमूना गहराई का एक भी झाडू अधिग्रहण) का उपयोग करके कम किया जा सकता है। अच्छा ऑटो फोकस प्रणाली कई Z-वर्गों के लिए आवश्यकता कम कर देता है और अत्यधिक की सिफारिश की है।
  2. सुझावों का अध्ययन करने के लिए संभोग प्रकार विशिष्ट व्यवहार:
    1. Heterothallic उपभेदों के लिए, का उपयोग करें और एच एच + कोशिकाओं, अलग fluorophores व्यक्त ताकि दो प्रकार की कोशिकाओं प्रतिष्ठित किया जा सकता है। किसी भी आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluoropho का प्रयोग करें, एक साइटोसोलिक संस्करण या एक अंतर्जात प्रोटीन को फ्यूजन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, हालांकि हम sfGFP, GFP 17 साल की एक तेजी से तह संस्करण के साथ अच्छी सफलता मिली है। अंतर्जात प्रोटीन आमतौर पर मुताबिक़ पुनर्संयोजन 14 के द्वारा अपने अंतर्जात जीनोमिक ठिकाना पर टैग कर रहे हैं।
    2. Homothallic उपभेदों के लिए, संभोग प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग साइटोसोलिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन ऐसे रिसेप्टर जीन फेरोमोन map3 और mam2 के उन लोगों के रूप में पी और एम कोशिकाओं में अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए क्रमश: व्यक्त करते हैं। Map3 और mam2 के प्रमोटरों वनस्पति के विकास के दौरान निष्क्रिय हैं और नाइट्रोजन भुखमरी 18,19 पर प्रेरित कर रहे हैं। इन प्रमोटरों के नियंत्रण में साइटोसोलिक GFP या mCherry की अभिव्यक्ति ड्राइविंग निर्माणों आम तौर पर एक जीनोमिक ठिकाना (ura4, leu1) है कि यौन जीवन चक्र 12 की सामान्य प्रगति के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है पर एकीकृत कर रहे हैं।
    (प्रोटोकॉल धारा 3.2.2 के रूप में) का प्रयोग संभोग प्रकार विशिष्ट साइटोसोलिक fluorophores दूसरे के लिए एक साथी के सेल से फ्लोरोसेंट संकेत के हस्तांतरण के रूप में कल्पना की सेल संलयन की सटीक समय निर्धारित करने के लिए।

4. संभोग और फ्यूजन क्षमता की मात्रा

  1. बाद सीधे एमएसएल-एन संभोग और फ्यूजन क्षमता 11,12, मौके कोशिकाओं यों, एमएसएल-एन agarose पैड पर धो ऊपर चरण 2.3.1 के रूप में, और 25 डिग्री सेल्सियस से पहले इमेजिंग (चित्रा 1 ए) में 24 घंटे के लिए छोड़ दें। इस प्रोटोकॉल एक homothallic जंगली प्रकार के तनाव संभोग दक्षता पहुंचता है ~ 60% और 99% संलयन दक्षता का उपयोग करना। इन मूल्यों उत्परिवर्ती उपभेदों में मनाया में कोई कमी एक टर्मिनल phenotype या देरी को प्रतिबिंबित कि क्या परीक्षण करने के लिए, एक 36 घंटा ऊष्मायन समय के साथ प्रयोग को दोहराने।
  2. के रूप में संभोग दक्षता की गणना Equation1 संभोग जोड़े युग्मनजों, एएससीआई, और unfused सेल जोड़े से पहचान में शामिलउनकी स्थिति और एक दूसरे के प्रति विकास।
  3. के रूप में संलयन दक्षता की गणना Equation2
    नोट: इनकार संभोग जोड़े यदि यह ज्ञात है कि अध्ययन के तहत उत्परिवर्ती sporulation को प्रभावित नहीं करता बीजाणुओं फार्म के लिए उनकी क्षमता से पहचाने जाते हैं। sporulation पढ़ने के लिए बाहर के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, तो संलयन दोनों भागीदारों में केवल एक संभोग साथी में व्यक्त एक साइटोसोलिक मार्कर के प्रसार के अवलोकन से निर्धारित होता है।

Representative Results

विखंडन खमीर विकास और संभोग गतिशीलता एक नाइट्रोजन स्रोत के हटाने पर
नाइट्रोजन भुखमरी विखंडन खमीर में यौन प्रजनन की दीक्षा के लिए एक शर्त है, जंगली प्रकार homothallic H90 तनाव नाइट्रोजन युक्त नाइट्रोजन वंचित मध्यम (चित्रा 2) से बदलाव पर नजर रखी थी, प्रोटोकॉल चित्रा 1 में उल्लिखित निम्नलिखित। संक्षेप में, कोशिकाओं , एम एस एल एन + माध्यम में घातीय चरण (600 आयुध डिपो = 0.5) के लिए हे / एन बड़े हो रहे थे एकत्र, धोया और अंतिम 600 आयुध डिपो = 1.5 एमएसएल-एन तरल माध्यम में फिर से निलंबित कर दिया। कोशिकाओं के हर 2 घंटा aliquots थे calcofluor से सना हुआ और imaged (चित्रा 2A - डी)।

Calcofluor धुंधला (2A चित्रा) से पता चला है कि नाइट्रोजन युक्त मध्यम में ~ कोशिकाओं के 21% septating थे (एन> 300, चित्रा 2 बी) और प्रखंड में है कि औसत सेल लंबाईसायन 15.2 ± 1.4 माइक्रोन (एन = 50, चित्रा -2) था। गैर विभाजित कोशिकाओं सेल लंबाई की एक व्यापक वितरण (; n> 200, चित्रा 2 डी 8-14 माइक्रोन) से पता चला है। हालांकि, एम एस एल एन मध्यम करने के लिए बदलाव के बाद दो घंटे वहाँ से कम 9 माइक्रोन (एन> 200, चित्रा 2 डी) किया जा रहा कोशिकाओं के 60% से अधिक के साथ गैर विभाजित कोशिकाओं की लंबाई के वितरण में भारी बदलाव किया गया था। सेल दो भागों में विभाजित भी 9.8 ± 0.8 माइक्रोन (एन = 50, चित्रा 2A, 2 सी) की कम लंबाई में खोजा गया था। दोनों गैर विभाजित है और कोशिकाओं को विभाजित करने की लम्बाई में और कमी भी समय के रूप में मनाया गया था एमएसएल-एन में वृद्धि हुई है। दरअसल, 8 घंटे के बाद दो भागों में विभाजित संस्कृति का सूचकांक 2% (एन> 300) नीचे की कमी हुई और कोशिकाओं के 85% से अधिक लंबाई में कम से कम 7 माइक्रोन (एन> 200, चित्रा 2 डी) में अपने सेल चक्र को गिरफ्तार कर लिया।

कोशिकाओं तरल एमएसएल-एन को पारी के बाद चार घंटे जोड़े संभोग फार्म शुरू कर दियामध्यम (<1%, चित्रा 2A)। इसके बाद संभोग जोड़े की संख्या तेजी से वृद्धि हुई है और बाद कोशिकाओं की पारी 10% 8 घंटे एक संभोग साथी लगे (एन> 200, चित्रा 2 बी)।

संभोग गतिशीलता की निगरानी करने के लिए, भुखमरी शामिल होने के बाद 6 घंटा, कोशिकाओं के एक विभाज्य भी इमेजिंग के लिए एमएसएल-एन agarose पैड पर रखा गया था। कोशिकाओं को किसी भी स्पष्ट synchrony (मूवी एस 1) के बिना बाद में 21 घंटे में shmooing, फ्यूजन और sporulation (चित्रा 2 ई, 2 एफ) कराना पड़ा। संभोग दक्षता देखने का एक भी क्षेत्र में रिश्तेदार की स्थिति और कोशिकाओं के घनत्व पर निर्भर है, कोशिकाओं के 60% से अधिक के साथ एक साथी जब एक monolayer (चित्रा 2 जी और मूवी एस 1) में घनी तैनात लगे हुए हैं।

जंगली प्रकार heterothallic ज + और ​​एच विखंडन खमीर उपभेदों भी एक साथ एक ही प्रोटोकॉल के अधीन थेनाइट्रोजन हटाने के समय में एक से एक-से-एक अनुपात में एच + और ​​एच कोशिकाओं मिश्रण के एन अतिरिक्त कदम है। इसी भुखमरी और संभोग गतिशीलता मनाया गया, लेकिन संभोग दक्षता थोड़ा कम था (चित्रा 2 जी, मूवी S2)।

संभोग विखंडन खमीर कोशिकाओं में fluorescently टैग प्रोटीन की गतिशीलता निगरानी
कोशिकाओं में संभोग के प्रकार के वी मायोसिन Myo52 (रेफरी 20) गतिशीलता की निगरानी करने के लिए, तेजी से बढ़ी एच मूल निवासी लोकस से Myo52-3GFP व्यक्त कोशिकाओं ज + कोशिकाओं इसी तरह पी से Myo52-tdTomato, साथ ही साइटोसोलिक व्यक्त GFP के साथ मिलाया गया विशिष्ट map3 प्रमोटर सेल। सेल निलंबन धोया गया था, एम एस एल एन माध्यम में पतला और 30 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए incubated, बढ़ते कोशिकाओं के लिए 200 आरपीएम पहले 10 मिनट के अंतराल पर हे / एन इमेजिंग के लिए एमएसएल-एन agarose पैड पर।

जैसा कि पहले 11,1 सूचना दी2 Myo52 सेल कोर्टेक्स के दौरान शुरू में गठित गतिशील क्षेत्र (चित्रा 3 ए, तीर और मूवी S3)। Myo52 संकेत तो एक ही ध्यान केंद्रित में स्थिर हो गया था (चित्रा 3 ए, तीर और मूवी S3) सिर्फ संलयन घटना है, जो से + एच सेल में साइटोसोलिक GFP संकेत के हस्तांतरण से पहले कल्पना की गई थी (चित्रा 3 ए और मूवी S3) । Myo52-tdTomato संकेत भी अपने विस्तार के दौरान संलयन गर्दन पर मनाया जा सकता है, लेकिन रूप में युग्मनज sporulation (चित्रा 3 ए और मूवी S3) के लिए रवाना हुए कोई discernable संकेत स्पष्ट हो गया था।

बाहरी फेरोमोंस को उजागर Heterothallic विखंडन खमीर कोशिकाओं के व्यवहार की निगरानी
Heterothallic एच Sxa2 प्रोटीज कि desensitization के लिए P-कारक degrades कमी कोशिकाओं को आसानी से सिंथेटिक पी-फैक्टर का जवाब। एक एच sxa2Δ तनाव, Scd2-GFP सक्रिय Cdc42 11 के लिए एक मार्कर के रूप में व्यक्त करने, तदनुसार वर्णित प्रोटोकॉल के लिए एमएसएल + N माध्यम में हो गया था। प्रकोष्ठों एमएसएल-एन के माध्यम में धोया और 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए incubated रहे थे। एमएसएल-एन agarose मेथनॉल (नहीं दिखाया डेटा), 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल (कम फेरोमोन, चित्रा 3 बी) या 1 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त पैड (उच्च फेरोमोन, चित्रा -3 सी) पी-कारक के तैयार किए गए थे, कट और एक नई स्लाइड पर तैनात अलग फेरोमोन मात्रा युक्त मिनी पैड उत्पन्न करते हैं। सेल निलंबन के 0.5 μl 5 मिनट के अंतराल पर हे / एन इमेजिंग के लिए प्रत्येक मिनी पैड पर रखा गया था।

परिणाम प्रकाशित 11 के साथ सामंजस्य में, कम पी-कारक के स्तर, विकास (चित्रा 3 बी, मूवी S4) के बिना गतिशील Scd2 क्षेत्रों के गठन पदोन्नत पी-कारक के उच्च स्तर पर एक भी Scd2 क्षेत्र स्थिर है, जबकि, इस प्रकार एक सेल पोल से Shmoo बढ़ाव उत्प्रेरण (एफigure -3 सी, मूवी S5)।

आकृति 1
चित्रा 1:।। प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (ए) के विखंडन खमीर यौन जीवन चक्र और (बी) की निगरानी के लिए लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए विखंडन खमीर नमूने तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध विवरण यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 2
चित्रा 2:। विकास और से एमएसएल + N एमएसएल-एन मीडिया में स्थानांतरित कर दिया विखंडन खमीर कोशिकाओं के संभोग गतिशीलता calcofluor से सना हुआ कोशिकाओं के (ए) Epifluorescence micrographs समय की अवधि के लिए संकेत दिया एमएसएल-एन मीडिया के लिए स्थानांतरित कर दिया। (बी) प्रतिशतseptating के (अंधेरे-नीली रेखा, एन> 300 timepoint प्रति) और संभोग (प्रकाश नीली रेखा, एन> 300 timepoint प्रति) कोशिकाओं समय की अवधि के लिए संकेत दिया एमएसएल-एन मीडिया के लिए स्थानांतरित कर दिया। Septating कोशिकाओं (सी) औसत लंबाई के समय संकेत दिया अवधि (एन = 50 timepoint प्रति छोड़कर 8 घंटा timepoint जहाँ n = 20) के लिए एमएसएल-एन मीडिया के लिए स्थानांतरित कर दिया। (डी) गैर विभाजित कोशिकाओं की लंबाई के वितरण के समय का संकेत दिया अवधि (एन> timepoint प्रति 200) के लिए एमएसएल-एन मध्यम करने के लिए स्थानांतरित कर दिया। (ई) unfused (अंधेरे-नीली रेखा) का औसत अंश, जुड़े (प्रकाश नीली रेखा) और H90 प्रकार के जंगली खमीर की आबादी में (काला लाइन) sporulating कोशिकाओं समय की अवधि के लिए संकेत दिया एमएसएल-एन मीडिया के लिए स्थानांतरित कर दिया और timepoint 6 घंटा (तीन अलग-अलग timelapses से timepoint प्रति n> 900 कोशिकाओं) पर एक अगर पैड पर मुहिम शुरू की। कोशिकाओं में जुड़े हुए जब भागीदारों के बीच कोई अपवर्तनांक कोशिका दीवार डीआईसी micrographs और बीजाणु सेल की दीवार के गठन में दिखाई सपा के लिए स्कोर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था विचार किया गयाकोशिकाओं orulating। संभोग कोशिकाओं की (एफ) डीआईसी micrographs समय की अवधि के लिए संकेत दिया एमएसएल-एन मीडिया के लिए स्थानांतरित कर दिया। (G) H90 (काले नीले डॉट्स) के लिए agarose पैड पर सेल घनत्व के एक समारोह के रूप में संभोग दक्षता और ज + / एच (प्रकाश नीले डॉट्स) कोशिकाओं 24 घंटे के लिए एमएसएल-एन मीडिया के लिए स्थानांतरित कर दिया। लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए कोशिकाओं का सबसे उपयुक्त घनत्व लगभग 25,000 कोशिकाओं / 2 मिमी पर हासिल की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 3:। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के गतिशील स्थानीयकरण विखंडन खमीर संभोग के दौरान (ए) deconvolved संकेत दिया जीनोटाइप के साथ कोशिकाओं के एकल z विमान epifluorescence micrographs 6 घंटे के लिए एमएसएल-एन मीडिया से एमएसएल + N स्थानांतरित कर दिया और पर मुहिम शुरू कीसंकेत समय के लिए एमएसएल-एन agarose पैड। तीर गतिशील Myo52-3GFP क्षेत्रों से संकेत मिलता है और तीर संलयन ध्यान में Myo52 स्थानीयकरण बताते हैं। (बी), संकेत दिया जीनोटाइप के साथ कोशिकाओं के (सी) deconvolved एकल z विमान epifluorescence micrographs से एमएसएल + N एमएसएल-एन मीडिया के लिए 4 घंटे के लिए स्थानांतरित कर दिया और 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त एमएसएल-एन agarose मिनी पैड पर घुड़सवार (बी) या 1 ग्राम के संकेत समय के लिए P-कारक के / एमएल (सी)। तीर का संकेत गतिशील (बी) या स्थिर (सी) Scd2-GFP क्षेत्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Movie1
पूरक मूवी 1: जंगली प्रकार H90 विखंडन खमीर सीई के डीआईसी timelapse lls नाइट्रोजन की कमी से जूझ इमेजिंग के लिए पहले 6 घंटे के लिए थे। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

movie2
पूरक मूवी 2: । के जंगली प्रकार ज + और ​​एच विखंडन खमीर कोशिकाओं है कि मिश्रित और नाइट्रोजन की कमी से जूझ इमेजिंग के लिए पहले 6 घंटे के लिए थे डीआईसी timelapse (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

Movie3
"> पूरक मूवी 3: deconvolved एकल z विमान epifluorescence और देशी लोकस से Myo52-3GFP व्यक्त एच कोशिकाओं के डीआईसी timelapse ज + कोशिकाओं मूल निवासी ठिकाना और पी-सेल विशिष्ट map3 प्रमोटर से साइटोसोलिक GFP से Myo52-tdTomato व्यक्त के साथ मिलाया । कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए एमएसएल-एन के माध्यम में बड़े हो रहे थे इमेजिंग के लिए पहले। एच सेल में साइटोसोलिक GFP के स्थानांतरण संलयन समय को परिभाषित करता है। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

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पूरक मूवी 4: deconvolved एकल z विमान epifluorescence और एच sxa2 कोशिकाओं विस्तार के डीआईसी timelapseइसके मूल प्रमोटर से ressing Scd2-GFP 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल पी-कारक के साथ इलाज किया। कोशिकाओं इमेजिंग से पहले 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए एमएसएल-एन के माध्यम में बड़े हो रहे थे। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

Movie5
पूरक मूवी 5: । Deconvolved एकल z विमान epifluorescence और एच sxa2 कोशिकाओं 1 माइक्रोग्राम / एमएल पी-कारक कोशिकाओं के साथ इलाज अपने मूल प्रमोटर से Scd2-GFP व्यक्त करने का डीआईसी timelapse 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए एमएसएल-एन के माध्यम में बड़े हो रहे थे इमेजिंग से पहले। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

YSM995 एच गुम्मट
YSM1371 एच + WT
वाईएसएम 1,396 H90 गुम्मट
YSM2534 एच myo52-3GFP :: kanMX
YSM2730 एच + myo52-tdTomato :: natMX
Pmap3: GFP :: ura4 + @ ura4locus
YSM2731 एच scd2-GFP :: :: natMX sxa2Δ kanMX

टेबल S1: खींच इस अध्ययन में इस्तेमाल।

Discussion

पर्यावरण की स्थिति, और पोषक तत्वों की उपलब्धता विशेष रूप से, दृढ़ता से विखंडन खमीर शरीर क्रिया विज्ञान प्रभावित करते हैं। नाइट्रोजन भुखमरी यौन प्रजनन के लिए अपनी प्रतिबद्धता के लिए आवश्यक है और शुरू में mitotic कोशिका चक्र प्रगति में हड़ताली परिवर्तन (Ref। 21 और चित्रा 2) की ओर जाता है। तेजी से बढ़ रही आबादी से नाइट्रोजन हटाने पर, प्रभाग में सेल का आकार तेजी से कम हो जाती है (चित्रा -2) और कोशिकाओं के बहुमत mitotic प्रगति नए पैदा हुए तेजी से बढ़ी कोशिकाओं (Ref। 21 और चित्रा 2 डी) की लंबाई की तुलना में कम गिरफ्तारी। विपरीत संभोग प्रकार की कोशिकाओं mitotic प्रगति गिरफ्तारी के रूप में वे भागीदारों संभोग में संलग्न हैं और युग्मनजों और sporulate (चित्रा 2 बी, 2 ई, 2 एफ) के रूप में करने के लिए आगे बढ़ें। Wildtype कोशिकाओं के एक दो आयामी monolayer, H90 कोशिकाओं के साठ प्रतिशत से अधिक के मामले में एक साथी को शामिल करेगा, और लगभग सभी सेल संलयन (चित्रा 2 जी से गुजरना होगा (चित्रा 2 जी) पर निर्भर करता है। प्रोटोकॉल उच्च क्षमता प्राप्त करने के लिए संभोग का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को संकेत घनत्व के भीतर भर में रखा जाता है। सेल आकार और संभोग दक्षता मानकों के निगरानी चित्रा 2 में दिखाया गया है तो एक सरल नियंत्रण है कि कोशिकाओं को कुशलता से यौन प्रजनन प्रवेश कर रहे हैं प्रदान करता है।

हम ध्यान दें कि, मध्यम कमी संभोग किसी भी नाइट्रोजन स्रोत के बाद से (अमीनो एसिड और नाइट्रोजन अड्डों में से भी कम मात्रा में बाहर रखा गया है), ऐसे चित्रा 2 ई और 2 जी में प्रस्तुत उन के रूप में उच्च संभोग क्षमता केवल पूरी तरह से prototrophic उपभेदों के साथ प्राप्त कर रहे हैं। Auxotrophic उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को हर समय प्रोटोकॉल में कहा गया है सेल घनत्व के भीतर रखा पर हैं अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है। यहाँ तक कि देखभाल के साथ, केवलकम संभोग क्षमता मनाया जाएगा। संभोग दक्षता भी ऊंचा तापमान पर मनाया कम क्षमता है, जो संभोग की प्रक्रिया के दौरान तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्ती alleles के उपयोग को सीमित कर सकते हैं के साथ, तापमान से प्रभावित है।

यहाँ प्रस्तुत विधि मुख्य रूप से फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का लंबे समय तक इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है। क्योंकि इमेजिंग लंबे समय अवधि में किया जाता है, विखंडन खमीर संभोग के सफल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी उपलब्ध स्थापना पर अत्यधिक निर्भर है। इस के लिए, माइक्रोस्कोप सेट अप, इसकी संवेदनशीलता और एक ऑटो फोकस प्रणाली के लिए उपयोग की स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण हैं। या तो सॉफ्टवेयर के आधार पर या निर्मित में हार्डवेयर ऑटोफोकस सिस्टम संभव हो रहे हैं। इसके अलावा, throughput बढ़ाने के लिए, एक मोटर चालित मंच बहु अधिग्रहण को सक्षम करने के लिए एक और महत्वपूर्ण गुण है।

इमेजिंग गुणवत्ता ब्याज की fluorophore के गुणों द्वारा सीमित है। तरल एमएसएल-एन मध्यम Protoco में विस्तृत में अलग ऊष्मायन बारएल खंड 2.3 फेरोमोन प्रेरित टैग प्रोटीन पर प्रतिदीप्ति के अनुकूलन और ब्याज के ही संभोग के चरणों इमेजिंग द्वारा अनावश्यक विरंजन को कम करने के उद्देश्य से कर रहे हैं। जबकि प्रचुर मात्रा में या अत्यधिक fluorescently focalized टैग प्रोटीन पूरे यौन जीवन चक्र (मूवी S3) के पाठ्यक्रम पर समय अंक के सैकड़ों के अधिग्रहण की अनुमति है, अन्य प्रोटीन तस्वीर विरंजन के कारण इस तरह के लंबे समय से अधिक छवि को चुनौती दे रहे हैं। छवि गुणवत्ता भी चुना fluorophore, आम तौर पर एक GFP व्युत्पन्न पर निर्भर करता है। हम बार बार मनाया कि sfGFP 17 (superfolder GFP) है, जो तेजी से कैनेटीक्स के साथ सिलवटों, संभोग की प्रक्रिया के दौरान बेहतर संकेत प्रदान की है, शायद क्योंकि मजबूत भोजी लाती तेजी से प्रोटीन कारोबार। महत्वपूर्ण बात है, हम फ्लोरोसेंट प्रोटीन परिपक्वता 17,22 के लिए आवश्यक ऑक्सीजन की उपलब्धता पर नजर नहीं आया। इस प्रकार, यह कोशिकाओं के बाद व्यक्त प्रोटीन के स्तर यों को mounte हैं प्रतिदीप्ति माप का उपयोग करने में सतर्क रहने की सलाह दी जाती हैस्लाइड पर डी, या इस तरह के प्रयोगों का संचालन करने के लिए वैकल्पिक ऑक्सीजन पारगम्य microfluidics उपकरणों का उपयोग करने के लिए। इसके अलावा, agarose पैड शाम में कोशिकाओं के साथ देखा और 18 डिग्री सेल्सियस हे / एन पर रखा छवि के कमजोर संवाददाताओं करने के लिए बहुत उपयोगी हो गया है के रूप में इस तरह के पैड यौन प्रजनन के सभी चरणों में कोशिकाओं का एक मिश्रण होते हैं।

विखंडन खमीर में संभोग synchrony प्रदर्शन नहीं करता है और कोशिकाओं को आसानी से shmooing की शुरुआत अन्य कोशिकाओं को पहले से ही sporulating के साथ (सिनेमा एस 1, एस 2) को देखा जा सकता है। इस तरह जनसंख्या गतिशीलता renders शास्त्रीय, थोक जैव रासायनिक तकनीक का उपयोग करने के लिए मुश्किल है, एकल कोशिका माइक्रोस्कोपी यहाँ वर्णित पसंद का एक विधि बना रही है। सभी माइक्रोस्कोपी आधारित दृष्टिकोण सिद्धांत रूप में यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ तैयार की कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, इन तरीकों प्रक्रियाओं है कि इस तरह के Dudin और उनके सहयोगियों ने 12 से वर्णित सेल सेल संलयन के रूप में प्रकार विशिष्ट गतिशीलता संभोग एक्ज़िबिट निगरानी कर सकते हैं। विषमता, संभोग प्रकार संवाददाताओं से निगरानी करने के लिएविशेष रूप से उपयोगी (चित्रा 3) के लिए किया गया है। दो प्रकार के बीच फर्क आसानी से संभोग जब अलग fluorophores रोजगार ज + कोशिकाओं में प्रोटीन और एच टैग करने के द्वारा heterothallic उपभेदों के साथ काम कर हासिल की है। हालांकि, इस homothallic उपभेदों के लिए संभव नहीं है। H90 कोशिकाओं की संभोग प्रकार अंतर करने के लिए विकसित एक दृष्टिकोण संभोग प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में साइटोसोलिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए है। विशेष रूप से, फेरोमोन रिसेप्टर जीन map3 और mam2 के प्रमोटरों को क्रमश: पी में GFP या mCherry प्रोटीन और एम कोशिकाओं की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इसके अलावा, इन मार्करों सेल सेल संलयन की सटीक समय, दूसरे के लिए एक साथी के सेल से फ्लोरोसेंट संकेत के हस्तांतरण के रूप में कल्पना की अनुमति दी।

संभोग फेरोमोन, खमीर 11 में यौन प्रजनन के अलग चरणों के माध्यम से प्रगति के लिए महत्वपूर्ण निर्धारक हैं23। विखंडन खमीर में अलग सेल ध्रुवीकरण राज्यों (चित्रा 3 बी, 3 सी और रेफरी। 11) को कृत्रिम फेरोमोन नेतृत्व के विभिन्न स्तरों। प्रोटोकॉल के ऊपर का मूल्यांकन कैसे शामिल अलग बहिर्जात फेरोमोन स्तरों सेल शरीर क्रिया विज्ञान को प्रभावित कर सकते हैं। क्योंकि फेरोमोन प्रोटीज Sxa2 तेजी से पी-कारक, एक heterothallic उत्परिवर्ती तनाव जहां प्रोटीज नष्ट कर दिया गया प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था degrades। हालांकि, विपरीत संभोग प्रकार, न केवल स्तरों लेकिन यह भी एक संभोग साथी द्वारा उत्सर्जित फेरोमोन के स्थानिक वितरण की कोशिकाओं के मिश्रण में महत्वपूर्ण होने की संभावना है। सेल प्रतिक्रिया पर फेरोमोन स्थानिक वितरण के प्रभाव का विश्लेषण इस तरह के खमीर 24,25 नवोदित पर कार्यरत microfluidics उपकरणों के रूप में और अधिक परिष्कृत setups के विकास की आवश्यकता होगी।

सारांश में, हम विखंडन खमीर के यौन जीवन चक्र के दीर्घकालिक माइक्रोस्कोपी के लिए एक बुनियादी तरीका मौजूद है। इस प्रोटोकॉल को मामूली समायोजन शोध और विश्लेषण की अनुमति देते हैंCH यौन जीवन चक्र के अलग चरणों में सेलुलर प्रतिक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित। एकल कोशिका जैव रसायन उपकरण और microfluidics उपकरणों के साथ इस दृष्टिकोण के संयोजन आगे एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली के रूप में विखंडन खमीर यौन प्रजनन को बढ़ावा देंगे।

Acknowledgments

ए वी एक EMBO लंबी अवधि postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। मार्टिन प्रयोगशाला में अनुसंधान एक ईआरसी शुरू अनुदान (GeometryCellCycle) और SGM करने के लिए एक स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (31003A_155944) द्वारा वित्त पोषित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich G8270-10KG
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1.05108.0050
NaCl Sigma-Aldrich 71381
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 63140
CaCl2 Sigma-Aldrich 12095
Pantothenate AppliChem A2088,0025
Nicotinic Acid AppliChem A0963,0100
Inositol AppliChem A1716,0100
Biotin AppliChem A0967,0250
Boric Acid Sigma-Aldrich B6768-1KG
MnSO4 AppliChem A1038,0250
ZnSO4•7H2 Sigma-Aldrich Z4750
FeCl2•6H2O AppliChem A3514,0250
Molybdenum oxide (VI) (MoO3) Sigma-Aldrich 69850
KI AppliChem A3872,0100
CuSO4•5H2O AppliChem A1034,0500
Citric Acid  AppliChem A2344,0500
Agarose Promega V3125
(NH4)2SO4  Merck 1.01217.1000
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-100G
Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% Sigma-Aldrich A9126-100G
Uracil  Sigma-Aldrich U0750
Lanolin Sigma-Aldrich L7387
Vaseline Reactolab 92045-74-4
Paraffin Reactolab 7005600

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References

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