زراعة الخلايا الأولية الأنف طلائي من الأطفال وإعادة برمجة وإلى خلية جذعية مستحثة وافرة القدرة

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ulm, A., Mayhew, C. N., Debley, J., Khurana Hershey, G. K., Ji, H. Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53814, doi:10.3791/53814 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة من عينات الإنسان (hiPSCs) هي تكنولوجيا سريعة النمو أبحاث الخلايا الجذعية. أنها توفر بديلا لأبحاث الخلايا الجذعية الجنينية (HESC) مع عدد أقل بكثير من العيوب الأخلاقية والمعنوية 1،2. على الرغم من أنها ليست متطابقة epigenetically إلى hESCs 3-5، hiPSCs تقدم طريقة فريدة من نوعها لنموذج الظواهر التنمية والمرض، وأنها يمكن أن تستمد من الأنسجة ذات الصلة للدولة مرض 5-8. يجري باستمرار استكشاف طرق جديدة لتوليد hiPSCs لتحديد أنواع الخلايا الأمثل لتبدأ، باعتبارها وسيلة لإعداد iPSCs GMP ذات جودة مناسبة لزراعة الأعضاء، وأيضا إلى زيادة في الوقت المناسب وكفاءة عملية إعادة برمجة 6،9-11.

الهوائية الخلايا الظهارية حاسمة في تطور الالتهاب التحسسي 12، وظهارة هي المحرك الرئيسي للاستجابات الحساسية وإعادة مجرى الهواء من خلال التفاعل مع إمانه وانسجة الخلايا. ظهارة الهوائية تلعب دورا أساسيا في نشأة واستمرار أمراض الرئة مثل الربو. ومع ذلك، أقل الهوائية الخلايا الظهارية من الصعب الحصول عليها في عملية إعداد سريرية، وخاصة من المرضى الأصحاء والأطفال. بيانات من عدة دراسات تدعم فرضية أن الخلايا الظهارية من الغشاء المخاطي للأنف هي وكيل صالح والعملي لانخفاض مجرى الهواء الخلايا الظهارية 13-20، وخاصة عند دراسة الاستجابات لملوثات الهواء والمواد المسببة للحساسية. يتكون الغشاء المخاطي للأنف من أكثر من 90٪ الهوائية مهدبة الخلايا الظهارية وأخذ عينات من هذه الخلايا الظهارية الأنفية (NECS) لا يمكن أن يؤديها بسهولة في أطفال لا تتجاوز أعمارهم سن أربعة أو خمسة، كما أنه أقل الغازية من أساليب أخذ العينات الأخرى خلية / الأنسجة وغير يرتبط مع الحد الأدنى من خطر الآثار الجانبية مثل العدوى 20-23. ويقدم وسيلة سريعة وبسيطة لأخذ عينات الأطفال الأصحاء والأطفال المريضة دون طويلة، لا لزوم لها، وغالبا ما تكون مؤلمة procedu القصباتالدقة التي تتطلب التخدير. وقد وجدت دراسات سابقة أن الأنواع الفرعية مرض يتصل شدة الربو ويمكن التمييز في كل من الغشاء المخاطي للأنف وكذلك عينات من الخلايا الهوائية يؤخذ من الأطفال المصابين بالربو، وكان التعبير الجيني بين أنواع الأنسجة اثنين مماثل في حوالي 90٪ من الجينات غير كل مكان 22 24. كمصدر للiPSCs، NECS تقديم مزايا أكثر أنواع الخلايا الأخرى المستخدمة بشكل متكرر. وغالبا ما تستخدم الخلايا الليفية لتوليد التوجيهية، ولكن على الرغم من أن هذه الخلايا يمكن بسهولة مثقف من خزعة الجلد، وهذه العملية عادة ما يتطلب تخدير موضعي، شق، والخيوط الجراحية، ويرتبط مع بعض مخاطر العدوى. لذلك، والحصول على الموافقة المسبقة من المرضى لهذا النوع من الخزعة قد يكون من الصعب 25. بديل واحد إلى الخلايا الليفية هي هامشية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs). ومع ذلك، قد يكون من الصعب الحصول على كمية كافية من الدم لتوليد IPSC من الأطفال المرضى. وبالإضافة إلى ذلك، هناك قيود ا ف ب المصبplications لالليفية وiPSCs خلايا الدم المشتقة منها، خصوصا قدرة التمايز لبعض أنواع الخلايا 5،26. لذلك، نظرا لإمكانية الوصول النسبي وانخفاض مخاطر الآثار الجانبية التالية جمعها، تمثل NECS مصدر خلية مثالية لتوليد IPSC من السكان الأطفال.

وقد تلقى iPSCs الكثير من الاهتمام في الآونة الأخيرة كمنصة لدراسة التنمية البشرية، وتوليد نماذج المرض جديدة، وكمصدر محتمل للخلايا لعلاجات شخصية. قبل الإمكانات الكاملة لهذه التكنولوجيا يمكن أن تتحقق، في حاجة إلى الأسس الجزيئية لعملية إعادة البرمجة إلى توضيح، ولكن في الوقت الحالي فإن هذا البروتوكول والإجراءات المبينة في إلقاء الضوء على الدراسات البحثية التي تركز على التعرض مجرى الهواء، وكذلك توفر منبرا لل دراسة آثار الأدوية شخصية تنطوي على iPSCs.

وقد أدى العمل التعاوني من عدة مختبرات للgeneratioن من تقنية ناجحة ليس فقط لأخذ عينات من الغشاء المخاطي للأنف، ولكن أيضا زراعة NECS، وإعادة برمجة هذه الخلايا iPSCs 23. وتنص هذه المادة على الخطوط العريضة لبروتوكول لأخذ العينات المثلى، زراعة، وشروط إعادة برمجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتبع بروتوكول التالية للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث الإنسان والمؤسسات.

1. أخذ عينات من النسيج المخاطي

ملاحظة: الحصول على عينات من الاشخاص الذين تكون خالية من علامات العدوى الفيروسية في الجهاز التنفسي.

  1. إعداد 15 مل الطازجة المخروطية قبل الزيارة مشارك وإضافة 2 مل BEGM (الشعبي طلائي متوسط ​​نمو الخلايا) بالإضافة إلى 20 ميكرولتر العقيمة بن / بكتيريا / Fungizone (P / S / F) (0.01٪).
  2. فتح فرشاة علم الخلايا قبل أخذ عينة، ومما لا شك فيه للحفاظ على فرشاة معقمة ولا لمسها إلى أي الأسطح إلى جانب الأسطح الأنفية.
  3. اسأل المشاركين على الجلوس لا يزال وإمالة الرأس حتى نحو السقف. يكون أصغر أو الأطفال أكثر قلقا الجلوس على أيديهم و / أو الاستلقاء لتفادي السحق فرشاة بعيدا.
  4. تهدف فرشاة في الجزء الخلفي من الأنف حيث يضيق الممر (يبدو وكأنه ثقب أسود صغير). حرك الفرشاة أسفل وتطور المعصمين كما هو إزالة فرشاة من nostriل.
  5. وضع الفرشاة في المخروطية ويغرق في BEGM. قطع فرشاة الزائدة واستبدال الغطاء على أنبوب. لا الدوامة.
    ملاحظة: إذا كان المشارك على استعداد، للحصول على فرشاة الثانية بنفس الطريقة ولكن في المنخر الثاني. والحصول على بالفرشاة من فتحتي الأنف يؤدي إلى ارتفاع احتمال أن أخذ العينات ستكون ناجحة. أخذ عينات من نفس الأنف قد يؤدي إلى النزيف وسوف لا يحتمل تحسين العينة.
  6. الاحتفاظ بعينات أقرب إلى 37 درجة مئوية وقت ممكن أثناء النقل باستخدام الدورق مع الماء الدافئ.

2. عدد خلايا وCytospin

  1. تستنهض الهمم بلطف فرشاة في BEGM ويستغرق 10 ميكرولتر من عينة لعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. إضافة 10 ميكرولتر من / وصمة عار الميتة الحية والاعتماد فقط تعيش الخلايا تحت المجهر.
  2. خذ 50 ميكرولتر من العينة وتمييع إلى 200 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني 1X. إضافة إلى قمع cytospin تعلق على شريحة زجاجية وتدور في 300 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. السماح الشريحة الجافة O / N وصمة عار شريحة followinتعليمات ز المصنعة. السماح ليجف O / N، ويفضل أن يكون في الظلام.
  3. الشريحة وصمة عار مع هيما 3 وصمة عار
    1. نقل كل حل (هيما تثبيتي والأزرق الفاتح، هيما 3 الحل الأول، وردي، وهيما 3 الحل الثاني والأزرق العميق) في طبق تلطيخ. حافظ على تغطيتها عندما لا تكون قيد الاستعمال. إدراج الشرائح في قارب تلطيخ الشريحة
    2. تراجع الشرائح بشكل مستمر في تثبيتي لمدة 30 ثانية، ثم تسمح الزائدة لاستنزاف. تراجع الشرائح بشكل مستمر في الحل الأول لمدة 30 ثانية، ثم السماح الزائدة لاستنزاف. تراجع الشرائح بشكل مستمر في الحل الثاني لمدة 30 ثانية، ثم السماح لاستنزاف فائض
    3. شطف مع الماء منزوع الأيونات حتى ينتهي الماء واضحة. السماح ليجف O / N، ويفضل أن يكون في الظلام
  4. انظروا إلى شريحة تحت المجهر الخلايا والعد، وتحديد النسبة المئوية للخلايا الظهارية. يجب أن تكون 90٪ أو أكثر إذا أخذ العينات جيدة.

3. خلايا البذر

ملاحظة: القيام بجميع إجراءات زراعة الخلايا في نسيج الثقافة الصحيحة والمعتمدةغطاء محرك السيارة باستخدام تقنية معقمة.

  1. لوحات معطف مع الأبقار عن طريق الجلد الكولاجين (BDC)، نوع 1. إضافة 0.5 مل من 3 ملغ / مل BDC مخففة في 49.5 مل برنامج تلفزيوني 1X. إعداد أقل إذا كان سيتم استخدامها فقط لوحات قليلة. معطف قارورة T25 مع 2 مل BDC واحتضان في العقيمة هود O / N أو عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، إذا لزم الأمر.
  2. بعد الحضانة، ونضح أي السائل المتبقي. كشف قوارير للأشعة فوق البنفسجية ل30min في في غطاء العقيمة. تخزين قوارير لمدة تصل إلى شهر واحد في 4 درجات مئوية، ولكن تقديمهم إلى RT أو 37 درجة مئوية قبل البذر الخلايا.
  3. إبقاء فرشاة والخلايا في BEGM عند 37 درجة مئوية حتى جاهزة للالبذور. بلطف فرشاة حفيف داخل المخروطية، ولكن لا الدوامة.
    1. لوحة 7 × 10 5 خلايا في قارورة T25. إذا كان هناك أقل، واستخدام وعاء أصغر، وأيضا مثل واحد من لوحة 6 جيدا. هذه لوحة حجم يتطلب حوالي 3 × 10 5 خلايا.
      ملاحظة: إذا لم تكن هناك العديد من هذه الخلايا، ومن غير المستحسن للمتابعة.
  4. تحت غطاء العقيمة، واتخاذ فرشاة للخروج من أنبوب وجنرال الكتريكntly تدوير الفرشاة على سطح القارورة المغلفة، والحرص على عدم خدش الطلاء. تجاهل فرشاة في وعاء واقية مناسبة.
  5. ببطء ماصة الخلايا المتبقية في BEGM من المخروطية وفي قارورة T25. مراقبة الخلايا تحت المجهر. وسيراعى عدد الخلايا العائمة ويمكن أن يكون هناك بعض الحطام من الأنف، والتي هي مقبولة في هذه المرحلة (الشكل 3A).

الثقافة 4. خلية

  1. بعد البذر الخلايا، والسماح لهم تسوية لمدة 48 ساعة دون انقطاع (الشكل 3). بعد 48 ساعة، ببطء وبرفق إضافة 2 مل دافئ BEGM و 20 ميكرولتر العقيمة بنسلين / الستبرتوميسين / Fungizone (P / S / F).
    ملاحظة: لا نضح الأصلي 2 مل من وسائل الاعلام.
  2. في اليوم ال 4 بعد الغرس، ونضح بعناية كل السائل، واستبدالها مع 4 مل جديدة، تحسنت BEGM زائد 1X القلم / بكتيريا (fungizone لم يعد ضروريا). تغيير وسائل الاعلام كل يومين وتقييم خلايا لإرفاقمنة، والنمو، والتقاء. عندما تصل خلايا ~ 80٪ التقاء، عادة في غضون 2-3 أسابيع، وتكون جاهزة للpassaged.
  3. واحد قارورة T25 (حوالي 2.5 × 10 6 خلايا عندما متموجة) يمكن passaged إلى ثلاث قوارير T25 أو قارورة T75 واحد. بعد مرور الأول، وينبغي أن تكون خلايا قوية وصحية، والوصول إلى نقطة التقاء حول كل ثلاثة أيام.

5. الخلايا الركض

  1. نضح بلطف وسائل الإعلام من لوحة. إضافة 1 مل 0.05٪ حل التربسين في قارورة T25 لوحة ووضعه في الحاضنة لمدة 4min، أو حتى فصل الخلايا من لوحة. فحص مستوى مفرزة من الخلايا كل دقيقة 2 و لا تترك التربسين لفترة أطول من 10 دقيقة.
  2. إضافة 5 مل التربسين تحييد الحل (TNS)، أو وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل لتحييد الانزيم. إزالة جميع السائل والخلايا من القارورة ووضعه في أنبوب مخروطي 15 مل.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج (تسارع 0 التباطؤ 0) لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه الخلية. نضح supernaتانت و resuspend الخلايا في BEGM + P / S في حجم اللازمة لقوارير جديدة (4 مل قارورة T25، 10 مل قارورة T75)
  4. أداء عدد الخلايا مع / وصمة عار الميتة الحية كما هو موضح أعلاه (2.1). إضافة كمية مناسبة من BEGM والخلايا إلى قوارير المغلفة والعودة إلى الحاضنة. الحفاظ على النحو المفصل أعلاه أو cryopreserve في تجميد المتوسطة (70٪ BEGM، و 20٪ FBS و 10٪ DMSO) بتركيز 0.5-2 × 10 6 خلايا لكل مل.

6. إعادة برمجة لiPSCs

ملاحظة: قبل أن تولد iPSCs، وضمان الالتزام بجميع القواعد المؤسسية التي تحكم توليد واستخدام iPSCs الإنسان. تقنية معقمة أهمية خاصة للثقافات التوجيهية، كما مستنبت لا يحتوي بشكل روتيني المضادات الحيوية. ومن الأهمية بمكان أن NECS تظهر صحية وغير التكاثري لإعادة البرمجة الناجحة بقوة.

  1. لوحة 5 × 10 5 NECS لكل بئر من 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة. بعد 24 ساعة، إضافة polybreneلBEGM إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل وتنبيغ NECS بإضافة جزيئات lentiviral معربا عن Oct4، Sox2، Klf4، ج. Myc على وسائل الإعلام. نهدف إلى تحقيق وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من ~ 5 27.
    1. لتحديد وزارة الداخلية، وإعداد التخفيفات المسلسل من الأسهم مركزة lentiviral وتنبيغ الخلايا HT1080 مع هذه التخفيفات. بعد الكشف لأول مرة بشكل لا لبس فيه التعبير dTomato في الخلايا HT1080، وحساب عدد من "وحدات transducing / مل" بتسجيله عدد dTomato إيجابية خلية / كتل صغيرة من الخلايا في كل تخفيف.
      ملاحظة: عادة، سوف يكون هناك التخفيفات التي هي عالية جدا (كل شيء dTomato إيجابية) ومنخفضة جدا (لا شيء أو اثنين فقط من خلايا إيجابية).
    2. أداء التهديف من التخفيفات التي يتم فيها تحديد خلايا إيجابية منفصلة / كتل صغيرة من الخلايا. تحديد عيار عن طريق تصحيح عدد من transducing وحدة / مل مع عامل التخفيف المناسبة. وزارة الداخلية وقتئذ نسبة عددمن transduced الخلايا إلى عدد من جزيئات الفيروس 27.
      ملاحظة: يفترض كل dTomato خلية إيجابية / أجمة صغيرة ينبغي ان ينطلق من جسيمات الفيروس واحد.
  2. حوالي 3 ساعة بعد تنبيغ، وإزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع BEGM جديدة. تجاهل وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروسة البطيئة باستخدام الإجراءات المعتمدة مؤسسيا. العودة NECS transduced إلى الحاضنة لمدة 3 أيام.
  3. في يوم 3، واستبدال وسائل الإعلام مع BEGM جديدة، ومن ثم احتضان لمدة 3 أيام أخرى. قضى نضح وسائل الإعلام، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 1 مل 0.05٪ التربسين حل جيد. خلايا مرور مع التربسين كما هو مكتوب أعلاه (القسم 5). بعناية نضح خلايا وطاف resuspend في 4 مل BEGM + P / S. الخلايا يمكن passaged إلى بئر جديد من لوحة 6 جيدا المغلفة مع BDC، أو تضاف إلى الثقافات MEF، لو كان على استعداد (راجع الخطوة التالية).
  4. إعداد MEF لوحات المغلفة. في يوم 4 إضافة 0.1٪ محلول الجيلاتين (1 مل / جيد) إلى 2 آبار ل6 جيدا (لتنفيذ +/- Thiazovivin (SPT) راجع الخطوة 6.6). على التالياليوم، ذوبان الجليد قارورة من MEFS المعطل 28.
  5. وضع MEFS إلى 10 مل من وسائل الاعلام MEF (DMEM + 1X NEAA + 10٪ عملية DfCS). تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق لبيليه. resuspend في وسائل الإعلام MEF. الجيلاتين نضح من لوحة 6 جيدا وإضافة 1.87 × 10 5 MEFS لكل بئر من لوحة 6 جيدا المغلفة الجيلاتين. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية، أو لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
  6. نقل 2 مل من BEGM تحتوي على خلايا transduced لكل بئر إلى 2 آبار المغلفة سابقا لوحة 6 جيدا واحتضان O / N. في اليوم التالي، استبدال BEGM مع 2.5 مل لكل بئر من وسائل الإعلام HESC القياسية التي تحتوي على 4 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية. تغذية الخلايا مع وسائل الإعلام HESC جديدة +/- SPT يوميا لمدة 10 أيام
    ملاحظة: من الممكن لإضافة مزيج من جزيئات صغيرة (SB431542، PD0325901، وThiazovivin (SPT) كوكتيل) لتعزيز الكفاءة وحركية برمجة لل NECS 23.
  7. بعد عشرة أيام، والاستمرار في تغذية يوميا باستخدام HESC وسائل الإعلام دون الفرعية. تغذية الثقافات يوميا حتى المستعمرات مثل HESCتظهر (الشكل 5A، P0 مستعمرة). تحديد المستعمرات إيواء iPSCs المفترضة من قبل نواة العالية: نسبة حشوية ونويات بارزة.
  8. يدويا المكوس ونقل المستعمرات مع التشكل مثل HESC لفصل آبار للثقافة والتوسع كخطوط منفصلة في نظام خالية المغذية. يجب المستعمرات رفعه التكيف بسرعة مع هذه الظروف.
    1. بعد طلاء رفعه المستعمرات تعتبر هذه الخطوط التوجيهية المفترضة منفصلة الآن مرور 1 (P1). الثقافات تغذية يوميا مع mTeSR1. مرور وتوسيع خطوط التوجيهية باستخدام إجراءات القياسية. قد يستغرق عدة أيام إلى أسبوع للمستعمرات P1 للوصول إلى الحجم الذي ينبغي أن تكون passaged.

7. الحفاظ على iPSCs في الثقافة

  1. تغذية وتقييم الثقافات يوميا. يدويا المناطق المكوس نستعرض التمايز العلني عن طريق كشط مع ماصة زجاجية معقمة أو الجزئي طرف ماصة. تغيير وسائل الاعلام بعد قطف اليومي.
  2. خلايا مرور بعد approximately كل أربعة أيام: بلطف وسائل الاعلام نضح، إضافة 1 مل Dispase الدافئة (1 ملغ / مل) لكل بئر من لوحة 6 جيدا (نصف حجم التغذية)، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. وحواف المستعمرات تبدأ لرفع، الذي يبدو وكأنه مخطط أبيض حول المستعمرة. نضح بلطف Dispase وغسل 3X مع درجة حرارة DMEM / F12.
  3. إضافة 2 مل mTeSR1 واستخدام رافع الخلية إلى رفع مستعمرات من لوحة. استخدام ماصة 5 مل المصلية أو micropipette P1000 ليسحن بلطف الخلايا حتى يتم تقسيم المستعمرات إلى مجموعات أصغر.
    1. تجنب إنتاج مجموعات صغيرة جدا أو الخلايا وحيدة، والبقاء على قيد الحياة وانتشار لاحقة ستكون دون المستوى الأمثل. عندما المستعمرات إعادة الطلاء، 1: 4-1: 6 وانقسام حفاظ على كثافة مستعمرة المثلى. إزالة بلطف المستعمرات وسائل الاعلام من لوحة وإضافة إلى آبار جديدة،-Matrigel المغلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الجزء الأول من الأنف، ودعا دهليز الأنف، هي منطقة محاطة غضروف 29. تحتاج الفرشاة لتسير بسلاسة الماضي هذا المجال من الأنف، وراء صمام الأنف (الباطنة الفوهة، أو "الثقب الأسود" رأيت في الجزء الخلفي من n هل)، ويتم الحصول على عينة من المحارة أدنى (الشكل 1). المحارات الأنفية هي هياكل عظمية التي تزيد من مساحة سطح الأنف 29، مما يجعلها موقعا مثاليا لأخذ العينات. واصطف المنطقة أيضا الأنسجة المخاطية أوعية دموية، والتي تشبه بطانة الشعب الهوائية السفلى وينشط أيضا في الاستجابة المناعية للمخاطر البيئية.

أخذ عينات من الأنسجة الصحيحة يضمن أن الخلايا التي يتم برمجتها هي الخلايا الظهارية. هذا يمكن تقييمها من قبل عدد خلايا الأولي وcytospin، ولكن أيضا من خلال مراقبة الخلايا في الثقافة. الcytospin، ونسج أسفل مرة واحدة، والمجففة، والملون، ويبين ماكياج من العينة. تتكون معظم عينات من الخلايا الطلائية، والتي هي عمودي ومهدب، مع نواة مستديرة واحدة. مع عدة وصمة عار هيما 3، أنها وصمة عار اللون الأزرق الفاتح مع نواة الأرجواني قتامة (الشكل 2)، وغالبا عندما تؤخذ مباشرة من الأنف ينظر إليهم تجمعت معا. على الرغم من أن عينات من الخلايا الأنفية هي البداية مزيجا من أنواع الخلايا وكذلك الحطام من الأنف، مع مرور الوقت في الثقافة ومع التغييرات وسائل الإعلام، تصبح الخلايا الظهارية السائد (الشكل 3A، B). عندما تنمو الخلايا الظهارية للالتقاء، تتشكل مثل البيض متصدع حديثا، حيث نواة كبيرة وتقع في وسط والسيتوبلازم هو نوع من "التواصل" وتمتد الوقت الذي تستعد فيه خلية لتقسيم (الشكل 3B). حيث تنمو الخلايا معا، فإنها تبدأ في اتخاذ على أكثر من شكل لكرة القدم، وتناسب معا بشكل مريح في طبق (الشكل3C).

وحالما يتم transduced الخلايا، فإنها تعبر عن tdTomato علامة فلوري في النواة. ويبين الشكل 4 الخلايا بمجرد أن يتم transduced، في حقل مشرق، ومضان مع اندمجت كل من الصور. ليس كل الخلايا تعبر عن علامة، وبالتالي تم transduced ليس كل خلية، ولكن يجب أن يكون كل بئر نحو 90 في المئة كفاءة تنبيغ، وهذا سوف يزيد من احتمال أن بعض الخلايا ستحقق تعدد القدرات بعد أن مطلي على MEFS.

مرة واحدة تبدأ المشارك مثقف مع MEFS وكما الخلايا لتشكل مستعمرات، أنها سوف تتوقف تدريجيا التعبير عن tdTomato. ومع ذلك، ليس هذا هو أفضل مؤشر على تشكيل مستعمرة. وخير دليل على تشكيل مستعمرة تأكيدا البصرية. المستعمرات HESC، والتي هي "المعيار الذهبي" من تعدد القدرات، هي في معظمها جولة وتتكون من العديد من الخلايا صغيرة مستديرة مع تأنوى الإلكترونية ونواة إلى ارتفاع نسبة السيتوبلازم. يبدو كل خلية تتكون في معظمها من النوى، والعضيات الأخرى ليست واضحة للعيان. بعد IPSC حصاد مستعمرة، والثقافة في ظروف خالية من التغذية القياسية، يجب شكلت حديثا المستعمرات IPSC تبدو كثيرا مثل نظرائهم HESC بهم، والخلايا الفردية متطابقة تقريبا إلى النمط الظاهري HESC، كما رأينا في الشكل 5B.

قبل لدت iPSCs الاستفادة من الخلايا الظهارية الأنفية (NEC-iPSCs) في التجارب، وينصح لتقييم نوعية خطوط جديدة. هذا عادة ما ينطوي على تقييم النمط النووي، والتعبير عن علامات تعدد القدرات، وقدرة iPSCs للتمييز في كل من 3 طبقات جرثومية جنينية (الأديم الباطن، الأديم المتوسط ​​والأديم الظاهر). ويمكن اختبار قدرة التمايز في نواح كثيرة، ولكن في الوقت الراهن، وفحص أكثر صرامة هو فحص مسخي 2،23،30. فحوصات أشمل مثل النسخي والتنميط epigenomic مفيدة لتحديد ما إذا كان يتم إدخال أي شذوذ الكروموسومات عن طريق إعادة برمجة 23.

الشكل 1
يشار الشكل 1. القرين السفلي. حركة أخذ العينات والهدف أخذ العينات، والمحارة أدنى، من خلال السهم الأسود. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. Cytospin. معظم عينة تتكون من الخلايا الظهارية، والتي هي طويلة وعمودية، مع أهداب في نهاية واحدة ونواة مستديرة في الطرف الآخر. وغالبا ما تجمعت معا عندما أخذ عينات مباشرة من n هل. السهام تشير الخلايا الظهارية الفردية."https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الخلايا الأولية الأنف الظهارية في الثقافة. (أ) الخلايا العائمة والحطام بعد جمع العينة ومطلي. (ب) الخلايا بعد يوم واحد يجري passaged. مورفولوجيا الخلايا ثابت والثقافة ويتكون أساسا من الخلايا الظهارية الأنفية، 10X التكبير، و (C) 5X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. تنبيغ من NECS. خلايا يجري transduced حملوا ناقلات وتظهر حمراء tdTomato مضان علامة. يجب أن تتلاشى هذه العلامة لأنها تقدم نحو اقامة دولة المحفزة. (أ) صورة حقل مشرق الخلايا transduced. (ب) صورة الفلورسنت من خلايا transduced. (C) تراكب من حقل مشرق والصور فلوري (لوحات A و B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. IPSC وقف المستعمرات تشبه الخلايا. (A) المتزايد على MEFS، مستعمرة هي في معظمها جولة على حواف ويظهر قليل من دون تمييز. (ب) خلايا فردية تظهر نموذجية مثل HESC التشكل، مع خلايا صغيرة مدورة مع نواة كبيرة.5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا الظهارية الأنفية (NECS) هي منصة الوصول إليها لدراسة أمراض الشعب الهوائية، واللجنة الوطنية للانتخابات، iPSCs توفر وسيلة مثيرة لاستكشاف تطور المرض والعلاج والعلاج 1،31،32. يمكن الحصول عليها NECS دون إجراءات ضارة المجهدة أو يحتمل أن تكون 6،23. في تجربتنا، وعينة من الغشاء المخاطي للأنف كما هو موضح في هذا البروتوكول على ما يبدو أقل إرهاقا وينظر أفضل من جمع الدم للأطفال. لذلك، قد يكون هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص في السكان مرضى الأطفال وذات الصلة لدراسة أمراض الشعب الهوائية. ميزة أخرى من NECS هو أنه بمجرد وجودهم في الثقافة، ويتم اختيار الخلايا الظهارية للمع وسائل الإعلام وحالة الثقافة وتصبح متجانسة. هذا هو مفيد من استخدام أنسجة معقدة مثل خلايا الدم ويجعل من الاسهل لتقييم أثر أصل خلية في الناتج خطوط التوجيهية باستخدام نهج transcriptomic وجينية.

متىأخذ عينات من الغشاء المخاطي للأنف، فمن المهم أن المكان الصحيح للأنف وعينات بحيث يتم استرداد الخلايا الظهارية في الغالب، كما يتضح من خلال عرض cytospin تحت المجهر (الشكل 2). وأخذ العينات الصحيحة تنتج الخلايا الظهارية ≥90٪. فمن الأهمية بمكان للحصول على عينات من المرضى الأصحاء، وضمان أن العينة التي يتم جمعها بشكل مناسب من أجل تحقيق أقصى قدر من عدد الخلايا التي تم الحصول عليها ومطلي. حركة التواء هو موضح في البروتوكول (القسم 1.5) يضمن أن فرشاة تلامس مع أكبر قدر من سطح الأنف ممكن. وهو رد الفعل الطبيعي لتحويل واحد رأسه عندما يتجه جسم غريب نحو الوجه. لذلك، في حال وجود طفل يتحول له أو رأسها أو ابتعدت، فمن الضروري أن أخذ العينات يحدث بسرعة وبدقة. وسوف تستخدم هذه التقنيات زيادة كفاءة كل خطوة أخرى على البروتوكول، وتحديد احتمال إعادة برمجة ناجحة. يسأل الطفلعلى الاستلقاء على الأرض، وحتى لوضع أيديهم تحتها أو لديك أحد الوالدين أو الأخوة عقد أيديهم هو وسيلة جيدة لتشجيعهم على الكذب لا يزال وللمساعدة في ضمان جمع العينات على نحو سلس وغير مؤلم.

مؤخرا، تم تقييم عدد من التقنيات أخذ العينات أخرى للراحة وسهولة، ونتائج العينة، استنادا إلى محتوى الخلية وتكوين وكذلك الحمض النووي الريبي والحمض النووي ينتج 33. استعرض فريق أخذ العينات باستخدام فرشاة علم الخلايا مقابل مسحة البوليستر، وأنها عينات كل من المحارة أدنى فضلا عن فتحتي الأنف الأمامية التي تدور بقوة فرشاة أو مسحة حول فتحتي الأنف. أخذ عينات من المحارة أدنى مع فرشاة وجدت لتكون غير مريحة بعض الشيء، على الرغم من أنها لم تحقق أفضل العوائد RNA ويتكون من خلايا طلائية مهدبة أكثر، بالمقارنة مع مسحة البوليستر. وبالتالي يتم التحقق من الطريقة المقترحة في هذا البروتوكول كأسلوب الأكثر موثوقية لأخذ عينات من ظهائر الأنف باعتبارها وسيلة لدراسة مجرى الهواء التنفسيالبشرة.

حالما يتم الحصول على العينة، فإنه يجب أن تبقى عند 37 درجة مئوية. واحدة من أكثر الطرق فعالية هي لتسخين كوب من الماء إلى أكثر من 37 درجة مئوية، ونستله ذلك في وعاء الستايروفوم للنقل الآمن في حين تستعد لمواجهة مشارك. فقط قبل أن يتم جمع العينة، إضافة الماء البارد بحيث يتم جلب الحرارة إلى نحو 37 درجة مئوية، وإضافة أنبوب مخروطي الشكل مع وسائل الإعلام. عند إضافة فرشاة لأنبوب مخروطي الشكل، وعودة أنبوب فورا إلى حمام الماء وتبقى هناك حتى ويمكن إرجاع ذلك إلى المختبر، وعند هذه النقطة يجب وضع الأنبوب في 37 ° C حمام الماء ينظم حتى الخلايا تبذر على قارورة الثقافة. في كل نقطة، وينبغي أن تستخدم تقنية معقمة لتجنب إدخال عملاء أجانب في الثقافة.

واعتبر قدر كبير من التباين بين العينات عندما تم وضع الخلايا في الثقافة. ويبدو أن هذا التباين إلى تنبع من كل من المصدر المانحة وكذلكنوعية العينة نفسها. طريقة واحدة لزيادة جودة العينة للحصول على فرشاة واحدة من كل منخر، أو اثنين من فرش لكل مشارك. بعد بذر عينة جديدة، وكما و passaged الخلايا، وينبغي رصد حالة الخلايا بانتظام للتأكد من أنها صالحة لإعادة برمجتها. الخلايا التي تنتج أفضل المرشحين لهي تلك التي تأخذ على الثقافة وتتكاثر بسرعة. ومن غير المعروف لماذا الخلايا من بعض الجهات المانحة هي أقوى من تلك التي من الخلايا الأخرى، ولكن ذلك قد يكون راجعا إلى عوامل مثل العمر وحجم الأنف، وصحة المتبرع في وقت أخذ العينات. عندما غلة عينة قليلة جدا الخلايا، أو سوى عدد قليل من الخلايا إرفاق مطلي مرة واحدة، من غير المرجح أن تنمو لالتقاء العينة. إذا لم ثقافة تكافح من الوصول إلى نقطة التقاء، والخلايا تميل إلى أن تكون ضعيفة والعديد من الخلايا تموت أثناء الركض. هذا النوع من عينة هو مرشح الفقراء جدا لإعادة البرمجة، كما أنه من الضروري أن الخلايا تكون تنتشر بسرعة وبقوة، وأنهمtransduced في أقرب عدد مرور ممكن. ومن غير المستحسن ل transfect الخلايا التي تنمو ببطء، وإذا كان هذا هو بسبب التقلبات المانحة، وسوء أخذ العينات، أو الثقافات الركض رقيقة جدا. إذا حاولت إعادة برمجة مع ثقافة الخلية الفقيرة، فمن غير المرجح المضي قدما لتؤتي ثمارها.

إعداد الخلايا لمدة التنبيغ هو جزء واحد من البروتوكول الذي هو الأكثر صعوبة للتحضير ل. بناء على نمو الخلايا، 2 × 05 حتي 05 أكتوبر × 10 5 خلايا واقترح لالتنبيغ وهذا قد تعتمد على عينات المريض محددة. ولذلك قد يتطلب بضعة آبار مطلي مع اختلاف أعداد الخلايا للحصول على العدد المثالي.

ويحدد هذا البروتوكول ليس فقط سهولة أخذ العينات، ولكن أيضا السهولة النسبية والجداول الزمنية لإنشاء مزارع الخلايا الأولية، وإعادة برمجة لاحقة من هذه الثقافات الخلية الأولية لخطوط التوجيهية للفرص البحث أكثر استدامة وتنوعا. كاملعملية من عيادة إلى إنشاء iPSCs منفصلة في الثقافة يستغرق حوالي 3 أشهر، ويتم تطوير طرق جديدة لتقصير أوقات برمجة 6،34،35. وهذا المجال يتطور بسرعة لإيجاد طرق أكثر كفاءة وكاملة لتحويل الخلايا الأولية لiPSCs، والتفريق في وقت لاحق iPSCs إلى أنواع الخلايا والأنسجة محددة من الفائدة. ومع ذلك، بروتوكولات التمايز لأنسجة الهامة لمرض الشعب الهوائية، مثل ظهارة الرئة، والعمل ما زال جاريا 36-38.

توليد iPSCs من NECS لديه ميزة من العزلة بسيطة وغير مؤلمة نسبيا من الخلايا. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن NEC-iPSCs تقديم مزايا أكثر iPSCs المستمدة من أنواع الأنسجة الأخرى التي يمكن استغلالها. لا يفهم تأثير علم التخلق التوجيهية على التفرقة التوجيهية لاحق تماما، على الرغم من أن الأدلة تشير إلى أن الفأر والإنسان iPSCs تؤوي ذاكرة النسخي وجينية من خلايا جسدية بهم منالأصل وأن هذا تفضل انتقائي التمايز بهم في الأنساب المرتبطة نوع من الخلايا المانحة بينما تقيد مصائر أخرى 5،26. نظرا لأهمية النسيج الأصلي، وكيف أن هذا يؤثر على الخصائص الفنية للiPSCs، وخاصة فيما يتعلق بالإبقاء على علامات جينية الأنسجة محددة 39-45، خطوط التوجيهية تحتاج إلى دراسة أكثر وضوحا من أجل فهم أفضل لل تأثير الأنسجة الأصلية. وقد سبق يتبين أن iPSCs المستمدة NEC-تؤوي توقيع مثيلة الجيني مشيرا إلى الإبقاء على ذاكرة جينية من أنسجتهم من أصل 23. هذه الذاكرة جينية الاحتفاظ بها في NEC-iPSCs قد يكون مفيدا في تمايز الخلايا الجذعية المحفزة في خلايا الشعب الهوائية، حيث أظهرت الدراسات السابقة أن iPSCs خلايا الدم المستمدة معرض ذاكرة جينية من خلايا الدم من أصل تتمايز بسهولة أكبر إلى خلايا الدم من الخلايا الليفية أو سلسة iPSCs مأخوذة من العضلات التي تفتقر إلى الدم ..د خلية محددة 5،26 ذاكرة جينية. وبالنظر إلى الإمكانات الهائلة لخلايا الشعب الهوائية المستمدة التوجيهية لأمراض الرئة النمذجة، فإنه سيكون من المهم دراسة ما إذا NECS تمثل نوع من الخلايا الأمثل لتمايز iPSCs في مجرى الهواء الخلايا / الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الذاكرة حافظت بثبات قد تمثل مواقع الكروموسومات مقاومة للبرمجة والمرشحين للالحالات المرضية من الخلايا المانحة. بروتوكولات لتحويل iPSCs إلى الداني ويتم تطوير أنواع الخلايا في الرئة البعيدة 36-38، قد تكون هذه NEC-iPSCs لديها ميزة في الأمراض النمذجة الهوائية مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن والتليف الكيسي، وغيرها الكثير وفي دراسة الآثار البيئية على نمو الرئة والتوازن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أنوه المحفزة مرفق الخلايا الجذعية والتصوير الأساسية متحد البؤر في مستشفى سينسيناتي للأطفال. وأيد هذا العمل من قبل R21AI119236 (HJ)، R21AI101375 (HJ)، المعاهد الوطنية للصحة / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ)، U19 AI070412 (HJ) و2U19AI70235 (GKKH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250 ml disposable filter flask (0.22 µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200 mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1 mM
55 mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1 mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4 ng/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10, (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29, (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7, (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28, (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7, (8), e42855 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10, (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322, (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26, (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8, (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164, (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6, (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91, (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5, (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30, (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127, (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129, (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41, (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135, (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115, (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7, (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29, (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34, (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13, (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122, (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17, (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2, (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8, (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30, (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4, (9), e7076 (2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20, (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5, (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9, (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75, (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13, (5), 541-549 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics