Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l'apoptosi omeostasi

Developmental Biology
 

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Bozec, A., Hannemann, N. Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis. J. Vis. Exp. (112), e53822, doi:10.3791/53822 (2016).

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Abstract

Introduction

Secondo il rapporto 2014 dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, il 39% della popolazione adulta del mondo è in sovrappeso, e il 13% è obeso 1. Nel prossimo futuro, le persone in sovrappeso comprenderanno una quota significativa della popolazione anziana. Una caratteristica importante di obesità e l'invecchiamento è disregolazione del grasso in relazione alla morbilità e mortalità 2. Adipochine, proteine ​​secrete dal tessuto adiposo (AT), possono innescare le sindromi metaboliche come l'obesità e il diabete di tipo 2 3. Malattie metaboliche sono principalmente causati da eccessivo accumulo di energia nelle goccioline lipidiche di adipociti, che si traduce in AT espansione 4. E 'quindi di interesse per determinare le cause ed i meccanismi molecolari di espansione AT, al fine di trovare opportunità per controllarlo.

Over-nutrizione porta ad espansione AT, che è regolata da due eventi: lo stoccaggio eccessivo di energia nelle gocce lipidiche di adipociti, un processoportando ipertrofia (aumento delle dimensioni degli adipociti), e aumento adipogenesis, noto anche come iperplasia adipocita 5. Adipogenesi è un processo di differenziazione delle cellule multipotenti mesenchimali staminali (MSC) in adipociti. In primo luogo, MSC sviluppano in preadipociti durante la fase di impegno. In secondo luogo, preadipocytes ulteriormente differenziano per acquisire le caratteristiche di adipociti maturi e funzionali 6. Diversi fattori di trascrizione sono stati identificati come maestri regolatori per la determinazione preadipocyte, come la proteina zinc finger 423 (Zfp423) e fattore di cella precoce B 1 (Ebf1). Mentre Zfp423 induce impegno precoce, Ebf1 è necessario per la generazione di progenitori degli adipociti 6. Differenziazione terminale è strettamente controllata da una cascata trascrizionale, per cui perossisomi γ del recettore proliferator-activated (PPAR) è il fattore di trascrizione essenziale 7. Ulteriori fattori trascrizionali chiave sono l'/ proteine ​​enhancer-binding CCAAT (C/ EBP) i membri della famiglia (ad esempio, C / EBPα, C / EBPβ, e C / EBPδ), fattori Kruppel-like (KLFs), cAMP elemento sensibile binding protein (CREB) e di risposta rapida crescita 20 (Krox20) 6.

Recentemente, è stato dimostrato che la proteina-1 (AP-1) famiglia attivatore è coinvolto nel processo di differenziazione degli adipociti 8,9. La famiglia AP-1 è costituito da un complesso proteico dimerica, composto Fos, Jun e / o l'attivazione del fattore di trascrizione (ATF) membri. Fos-correlate antigene 1 e 2 (Fra-1 e Fra-2) sono in grado di regolare la differenziazione degli adipociti. Fra-1 altera differenziazione degli adipociti inibendo C / EBPα 8, mentre Fra-2 controlli adipociti fatturato 9. Fra-2 in tal modo non si riduce solo il numero degli adipociti reprimendo espressione PPARγ2 durante la differenziazione degli adipociti, ma diminuisce anche adipociti apoptosi attraverso la repressione diretta dei fattori ipossia-inducibile (HIF) espressione. La famiglia HIF è un heterodimeric complesso fattore di trascrizione, composto da HIF-1α, HIF-2α e HIF-1β. I eterodimeri sono costituiti da una proteina di ossigeno-sensibili HIF-α (HIF-1α o HIF-2α) e l'HIF-1β subunità ossigeno-insensitive 10. Durante normoxia, proteine ​​HIF-α sono poli-ubiquitinylated e sono finalmente degradati da proteasomi 11. In condizioni di ipossia, si verificano in corso di espansione, proteine ​​HIF-α non sono più idrossilato. Essi hanno quindi diventano dimeri stabilizzati e forma con l'HIF-1β costitutivamente espresso. Attivazione trascrizionale di geni controllati dagli elementi di risposta HIF è coinvolto nella regolazione dell'angiogenesi, il metabolismo, e l'infiammazione 12. Infatti, HIF-1α promuove AT disfunzione inducendo tolleranza al glucosio, inibendo dispendio energetico e l'utilizzo periferico lipidi, nonché aumentando livello leptina e HFD indotta steatosi epatica 13. Inoltre, HIF-1α regola adipocyte apoptosi in vivo e in vitro 9.

Il presente Protocollo descrive i metodi per lo studio in uno stato di svelare le caratteristiche molecolari di adipociti omeostasi in topi adulti. Essa mostra come l'apoptosi, la proliferazione e la differenziazione di adipociti in vivo e in vitro possono essere regolate da ipossia. Per fare ciò, usiamo topi con adipociti specifico delezione di Fra-2 generato incrociando topi che trasportano i Fra-2 alleli floxed con i topi FABP4-CreERT 9. Utilizzando topi FABP4-Cre ERT, l'eliminazione è adipociti specifica e inducibile per iniezione tamoxifene 14. Per il modello per adulti, intra iniezioni peritoneali di tamoxifene sono eseguite in 5 giorni consecutivi a partire all'età di 6 settimane. Così, i topi sono sottoposti ad una dieta ricca di grassi o normale dieta per 6 settimane prima dell'analisi è fatto. I topi utilizzati in questo studio sono stati maschio basano su uno sfondo C57Bl6 evitare ormoni femminili, quali estrogeni, Mostrato per regolare la distribuzione del grasso corporeo 15. Utilizzando un altro background genetico potrebbe anche alterare il fenotipo metabolico, a causa delle differenze di deformazione connessi nella gestione dei lipidi 16.

Questo protocollo dimostra come analizzare al di sotto ipossia con istologia e come quantificare l'apoptosi degli adipociti, proliferazione e la differenziazione in vivo utilizzando immunoistochimica e analisi del gene profiling. Lo studio è completato da esperimenti in vitro, che mostra come analizzare differenziazione degli adipociti primaria e l'apoptosi alterato da esposizione a ipossia.

Protocol

ETICA DICHIARAZIONE: gli animali vivono in condizioni standardizzate seguendo le linee guida della Animal Welfare Act tedesca. Gli animali vengono alimentati con una dieta e acqua ad libitum di serie e tenute con un ciclo giorno / notte 12 ore. Tutti gli esperimenti con gli animali sono autorizzati dal comitato etico locale.

1. In Analysis Vivo di adipociti omeostasi nei maschi adulti

  1. Per quantificare ipossia in vivo, prima di determinare il peso corporeo dei topi, poi iniettare 60 mg / kg di peso corporeo di pimonidazole solido cloridrato intra-peritoneally (ad esempio: iniettare 1,5 mg in 25 g mouse). Pimonidazole è un marcatore ipossico efficace, che forma addotti con gruppi tiolici delle proteine, peptidi e aminoacidi e viene rilevata da un anticorpo specifico.
  2. Sacrificio topi e rimuovere i cuscinetti adiposi perigonadal (Figura 1).
    1. 45 minuti dopo l'iniezione, sacrificare i topi da CO 2 asfissia e la successiva dislocazione cervicale. </ Li>
    2. Pin le arti di topi (come illustrato in figura 1) e aprire la cavità peritoneale. Rimuovere la sinistra e il perigonadal pad (dell'epididimo) grasso proprio all'interno della cavità peritoneale.
      Nota: pad grasso sono tenuti a epididimo di volantini peritoneali, come mostrato nella Figura 1 (perigonadal cuscinetti adiposi sono indicati da frecce).
    3. Fare attenzione a rimuovere i tessuti gonadici dal cuscinetto adiposo. Determinare pesi cuscinetto adiposo per calcolare il rapporto: peso grasso pad (g) per peso corporeo (g).

Figura 1
Figura 1: Posizione dei cuscinetti adiposi perigonadal nella cavità peritoneale di topi. Immagine di perigonadal localizzazione del grasso nei topi adulti dopo il sacrificio. Cuscinetti di grasso Perigonadal sono indicati dalle frecce. Clicca qui per view una versione più grande di questa figura.

  1. Per compilare un profilo quantitativa di espressione genica, utilizzare uno cuscinetto adiposo perigonadal per isolare l'RNA. Nota: Finché il tessuto viene elaborato, conservare i campioni di tessuto in soluzione stabilizzazione RNA a -80 ° C o in azoto liquido.
    1. Per omogeneizzare il cuscinetto di grasso, aggiungere il cuscinetto di grasso a 1 ml di soluzione monofase di guanidina isotiocianato e fenolo. Utilizzare provette contenenti sfere di ceramica (1,4 mm) per schiacciare il tessuto in un omogeneizzatore a 6.500 giri (2 volte 20 sec, con 30 sec di pausa).
    2. Isolare l'RNA come segue (metodo single-passo per Chomczynski e Sacchi 17).
      1. Per separare le fasi, trasferire cuscinetto adiposo omogeneizzato alla provetta, aggiungere 0,2 ml di volume di cloroformio, agitare per 15 sec, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e centrifugare 12.000 xg per 5 min. Trasferire la fase acquosa superiore (circa 400 ml), contenente l'RNA, in una nuova provetta. Non includere il DNA-contenerezione interfase o fase fenolo proteici.
      2. Per precipitare l'RNA, aggiungere 1 volume di isopropanolo, miscelare e incubare per 15 min a 4 ° C (è anche possibile incubare a -20 ° C durante la notte). Centrifugare a 12.000 xg per 10 min. Rimuovere accuratamente isopropanolo surnatante. Lavare due volte con etanolo al 75% con passi centrifuga di 12.000 xg per 10 min.
      3. Dopo essiccamento il RNA precipitato per circa 10 min a temperatura ambiente, scioglierlo in 50 ml di H 2 O (RNase-free). Per facilitare ciò, incubare per 2 minuti a 65 ° C.
        Nota: Tenere RNA nel 75% di etanolo a -80 ° C o in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
      4. Quantificare i preparativi di RNA da A 260/280 (quoziente ottimale è compresa tra 1,8 e 2,2) e calcolare la concentrazione di A 260:
        Equazione 1
    3. Per evitare la contaminazione del DNA, digerire 1 ug del preparato RNAcon 1 U DNasi I per 30 minuti a 37 ° C in un volume di 10 microlitri. Inattivare a 65 ° C per 10 min.
      Nota: Questo passaggio è facoltativo.
    4. Utilizzare 10 ml di preparazione di RNA contenente 1 mg di RNA per la reazione trascrittasi inversa per generare cDNA a singolo filamento, adatto per l'applicazione quantitativa PCR. I componenti e le loro quantità sono elencati nella Tabella 1.
    5. Utilizzare una PCR Master Mix per un real-time PCR quantitativa reazione. Per determinare alterazioni metaboliche tutta cuscinetto adiposo, utilizzare primers specifici per i geni coinvolti nella omeostasi AT (Tabella 2) e le condizioni di PCR elencati nella tabella 3.
    6. Real-time PCR analisi dei dati.
      1. Definire la linea di base (figura 2), normalmente ciclo 1 a 15, dove non vi è alcun cambiamento nei segnali di fluorescenza. Il software real-time PCR normalizza segnali di fluorescenza specifiche per la fluorescenza basale e alla tintura di riferimento interno, ROX, con conseguentela grandezza dei segnali specifici primer, delta Rn (ΔRn).
      2. Impostare la soglia nella fase esponenziale della curva di amplificazione. L'intersezione definisce il ciclo soglia (Ct). Sulla base del valore CT, calcolare l'espressione relativa (ΔCt) e la variazione volte (ΔΔCt):
        Equazione 1
        Equazione 1
Componente Volume ml / reazione
10x RT Buffer 2.0
25x dNTP Mix (100 mm) 0.8
10x RT Random Primers 2.0
MultiScribe trascrittasi inversa 1.0
H priva di nucleasi 2 O 4.2
1 mcgRNA 10
reazione totale per 20

Tabella 1: Componenti con rispettivo volume per la reazione trascrittasi inversa per generare cDNA a singolo filamento.

Nome ufficiale completo Simbolo Sequenza 3'-> 5'
Inoltrare Inverso
adipogenesi Delta-simile 1 omologo (pref-1) Dlk1 GACACTCGAAGCTCA
CCTGG
GGAAGGCTGGGACGG
GAAAT
fattore di cella precoce B 1 Ebf1 CCACCATCGACTACGG
CTTC
TCCTGGTTGTTGTGGGG
CATC
Zinc finger proteina 423 Zfp423 GTGCCCAGGAAGAAGA
CGTA
GGCGACGTGGATCTGA
ATCT
acido grasso binding protein 4 (Ap2) FABP4 TCACCTGGAAGACAGCT
CCTC
AAGCCCACTCCCACTTC
TTTC
CCAAT / binding enhancer proteine ​​(C / EBP), alfa CEBPA AAGAGCCGCGACA
AGGC
GTCAGCTCCAGCACCT
tgtg
CCAAT / binding enhancer proteine ​​(C / EBP), beta CEBPB TTTCGGGACTTGATGC
AATC
CCGCAGGAACATCTTT
AAGG
cAMP elemento reattivo proteina di legame 1 CREB1 ACTCAGCCGGGTACT
ACCAT
TTGCTGCCTCCCTGTT
CTTC
CCAAT / binding enhancer proteine ​​(C / EBP), Delta Cebpd CAGCGCCTACATTGAC
TCCA
GTTGAAGAGGTCGGCG
AAGA
Kruppel-like factor 4 Klf4 GCAGTCACAAGTCCCC
TCTC TAGTCACAAGTGTGGG
TGGC
risposta di crescita in anticipo 2 (Krox20) EGR2 AGGCGGTAGACAAAATC
CCAG
GATACGGGAGATCCAG
GGGT
Proliferazione dei perossisomi recettore gamma attivato Pparg AGAGGTCCACAGAGCTG
ATTC
GATGCACTGCCTATGAGC
ACTT
lipogenesi Acetil-coenzima A alpha carbossilasi Acaca TGGGGACCTTGTCTTCA
TCAT
ATGGGCGGAATGGTCTC
TTTC
Grassi sintasi acido fASN ACATCCTAGGCATCC
GAGA
CCGAGTTGAGCTGGGT
TAGG
Stearoyl-coenzima A desaturasi 1 scd1 CGGGATTGAATGTTCTTG
TCGT
TTCTTGCGATACACTCTG
GTGC
lipolisi containi dominio fosfolipasi Patatin simileng 2 PNPLA2 AAGGACCTGATGACCA
CCCT
CCAACAAGCGGATGGT
Gaag
Fatty assorbimento di acido lipoproteina lipasi LPL GTATCGGGCCCAGCAA
CATTATCC
GCCTTGCTGGGGTTTTC
TTCATTC
CD36 antigene CD36 GTCTTCCCAATAAGCATGT
CTCC
ATGGGCTGTGATCGGA
ACTG
ipossia L'ipossia fattore inducibile 1, subunità alfa Hif1a CCTGCACTGAATCAAGAG
GTGC
CCATCAGAAGGACTTGCT
ggct
Endoteliale PAS dominio proteina 1 (noto anche come: HIF-2alpha) EPAS1 CAAGCTGAAGCTAAAG
CGGC
TTGGGTGAATTCATCG
GGGG
Von Hippel-Lindau soppressore del tumore VHL ACCGAGGTCATCTTTG
GCTC
TTCCGCACACTTGGGT
AGTC
recettore idrocarburi arile traslocatore nucleare (noto anche come: HIF-1 beta) Arnt TGGGTCATCTTCTCGC
GGTT
TGTCCTATCTGAGCAT
CGTG

Tabella 2: Elenco dei geni con sequenza dei rispettivi primer utilizzati per l'analisi degli adipociti omeostasi.

Passo Temperatura (° C) Tempo (min: sec)
attivazione della polimerasi tenere 95 10:00
PCR 40 cicli Denaturize 95 00:15
Ricottura / estensione 60 01:00
curva di fusione 60 al 95 0,5 ° C / sec

Tabella 3: in tempo reale le condizioni di PCR.

figura 2
Figura 2:. Caratteristiche in tempo reale curva di amplificazione PCR Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Per eseguire l'analisi istologica della omeostasi adipociti, utilizzare il secondo cuscinetto adiposo perigonadal. Non essiccare il tessuto!
    1. Fissare il cuscinetto adiposo nel 3,7% di formaldeide PBS-tamponata durante la notte, incorporare in paraffina (seguire le istruzioni come descritto altrove 18) e tagliare il tessuto incorporato in 2-5 micron sezioni spesse (massimo 5 micron).
    2. Determinare il numero di adipociti per campo e la dimensione degli adipociti in un microscopio in campo chiaro dopo ematossilina e eosina (H & E) colorazione: <ol>
    3. Deparaffinare sezioni lavando 3 volte per 5 min in xilene e reidratare la sezione 2 volte per 2 minuti in 100% di etanolo e 2 volte per 2 min a 96% di etanolo. Infine, lavare la sezione in H 2 O distillata O per 5 min.
    4. Colorazione con ematossilina, diluito 1: 5 con H 2 O distillata O, per 10 min a temperatura ambiente e lavata in H 2 O per 5 min. Stain con soluzione eosina (20 ml 5% eosina Y / 210 ml distillata H 2 O / 25 ml di acido acetico glaciale) per 30 sec e sciacquare con H 2 O per 5 min.
    5. Disidratare sezioni utilizzando 96% di etanolo e 100% etanolo 2 volte ciascuno per 2 min, e xilene 3 volte per 5 min. Montare le sezioni con l'agente di montaggio anidro.
    6. Valutare sezioni al microscopio in campo chiaro. Un esempio rappresentativo di come analizzare adipociti con ImageJ 1.48v 19 è mostrato in Fig. 3: numero di cellule per area (micron 2), area della cella (x 10 3 micron 2
    7. Aprire l'immagine della sezione con ImageJ 1.48v. Se i parametri dell'immagine sono indicati in pixel invece di una unità di lunghezza, regolare la scala.
    8. Selezionare * Retta * nella barra degli strumenti e regolare la linea per una distanza nota con riferimento alla barra della scala. Vai a Analizza -> Set Scala La distanza della linea è mostrata in pixel;. aggiungere la distanza nota e l'unità di lunghezza, ad esempio, micron. Confermare con OK. La dimensione dell'immagine e l'analisi dei parametri sono indicati nella unità di lunghezza determinata.
    9. Per determinare i parametri degli adipociti, regolare la soglia. Vai a Immagine -> Regola -> Soglia per aprire la finestra di soglia. Selezionare le seguenti impostazioni: Metodo Thresholding: default; colore Soglia: B & W; Spazio colore: HSB. L'immagine viene ora visualizzato in bianco e nero. Aggiusta ilLuminosità per cancellare adipociti bianchi e per chiudere gli spazi intercellulari neri, come in Fig. 3b.
    10. Contare il numero di adipociti ogni micron 2 (figura 3e) con il multi-point * * selezione nella barra degli strumenti e segnare ogni cella per il conteggio.
    11. Per determinare la dimensione degli adipociti, selezionare * * Retta di nuovo nella barra degli strumenti e disegnare il diametro di un adipociti (Figura 3c). Va ad analizzare -> appariranno Misurare e una nuova finestra, con la lunghezza del diametro in micron.
    12. Per determinare l'area degli adipociti, selezionare * Wand (tracing) strumento * e fare clic all'interno degli adipociti. La parete interna del adipocita è selezionato in rosso (figura 3d). Vai a Analizza -> appariranno Misurare e una nuova finestra, con l'area di questo adipociti in micron 2.
  • per immunohistochemistry, prepara la sezione per l'anticorpo e la TdT-mediated dUTP-biotina nick etichettatura fine (TUNEL) colorazione come segue:
    1. Deparaffinare sezioni lavando 3 volte per 5 min in xilene e reidratare la sezione 2 volte per 2 minuti in 100% di etanolo e 2 volte per 2 min a 96% di etanolo. Infine, lavare la sezione distillata H 2 O.
    2. Per recupero dell'antigene, digerire la sezione di tessuto per 30 minuti a 37 ° C con proteinasi K soluzione di lavoro (20 ug / ml in 10 mM Tris / HCl, pH 7,4-8) e risciacquare con PBS.
  • Eseguire colorazione anticorpi in camere umide:
    1. Per bloccare la perossidasi endogena, utilizzare il perossido di idrogeno al 3% in PBS per 10 minuti, con successiva lava 2 volte per 5 minuti in PBS. Per bloccare il legame non specifico degli anticorpi, utilizzare il 10% di siero in PBS. Utilizzare il siero dell'host dell'anticorpo secondario, in questo caso capra.
    2. Per la colorazione, utilizzare gli anticorpi per l'apoptosi, la proliferazione e la rilevazione ipossia (
    3. Per migliorare il segnale utilizza un anticorpo secondario biotinilato, con la diluizione come elencato nella Tabella 5. Per il rilevamento ipossia, utilizzare HRP coniugato coniglio anti-FITC come anticorpo secondario. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 2 volte 5 min con PBS.
      Nota: Per la colorazione ipossia con FITC-MAb1, saltare il passaggio 1.4.4.4) e continuare con il passo 1.4.4.5).
    4. Per ciascun vetrino, pre-incubare 50 microlitri soluzione avidina con 50 microlitri biotinilati perossidasi H per 30 minuti a temperatura ambiente (questo metodo è anche indicato come avidina / biotina ABC complessa formulazione) e quindi aggiungere alle sezioni per altri 45 min. Lavare 2 volte per 5 minuti con PBS.
    5. Incubare le sezioni in soluzione substrato della perossidasi finché la colorazione diventa più intenso (tra 5 e 10 min). Lavare per 5 minuti con acqua distillataH 2 O.
    6. Per di contrasto, macchia con ematossilina diluito 1: 5 con H 2 O distillata O per 10 min a temperatura ambiente e lavata in H 2 O per 5 min.
    7. Disidratare sezioni in 96% di etanolo e 100% etanolo 2 volte ciascuno per 2 min, e xilene 3 volte per 5 min. Sigillare le sezioni con vetrini e anidro agente di montaggio. Valutare sezioni al microscopio in campo chiaro.
  • Determinare l'apoptosi mediante saggio TUNEL e seguire le istruzioni del produttore:
    1. Aggiungere soluzione enzimatica 50 ml in 450 ml soluzione di etichetta. Quindi applicare 50 microlitri miscela di reazione TUNEL su sezioni istologiche e incubare per 60 min a +37 ° C in atmosfera umidificata al buio. Lavare le sezioni 3 volte con PBS per 5 minuti e montare con mezzo di montaggio di fluorescenza tra cui DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) per di contrasto.
    2. Valutare la sezione sotto un microscopio a fluorescenza con 100 magnificat volte ionico. Per la misura di fluoresceina utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e rilevare tra 515-565 nm (laser verde); DAPI eccita a circa 360 nm ed emette a circa 460 nm quando si lega al DNA (laser blu).
    3. Quantificare le sovrapposizioni di DAPI e fluoresceina:
      Equazione 1
  • Figura 3
    Figura 3:. Analizzando le caratteristiche degli adipociti in sezioni cuscinetto adiposo immagini sezione del cuscinetto adiposo perigonadal di topi maschi trattati con una dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) o dieta normale (ND) con un microscopio in campo chiaro (a); la soglia viene regolata in bianco e nero (B) e la dimensione degli adipociti (lunghezza, c), zona (D) e il numero di cellulare degli adipociti per mm 2 (e) sono quantificati con ImageJ 1.48v.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    la concentrazione della diluizione
    L'apoptosi Spaccati caspasi-3 (Asp175) (5A1E) Coniglio mAb 1: 2.000
    Proliferazione Ki-67 purificato Mouse Anti-Human Clone B56 (RUO) 01:50
    ipossia HIF-1 alfa anticorpo 1: 100
    FITC-MAb1 1: 100

    Tabella 4: Anticorpi con rispettiva diluizione utilizzato per la colorazione immunoistochimica di sezioni AT.

    Anticorpo diluizione
    contro biotinilatoMouse IgG (H + L) 1: 200
    biotinilato IgG topo anti (H + L) 1: 200
    HRP coniuga coniglio anti-FITC 1: 100

    Tabella 5: anticorpi secondari con diluizione utilizzate per la colorazione immunoistochimica.

    2. L'analisi in vitro di adipociti omeostasi influenzato da ipossia

    1. Sacrificio topi e rimuovere il tessuto adiposo sottocutaneo.
      1. Sacrificare i topi da CO 2 asfissia e la successiva dislocazione cervicale.
      2. Pin le arti di topi come illustrato nella figura 4. Staccare la pelle dalla coscia, lombo e fianchi con pin giù con aghi come in figura 4. Quindi rimuovere il tessuto adiposo sottocutaneo, che si trova posteriormente alla base della zampe posteriori, che circondano i linfonodi inguinali (come mostrato in figura 4, a sinistra: cuscinetto adiposo sottocutaneos indicata dalle frecce; destra: linfonodo inguinale indicato dalla freccia).

    Figura 4
    Figura 4: Posizione delle cuscinetti di grasso sottocutaneo. Immagine di cuscinetto adiposo sottocutaneo; le frecce a sinistra indicano il cuscinetto adiposo sottocutaneo e la freccia a destra indica il linfonodo inguinale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    1. Isolare le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSC) come precedentemente descritto 20.
    2. Seed ADSC 4.000 cellule / cm 2 a Dulbecco di modificati Eagle medium-Ham F-12 supplementato con 10% di siero normale di vitello, 1% di penicillina / streptomicina, 0,5% amfotericina B, 16 micron biotina, 18 mM acido pantotenico e 100 di acido micron ascorbico e far crescere la cultura di confluenza intorno 70-80%, Che si raggiunge dopo 4 a 6 giorni di coltura.
    3. Indurre adipogenico differenziazione.
      1. Rimuovere il ADSC aderenti dalla superficie dalla tripsina trattamento.
        1. Rimuovere medie, lavare con PBS e aggiungere soluzione di tripsina 0,025% (preriscaldata a 37 ° C) per 2 min (fino cellule staccano dalla superficie). Immediatamente aggiungere medie e lavare le cellule.
      2. Contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer.
        1. Mettere il coperchio di vetro nella zona centrale della camera Neubauer. Diluire la sospensione cellulare 1:10 a caricare la camera con 10 microlitri diluiti sospensione cellulare. Contare le cellule in 4 quadrati situati agli angoli, ognuno composto da 16 quadrati più piccoli. Calcolare il numero di cellule per ml:
          Equazione 1
      3. ADSC semi (come descritto al punto 2.2) in piastre di coltura da 12 pozzetti e far crescere la cultura di confluenza circa il 70 al 80% (raggiunta dopo 4 a 6 giorni).
      4. indurre adipogedifferenziazione nic con l'aggiunta di 5 mg / ml di insulina, 1 micron desametasone e 5 micron 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) alle culture. Rinnovare la media ogni 2 giorni. Le cellule saranno completamente differenziati dopo 7 giorni.
    4. Per analizzare la differenziazione adipogenico, macchia con Oil Red O, che colora i trigliceridi di adipociti maturi.
      Nota: Il lavoro deve essere effettuata sotto una cappa aspirante!
      1. Rimuovere il supporto, lavare delicatamente gli adipociti con PBS e fissare le cellule per 60 minuti con 2 ml di formalina al 10%.
      2. Per preparare la soluzione di colorazione Oil Red O, mescolare 3 parti della soluzione Red Oil O stock (300 mg polvere Red Oil O sciolti in 100 ml di 99% isopropanolo) con 2 parti distillata H 2 O e incubare per 10 min a temperatura ambiente. Filtrare la soluzione di lavoro Oil Red O attraverso un filtro di iniezione 0,2 micron.
        Nota: La soluzione di lavoro è stabile per 2 ore.
      3. Per la colorazione Oil Red O, rimuovere la formalina, lavare adipociti con H 2
      4. Valutare le piastre al microscopio a contrasto di fase con 100 ingrandimenti volte. I lipidi degli adipociti appariranno rosso e nuclei apparirà blu.
    5. Passaggio facoltativo: il silenzio il gene di interesse da trasfezione con shRNA.
      1. Cambiare il medio e aggiungete mezzo privo di siero.
      2. Per la trasfezione degli adipociti, usare lipofezione. Seguire le istruzioni del produttore e utilizzare 1 mg shRNA per piastre di tessuto da 12 pozzetti. Dopo l'aggiunta del lipide-DNA-complesso, incubare adipociti per 48 ore a 37 ° C.
    6. Per analizzare adipociti sottoposti a ipossia, utilizzare una stazione di lavoro ipossico o incubatore ipossico per mantenere le cellule in condizioni di ipossia. A seconda dello studio, ipossia could essere 0,5, 1 o 2% di ossigeno.
      1. Analizzare l'apoptosi da coniugati con fluoresceina annessina V e il successivo flusso di analisi di citometria.
        1. Raccogliere adipociti con un raschietto cellulare extra morbido, lavare con PBS e aggiungere 1 x 10 6 cellule per 100 ml di buffer annessina V vincolante (10 mM Hepes / NaOH, pH 7.4; 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl 2). Aggiungere la quantità di Annessina V-FITC raccomandato dal fabbricante e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
        2. Per citometria a flusso di misura, aggiungere 200 ml di buffer annessina V vincolante e 1 micron di di contrasto nucleare. Determinare la fluorescenza nel canale verde e viola. Cellule + / colorante di contrasto nucleare + annessina V sono definiti come necrotico secondaria e annessina V + / di contrasto nucleare - cellule sono definite come cellule apoptotiche (Figura 5).
      2. Quantitativamente analizzare il livello di RNA adipociti per determinare l'omeostasi in condizioni di ipossia.
        1. Aggiungere1 ml di soluzione monofase di guanidina isotiocianato e fenolo in ogni pozzetto e isolare l'RNA [utilizzando il metodo a singolo passo Chomczynski e Sacchi 17 (punto 1.3.2)] e procedere come nei passaggi 1.3.2.1) a 1.3.5.2) .

    Figura 5
    Figura 5: analisi apoptosi degli adipociti mediante citometria di flusso. Dot presentazioni Trama del FACS per annessina V-FITC e TO-PRO-3 colorazione degli adipociti. Fai clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Representative Results

    Mostriamo come determinare adipociti omeostasi in vivo e in vitro, utilizzando l'esempio di Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT rispetto al wild-type cucciolata. Il nostro protocollo definisce come una maggiore espressione di HIF da ipossia è correlata con una disfunzione degli adipociti, come indicato da un aumento della apoptosi degli adipociti.

    topi aumento delle dimensioni degli adipociti e la zona a dieta ricca di grassi (HFD) trattati

    Over-nutrizione, tra gli altri fattori, si traduce in adipociti ipertrofia, causata da un eccessivo accumulo di energia nelle goccioline lipidiche. La dimensione degli adipociti e la zona è un indicatore di ipertrofia. Le sezioni del cuscinetto adiposo da normale (ND, figura 6a) e dieta ricca di grassi (HFD, figura 6b) topi e quantificazioni della dimensione degli adipociti e la zona mostrano chiaramente l'ipertrofia degli adipociti dopo 6 settimanes di HFD, che è indicato da un aumento della dimensione degli adipociti nei topi trattati HFD (Figura 6c e d).

    L'aumento ipossia nel tessuto adiposo (AT) degli adulti Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT porta ad un aumento di livello di HIF-1α e adipociti apoptosi

    Per determinare lo stato in vivo di ipossia in AT, Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT vengono analizzati 6 settimane dopo Fra-2 delezione all'età di 12 settimane e confrontati con wild-type cucciolata. Pimonidazole viene somministrato a topi per via intraperitoneale come un marcatore ipossia efficace; non è tossico e in grado di distribuire in AT. Adipociti di ipossia in AT in vivo sono definiti dalla colorazione anticorpale immunoistochimica (Figura 7a). Inoltre, l'aumento dello stato ipossico della AT nei topi è accompagnata da un aumento di HIF-1α ADIP positivoocytes come indicato dalla colorazione immunoistochimica figura 7b), che viene confermato dalla quantificazione dei livelli di espressione di HIF-1α e suoi obiettivi geni 9. Inoltre, TUNEL colorazione di sezioni a da Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT e nidiata di controllo (Figura 7c) mostra che l'aumento degli adipociti apoptosi è correlata con la presenza di ipossia e di espressione di HIF-1α.

    L'aumento dell'espressione di HIF-1α in adipociti primari attraverso l'ipossia indotta l'apoptosi degli adipociti

    Per analizzare adipociti apoptosi in vitro, usiamo adipociti generati da cuscinetti di grasso sottocutaneo come descritto altrove 20. Come previsto, l'espressione di HIF-1α in adipociti aumenta dopo 24 ore di ipossia (figura 8a). Per analizzare ulteriormente le attività di HIF-1α, i livelli di RNA di destinazione HIFgeni, come Inos (inducibile ossido nitrico sintasi) sono quantificati per qPCR. Figura 8b mostra che l'aumentata espressione di HIF-1α in condizioni di ipossia porta ad aumento del livello di mRNA Inos. Dal momento che abbiamo già dimostrato in vivo (Figura 8), che ha aumentato l'espressione di HIF-1α in adipociti correla con un aumento dell'apoptosi degli adipociti, l'apoptosi è anche quantificato in colture in vitro per annessina V colorazione in condizioni di ipossia. In accordo con i dati in vivo (Figura 7), un aumento del livello di HIF-1α è accompagnato da un aumento della apoptosi degli adipociti indotta da condizioni di ipossia (figura 8b). Inoltre, per dimostrare che l'apoptosi ipossia indotta è HIF-dipendente; HIF-1α o HIF-2α è tacere da RNA interference in adipociti derivati ​​da wild-type o Fra-2 topi deficienti. L'aumento di apoptosi degli adipociti viene ripristinata mettendo a tacere HIF-1α o HIF-2α come mostrato da Annessina V colorazione in figura 8b, dimostrando che il sensore di ipossia HIF-α regola l'apoptosi degli adipociti.

    Figura 6
    Figura 6: Aumento della dimensione degli adipociti e la zona a dieta ricca di grassi topi (HFD) (a, b) H & E colorazione di sezioni del cuscinetto adiposo perigonadal di topi wild-type maschi alimentati con dieta normale (ND) (a) o alto. dieta -Fat (HFD) (b) per 6 settimane. Barre rappresentano 500 micron. (C, d) quantificazioni delle dimensioni degli adipociti (c) e l'area (d) del cuscinetto adiposo perigonadal di topi wild-type alimentati con ND (a) o HFD (b) per 6 settimane. n = 10. I dati sono riportati come valori medi ± SEM. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando dello studente t-test. *** P <0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 7
    Figura 7: Aumento del livello di HIF-1α e apoptosi negli adipociti di adulti Fra 2-FL / FL topi FABP4-CreERT. L'ipossia (a) e HIF-1α (b) colorazione in AT di Fra-2 fl / fl topi FABP4-creERT e controllo littermates maschi di 6 settimane dopo l'iniezione tamoxifene maschile. Ingrandimento 20X, 40X inserire. frecce nere indicano le aree ipossiche e cellule positive HIF-1α. (C) TUNEL in Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT e fratellini di controllo a 6 settimane dopo l'iniezione tamoxifene. Ingrandimento 20X, 40X inserire. frecce nere indicano cellule positive TUNEL. Questa cifra è stata modificata da Lutero etal. 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 8
    Figura 8:. L'aumento dell'espressione di HIF-1α e adipociti apoptosi in adipociti primari indotti da ipossia (a) Real-time PCR di HIF-1α e di destinazione HIF livelli Inos mRNA in adipociti primari sistemati in camere ipossiche analizzato nei punti di tempo indicato. (B) Quantificazione dell'apoptosi da annessina V FACS colorazione in adipociti primari isolati da Fra-2 fl / fl topi FABP4-CreERT o controlli wild-type trasfettate con controllo sh o sh plasmide contro HIF-1α o HIF-2α e posto sotto l'ipossia (1% O 2) per 24 ore. Questa cifra è stata modificata da Lutero et al. t-test di Student. * P <0.05 e ** P <0,01 sono stati accettati come significativo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Discussion

    Gli adipociti sono caratterizzati fenotipicamente per le loro dimensioni, numeri e zona, rivelando degli adipociti iperplasia e ipertrofia, indotta da stoccaggio eccessivo di energia a causa di un eccesso di nutrizione 5. Questi eventi portano alla disregolazione di acidi grassi e successive sindromi metaboliche sono afferma anche di un aumento della massa grassa con metabolismi conservati, che è indicato anche come l'espansione grasso "sano". Ad esempio, Kusminski et al. 21 hanno mostrato che i topi con espansione grasso massiccia rimangono metabolicamente sani, suggerendo che l'espansione grasso non è necessariamente legata sindromi metaboliche e deve essere attentamente determinata a valutare le caratteristiche degli adipociti. Il tessuto adiposo (AT) gioca un ruolo fondamentale nella regolazione del metabolismo del corpo. AT è il più grande organo endocrino che potrebbe influenzare la dislipidemia, l'aterosclerosi, l'iperinsulinemia e iperglicemia 3. Valutare AT omeostasi e la m molecolareECCANISMI regolano potrebbe consentire una migliore comprensione dei disturbi del sistema metabolici. Pertanto, svelare i meccanismi che regolano la differenziazione degli adipociti, le dimensioni degli adipociti e la massa cuscinetto adiposo aiuterebbero a sviluppare nuovi trattamenti terapeutici per i disturbi di obesità. Uso in vivo e metodi in vitro, è possibile determinare il ruolo degli impatti alimentari e di espressione genica sulla differenziazione e l'attività degli adipociti. Per determinare l'omeostasi AT, determinare l'equilibrio tra differenziazione degli adipociti, proliferazione e apoptosi come suggerito dal nostro protocollo è importante come analizzare il glucosio e insulina metabolica risposta 22-24.

    Profili di espressione analisi di geni coinvolti nella adipogenesi, lipogenesi, la lipolisi, l'assorbimento degli acidi grassi, ipossia, l'apoptosi e la proliferazione in adipociti primari e viscerale AT è un metodo di alto rendimento per ottenere una panoramica degli adipociti omeostasi e la loro possibile disfunzione.i candidati interessanti dovrebbero essere ulteriormente analizzati a livello proteico mediante western blot o colorazione immunohistological. Per ottenere risultati ottimali attraverso tempo reale sistema PCR utilizzando coloranti cianinici asimmetrici, le concentrazioni di cDNA da 1 a 10 ng di primer e le concentrazioni ottimali da 50 a 900 nm dovrebbero essere testati per minimizzare l'amplificazione non specifica. I componenti critici sono i primer; Per ciascuna prova, le curve di fusione devono essere controllati strettamente per garantire la specificità ed escludere la formazione di dimeri di primer. Pertanto, è consigliabile utilizzare un controllo negativo con H 2 O invece di cDNA. Inoltre, commerciali disponibili coloranti cianinici asimmetriche sono forniti come Master Mix contenenti un colorante di riferimento passivo (come ROX) per fornire un segnale di riferimento interno. Il segnale cDNA è normalizzata durante l'analisi dei dati ai segnali ROX per correggere le fluttuazioni del segnale ben-to-bene. Un altro punto da considerare al fine di stabilire un good sistema qPCR è la scelta del gene housekeeping. Per ogni condizione, diversi geni housekeeping vengono utilizzati, ad esempio, HPRT, β-actina, GAPDH, β-2-mg o HSP90.

    Proteine ​​HIF stabilizzati da condizioni di ipossia sono regolatori principali che determinano non solo adipociti sopravvivenza, ma anche cambiamenti metabolici, come il glucosio, la tolleranza di insulina e il metabolismo dei lipidi 11,25,26. Per accertare le aree ipossiche nel cuscinetto adiposo, HIF-1α è determinato in AT sezioni di immunoistochimica. Poiché le proteine ​​HIF si stanno rapidamente degradati entro 5 o 10 minuti in condizioni normossiche, la procedura e la fissazione del cuscinetto adiposo per l'analisi istologica devono essere strettamente controllati per evitare di tempo di latenza. Pertanto, per assicurare ipossia non solo attraverso HIF colorazione, pimonidazole viene utilizzato per determinare le aree ipossiche in AT. Pimonidazole è in grado di distribuire nei tessuti, come è stato già indicato in ossa 27, Ed effettivamente indicare le zone ipossiche legandosi alle proteine ​​contenente il tiolo specificatamente nelle cellule ipossiche, che viene ulteriormente rilevati in sezioni istologiche legandosi anticorpo specifico 28. Tuttavia, altri marcatori e metodi possono essere utilizzati per analizzare il percorso ipossia. Ad esempio, il coinvolgimento dell'enzima prolyl idrossilasi (PHD), che inducono idrossilazione dei residui di prolina sotto normoxia, così come la proteina di von Hippel-Lindau (VHL), che riconoscono proline idrossilati e indurre il poli-ubiquitinazione di mediare proteasomale HIF degradazione, devono essere analizzati per una panoramica completa del percorso 29,30. Inoltre, il rilevamento onnipresente di HIF potrebbe anche determinare la stabilità proteica e la degradazione che può essere alterare 31,32.

    Inoltre, proliferazione Ki67 e l'apoptosi da TUNEL sono determinati in vivo attraverso la colorazione di AT sezioni istologiche. La quantificazione della proliferazione da Ki67 e unpoptosis da TUNEL o annessina V colorazione attraverso citometria a flusso di analisi viene effettuata anche 33. Proliferazione potrebbe naturalmente essere misurata con altre tecniche come l'analisi del ciclo cellulare adipociti, che non viene affrontato dalla misurazione di cellule positive Ki67. Inoltre, lo studio apoptosi mediante TUNEL può essere completata mediante FACS analisi di annessina V e TOP-PR-3 che determinerà i livelli di necrosi rispetto al processo di morte cellulare apoptosi. L'apoptosi è un processo fondamentale per il programma di morte cellulare, che è importante per AT omeostasi. Infatti, disregolazione di adipociti apoptosi è stato implicato in precedenza nei processi che contribuiscono all'obesità e lipodistrofia 34. Inoltre, nel 2011, Keuper et al. Legato adiposo infiammazione dei tessuti di adipociti apoptosi. Essi hanno dimostrato che i macrofagi apoptosi indotta in preadipocytes e adipociti, che a loro volta attirano macrofagi. Il reclutamento di macrofagi accelera infiammazione, che contributes a sindromi metaboliche come glucosio e di insulina tolleranza 35. Tuttavia, adipociti l'apoptosi è un fenomeno ancora poco studiato, nonostante l'ipotesi che l'apoptosi indotta adipociti potrebbe portare ad una riduzione del peso.

    Il presente protocollo utilizza approcci immunoistochimica per studiare fenomeno diverso, come la proliferazione, l'apoptosi e ipossia in vivo. Pertanto, il tessuto è stato fissato con 4% di formaldeide, che è un passaggio critico. Un tempo di fissaggio del tessuto prolungato porta al cambiamento degli epitopi, che diventano non accessibili per l'anticorpo. Al contrario, un breve tempo di fissazione aumenta la sensibilità di epitopi ai reagenti. Il momento ottimale raccomandata di fissaggio è di 24 ore. Inoltre, lo spessore delle sezioni influenza anche gli anticorpi leganti ai loro epitopi; spessore ottimale è compreso tra 2 e 5 micron. Le sezioni più spesse di 5 micron darà risultati falsamente positivi a causa di un aumento dei siti di legame. Al contrario, sriflessioni più sottile di 2 micron contengono siti meno vincolante e le aree positive non sono ben definiti. Ulteriori fattori critici sono l'anticorpo stesso, tempo di incubazione, la concentrazione e la temperatura uniforme, che influenzano la qualità del legame con gli epitopi specifici. Pertanto, convalidando la concentrazione e l'incubazione tempo anticorpo è necessaria per ogni condizione.

    Per completare lo studio, mettiamo a disposizione in vitro adipociti protocollo di differenziazione, che potrebbe essere esteso per diversi trattamenti, la stimolazione o co-culture. Utilizzando nelle culture adipociti in vitro, è fattibile per determinare difetti di differenziazione degli adipociti e funzioni. Per ottenere risultati affidabili, come per tutte le celle primarie, il comportamento sano e l'aspetto delle ADSCs e adipociti è molto importante. La granularità, vacuolations e / o distacco citoplasmatici sono segni di deterioramento, che indica medio inadeguata, la contaminazione microbica o senescenza del primariocellule. Questo protocollo utilizza adipociti isolati dal tessuto cuscinetto adiposo, che è pure possibile utilizzare mesenchimali cellule staminali isolate dal midollo osseo come descritto da altri protocolli 36. L'ultima include cellule progenitrici stromali, che potrebbero riflettere problemi differenziazione supplementare che si verificano nella fase molto precoce di differenziazione degli adipociti, questo potrebbe essere perso nel nostro protocollo corrente. Inoltre, ADSCs possono essere espanse rapidamente (più di 10 volte entro una settimana), e ADSCs in coltura a lungo termine dopo alcuni passaggi ancora mantengono la loro pluripotenza mesenchimali 37,38. Un altro vantaggio utilizzando ADSCs è che si può facilmente passare a umano, dal momento che ADSCs possono essere raccolte da pazienti con la liposuzione, che è un metodo semplice e poco invasivo.

    Al influenza diversi altri organi in modo endocrino, il protocollo dovrebbe essere estesa a adipochine. Adipochine, come la leptina, adiponectina, fattore di necrosi tumorale-α (TNF) unND resistina, secreto dagli adipociti sono noti per influenzare malattie metaboliche controllando il metabolismo dei grassi, omeostasi energetica e la sensibilità all'insulina 39. Pertanto, siero e adipociti secretoma analisi dovrebbero essere effettuate. Nel caso di AT erettile, adipochine e citochine pro-infiammatorie come IL-6, può portare a disregolazione di organi quali il fegato e pancreas, e della funzione muscolare 4. Al fine di escludere disfunzione d'organo sistemica, modelli animali o colture cellulari potrebbero essere testati per la loro risposta al glucosio stimolazione e l'assorbimento.

    Qui forniamo un protocollo per analizzare lo stato di base della AT e adipociti in vivo e in vitro per rivelare meccanismi molecolari di adipociti omeostasi e funzionalità.

    Disclosures

    Gli autori non hanno nulla da rivelare.

    Acknowledgments

    Gli autori desiderano ringraziare il Dr. J. gentilmente Lutero e K. Ubieta per la preparazione dei dati e il dottor B. Grötsch per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RNAlater solution Ambion AM7021 RNA stabilization solution
    High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368813
    SYBR Select Master Mix 4472908
    Purified Mouse Anti-Human Ki-67 BD Biosciences 550609 Clone B56 (RUO)
    Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) 550609 Proliferation marker
    FITC Annexin V BioLegend 640906
    Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb Cell signalling 9664S Clone 5A1E
    Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 9664 Apoptosis marker
    Lipofectamine2000 Reagent  Invitrogen 11668-027
    TO-PRO-3 Iodide T3605 Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm
    Mayer’s hemalum Merck 109249 hematoxylin
    pegGOLD TriFast Peqlab 30-2030 TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol
    Percellys Ceramic Kit 1.4 mm 91-PCS-CK14 tubes containing ceramic beads (1.4 mm)
    Precellys 24 91-PCS24 homogenizer
    HIF-1 alpha Antibody Pierce PA1-16601
    HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 700505 Hypoxia marker
    In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein Roche 11 684 795 001 TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) 
    Eosin Sigma 318906
    DNase I Solution (1 unit/µl) Thermo Scientific EN0525
    biotinylated anti mouse IgG (H+L) Vector Laboratories BA-9200
    biotinylated anti mouse IgG (H+L) BA-1000
    Vectastain ABC Kit PK-4000
    VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI H-1200

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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